莲藕是我国生产面积最大、产量最高的水生蔬菜[1]，富含膳食纤维、多糖、维生素、矿物质等[2]，具有降血脂、降血糖、降低胆固醇等生物学功能[3]。莲藕渣是莲藕加工过程中的主要副产物，主要包括藕节、莲藕皮、榨汁后的藕渣，约占莲藕鲜重的30%[4]。由于现有工艺限制或生产链不完善等原因，导致其营养价值和资源效益未得到充分利用，特别是作为食品中膳食纤维的潜在来源[5]，如何开发高附加值产品具有重要的研究意义。
膳食纤维被称为第七大营养素，是指难以被人体酶消化的植物成分总称[6-7]。根据溶解性可分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）与不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）[8]。研究表明，膳食纤维的很多重要生理功能都与SDF 有很大的关系，与IDF 相比，SDF 具有更优良的吸附能力、抗氧化活性以及改善肠道菌群等[9]。但一般膳食纤维中SDF 含量都很低，只有3%～6%，无法达到膳食平衡要求[10]。因此众多学者采用物理法、化学法、酶法、微生物发酵法等[11]不同方法对膳食纤维进行改性，以达到提高SDF含量并发挥其生理功能的目的。其中，微生物发酵法优势比较突出，是一种绿色环保、安全性好、相对高效且低成本的手段[12]。
针对微生物发酵工艺优化主要采用正交试验、响应面法等，但发酵过程中各营养成分之间具有复杂非线性，传统方法在处理非线性问题时具有一定的局限性[13]。而人工神经网络是由线性或非线性传递函数高度互连的处理神经元组成[14]，能够实现加权和偏置的多元线性回归[15]，并结合遗传算法通过自然选择和遗传机制寻找最佳解决方案[16]。因此作为优于响应面（response surface methodology，RSM）的互补模型，人工神经网络-遗传算法（artificial neural networks and genetic algorithms，ANN-GA）耦合优化发酵条件的研究越来越受到学者关注。但目前国内关于RSM 和ANN-GA优化方法比较的研究较少。因此，本研究以藕渣为原料，副干酪乳杆菌PC18 为试验菌株，通过响应面试验、人工神经网络-遗传算法优化乳酸菌发酵改性的最佳工艺参数，并对两种优化方法进行比较，以期获得更高产量的可溶性膳食纤维。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
MRS 液体培养基：北京澳博星生物技术有限公司；莲藕、白砂糖：市售；副干酪乳酪杆菌（Lactobacillus paracasei）PC18 菌株：江苏省农业科学院农产品加工所食品生物工程实验室；氢氧化钠（分析纯）：西陇科学股份有限公司；乙醇、乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2-（N-吗啡啉）乙磺酸-三羟甲基氨基甲 烷[2-morpholinoethanesulphonic acid-tris（hydroxymethyl）aminomethane，MES-TRIS]、淀粉葡 萄 糖苷酶（105 U/mL）（均为生化试剂）：上海麦克林生化科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（生化试剂）：美国Genview 公司；热稳定α-淀粉酶溶液[（105±103）U/mL，生化试剂]：上海蓝季科技发展有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg，生化试剂）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
JJ500 型电子天平：常州市双节测试仪器厂；DSX-18L-I 手提式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；LRH-150 生化培养箱：上海恒科学仪器有限公司；HH-4S 数显恒温油浴锅：杭州保恒恒温技术有限公司；LXJIIB 低俗离心机：上海安亭科学仪器厂；DHG-9076A 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 藕渣粉末制备及发酵
将新鲜藕渣置于65 ℃电热恒温鼓风干燥箱烘干至恒重，烘干后藕渣粉碎处理，过100 目筛，过筛后藕渣粉末装密封袋保存，备用。
甘油保种管中取菌种于MRS 液体培养基中37 ℃培养24 h 活化2 次，以3% 接种量扩培至50 mL MRS液体培养基中37 ℃培养24 h。菌液于5 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，用0.85% 生理盐水清洗2～3 次，收集菌体，加与培养液同体积的无菌生理盐水，调整菌浓度为7.0 lg（CFU/mL），制成菌悬液。称取莲藕渣粉，以一定的比例加入蒸馏水，按照2%比例添加白砂糖，混匀溶解，高速匀浆30 s 或1 min 后，分装到250 mL 三角瓶中，在108 ℃条件下进行15 min 灭菌处理，灭菌后样品在无菌操作台中按2% 接种量接种副干酪乳杆菌PC18 菌株，在一定条件下对藕渣粉末中可溶性膳食纤维发酵改性。
1.3.2 可溶性膳食纤维提取
按照GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》并稍作修改。称取发酵样液50 g于250 mL 锥形瓶，加入0.05 mol/L MES-TRIS 缓冲液80 mL，混匀。加入0.10 mL 热稳定α-淀粉酶溶液，在95 ℃恒温水浴反应35 min；溶液冷却至60 ℃后，加入0.20 mL 碱性蛋白酶液（200 U/mg），在60 ℃恒温水浴反应30 min 后，加入3 mol/L 乙酸溶液，调节溶液pH 值至4.5±0.2；再加入0.20 mL 淀粉葡萄糖苷酶液（105 U/mL），在60 ℃恒温水浴反应30 min。将莲藕渣酶解溶液过滤，得到滤液。取出残渣，电热恒温鼓风干燥箱烘干至恒重，得到莲藕渣IDF。滤液与95% 乙醇（体积比1∶4）混配制后进行醇沉过夜，5 000 r/min 离心15 min，取沉淀在65 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干至恒重，得到藕渣SDF。SDF 含量（S，%）和IDF 含量（I，%）计算公式如下。
式中：m 为发酵培养基中原干藕渣质量，g；m1 为发酵样品提取到SDF 质量，g。
式中：m 为发酵培养基中原干藕渣质量，g；m2 为发酵样品提取到IDF 质量，g。
1.3.3 副干酪乳杆菌PC18 发酵藕渣工艺优化
1.3.3.1 单因素试验
在灭菌温度108 ℃、灭菌时间15 min、白砂糖添加量2%基础上进行单因素试验，分别探究料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、发酵时间（24、36、48、60、72 h）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（33、35、37、39、41 ℃）对发酵藕渣可溶性膳食纤维含量的影响。
1.3.3.2 响应面优化试验
使用Design Expert 软件，根据单因素试验结果，选取料液比、发酵时间、接种量为自变量，以SDF 含量为响应值，运用Box-Behnken 试验设计方法，设计三因素三水平试验，各因素水平见表1。
表1 Box-Behnken 试验设计因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design
水平-1 0 1因素A 料液比/（g/mL）1∶30 1∶40 1∶50 B 发酵时间/h 24 36 48 C 接种量/%3 4 5
1.3.3.3 ANN 模型建立
通过单因素试验确定Box-Behnken 试验设计的料液比、发酵时间、接种量3 个因素为输入变量，以SDF含量为输出变量建立ANN 模型。利用软件Matlab 2017b 中Neural Network Tool 构建BP 神经网络模型，模型包括输入层、隐藏层和输出层。从17 组试验结果的数据集中选取70% 用于训练，15% 用于测试，15%用于验证。
1.3.3.4 遗传算法寻优设计
ANN 预测模型构建后，通过Matlab 遗传算法工具箱，利用人工神经网络生成的数据作为初始种群，模拟物种繁殖、杂交、变异、竞争、选择等自然现象对个体种群反复修改，进行遗传算法寻优，得到最大输出变量[17]。对提取条件中的料液比、发酵时间、接种量3 个因素在一定范围内进行人工神经网络模拟运算，以模型拟合值建立个体适应函数进行全局寻优。
1.3.3.5 响应面与ANN-GA 模型验证比较
为了检验模型有效性及准确性，验证响应面与ANN-GA 模型下最优条件SDF 含量的实际值与试验值之间差异，通过模型决定系数（R2）、均方根误差（root mean square error，RMSE）、平均偏差（absolute average deviation，AAD）评估两个模型预测能力[18]，公式如下。
式中：Xi，e 为第i 组的试验值；Xi，p 为第i 组的预测值；
为所有试验值的平均值；k 为试验组数。
1.4 数据统计分析
采用SPSS Statistics 进行单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），选择邓肯法用于检验不同组样本之间差异显著性（P＜0.05）。Origin Pro 2021 软件绘制图表；Design Expert 进行Box-Behnken 设计并构建响应面模型；Matlab 2017b 构建ANN 模型并使用GA 优化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
图1 为料液比、发酵时间、接种量、发酵温度对SDF 含量的影响。
图1 各因素对藕渣SDF 含量影响
Fig.1 Effects of various factors on SDF content of lotus root residues
由图1A 可知，随着溶剂体积的增大，SDF 含量逐渐增大。当溶液体积较小时，灭菌后样品呈黏稠状态，流动性较差，导致藕渣与乳酸菌接触不充分，体系中过高的营养物浓度造成基质渗透压增大[19]。随着溶剂体积的增大，发酵液底物接触更加充分，反应更加彻底，使得IDF 转化为SDF[20]，SDF 含量升高。当溶剂体积过大时，体系中营养物质浓度较低，影响微生物对发酵基质中营养物质利用率，综合考虑提取效率与生产成本，并在SDF 含量相对提高基础上，选取料液比1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）进行后续试验。
由图1B 可知，随着发酵时间的延长，SDF 含量先增加后降低并趋于稳定，当发酵时间为36 h 时，SDF含量达到（5.30±0.09）%。在36 h 前，菌株中酶对藕渣样液中的IDF 进行降解，生成小分子多糖，进一步转化为SDF[21]。发酵时间高于36 h 后，微生物生长供能的糖类消耗增大[22]，发酵时间过长，酸性环境下抑制菌体生长，产生菌体自溶，发酵能力下降，导致SDF 含量逐渐减少[23]。另外，从经济角度考虑，发酵时间过长导致耗能过高，因此，选取发酵时间24、36、48 h 进行后续试验。
由图1C 可知，随着接种量的增大，SDF 含量先增加后降低，当接种量达到4% 时，SDF 含量显著提高；当接种量过少时，微生物生长迟缓期延长，发酵剂所提供的活菌数不足以完成藕渣的发酵，影响乳酸菌代谢产物生成[24]。随着接种量增加，发酵液中可产生更多的酶，促进发酵彻底，接种量过大时，菌体生长旺盛，消化分解迅速，发酵液营养物质快速消耗[25]，使得微生物吸收利用SDF，并引起后续发酵动力不足。因此，选取接种量3%、4%、5%进行后续试验。
由图1D 可知，随着发酵温度升高，SDF 含量呈现先升高后下降趋势，在33～39 ℃范围内，35 ℃下SDF含量最高，为（4.96±0.18）%。可能由于在一定温度范围内，伴随发酵温度持续升高，乳酸菌生长代谢降低，发酵能力下降[1]。发酵温度过高超过菌体最适生长温度，藕渣中SDF 分子自身结构遭到破坏，造成SDF 损失。综合考虑，选定发酵温度35 ℃进行后续试验。
2.2 响应面优化试验结果
响应面试验设计和结果见表2。
表2 响应面试验设计和结果
Table 2 Design and results of response surface experiment
组号1 2 3 4 5 A 料液比/（g/mL）1∶40 1∶40 1∶30 1∶40 1∶40 B 发酵时间/h 48 36 48 48 24 C 接种量/%3 4 4 5 3 SDF 含量/%4.96 4.00 4.49 3.69 3.73
续表2 响应面试验设计和结果
Continue table 2 Design and results of response surface experiment
组号6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 料液比/（g/mL）1∶50 1∶40 1∶30 1∶40 1∶40 1∶30 1∶40 1∶50 1∶30 1∶40 1∶50 1∶50 B 发酵时间/h 36 24 36 36 36 36 36 36 24 36 24 48 C 接种量/%5 5 3 4 4 5 4 3 4 4 4 4 SDF 含量/%3.56 4.23 3.57 4.37 4.65 2.61 4.63 3.39 3.27 4.57 4.43 4.47
利用Design Expert 软件处理分析表2 的试验结果，二次多项式回归拟合，得到以SDF 含量（Y）对自变量A（料液比）、B（发酵时间）、C（接种量）的回归方程：Y=4.44-0.24×A+0.24×B-0.20×C+0.30×AB-0.28×AC-0.44×BC-0.57×A2+0.30×B2-0.59×C2。
响应面回归模型的方差分析结果见表3。
表3 响应面回归模型拟合结果
Table 3 Fitting results of response surface regression model
注：**表示差异极显著（P＜0.01）；*表示差异显著（P＜0.05）。
方差来源模型A 料液比B 发酵时间C 接种量AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总离差平方和5.91 0.46 0.48 0.30 0.35 0.32 0.78 1.39 0.37 1.40 0.35 0.058 0.30 6.26自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方0.66 0.46 0.48 0.30 0.35 0.32 0.78 1.39 0.37 1.45 0.050 0.019 0.074 F 值13.01 9.04 9.42 6.03 6.90 6.32 15.52 27.53 7.28 28.75 0.26 P 值0.001 4 0.019 8 0.018 1 0.043 8 0.034 1 0.040 1 0.005 6 0.001 2 0.030 7 0.001 1 0.850 9显著性**************
由表3 可知，回归模型P＜0.01，表明此回归模型影响效果极显著；失拟项P＞0.05，表明该回归模型不具有失拟性[26]，模型拟合效果较好。其中，总决定系数R2=0.943 6，反映出94.36% 响应变化。校正决定系数R2Adj=0.871 1，表明本回归模型87.11% 响应值变化决定于所选的变量因素。变异系数=5.57%＜10%，此试验具有重复性。由于FB＞FA＞FC，因此不同因素对响应值SDF 含量影响大小顺序为B（发酵时间）＞A（料液比）＞C（接种量）；一次项A、B、C 影响显著P＜0.05；二次项A2、C2 影响极显著P＜0.01，B2 影响显著P＜0.05；交互项AB、AC 影响显著P＜0.05，BC 影响极显著P＜0.01。
2.3 响应面最优条件验证试验
利用Design Expert 软件分析对回归方程进行求解，得到发酵制取藕渣SDF 最佳工艺参数为料液比1∶41.797 7（g/mL）、发酵时间47.545 9 h、接种量3.416%，在此条件下，藕渣SDF 含量为5.058 07%。为便于实际操作，将最佳工艺参数调整为料液比1∶42（g/mL）、发酵时间47.5 h、接种量3.4%，在此条件下进行3 次平行验证试验，得到SDF 含量平均值为（5.02±0.14）%。
2.4 人工神经网络模型建立与遗传算法优化
2.4.1 人工神经网络模型构建与结果分析
利用软件Matlab 2017b 中Neural Network Tool 构建3 层BP 神经网络分析模型，将料液比、发酵时间、接种量作为模型的3 个输入神经元，中间1 个隐藏层，隐藏层中神经元个数为10，SDF 含量作为模型唯一输出变量，从而构建一个3-10-1 的网络拓扑结构。
2.4.2 人工神经网络模型构建结果
人工神经网络中拟合度通过将试验预测值、训练值、验证值进行比较得到，其中人工神经网络模型数据集目标值的散点图见图2。
图2 人工神经网络模型数据集目标值的散点图
Fig.2 Scatter plot of target values of ANN model dataset
由图2 可知，ANN 开发的训练、测试、验证模型回归系数分别为0.996 87、0.999 83、0.964 19，整体模型回归系数为0.964 64。由ANN 训练结果得到R 值近似接近于1，此高回归值显示预测值与数据集的实际值相似度较高，表明构建的神经网络模型对于试验结果的预测能力可靠。
ANN 模型中均方误差（mean-square error，MSE）值越小，ANN 模型预测试验数据准确性越高[18，27]。其中，人工神经网络模型迭代图见图3。
图3 人工神经网络模型迭代图
Fig.3 Iteration graph of ANN model
由图3 可知，在训练、验证和测试过程中，MSE 值随迭代次数增加逐渐接近最优值，网络学习效果较好，在第3 个epoch 时验证效果最好，MSE 值为0.061 746，近乎接近于0。
2.4.3 遗传算法优化结果
利用Matlab 2017b 遗传算法计算工具进行全局寻优，GA-ANN 作为遗传算法适应度函数，变量维数为3，经过遗传算法优化，在98 次遗传迭代获得最优解，结果为料液比1∶37.944（g/mL）、发酵时间48 h、接种量4.017%，在此条件下，藕渣SDF 含量为6.009 23%。为便于实际操作，将最佳工艺参数调整为料液比1∶38（g/mL）、发酵时间48 h、接种量4.0%，在此条件下进行3 次平行验证试验，结果显示SDF 含量为（5.97±0.73）%。
2.5 响应面与ANN-GA 模型比较
2.5.1 响应面与ANN-GA 模型评价参数比较
响应面法可在非线性建模中得到广泛应用，由于其可在试验数据统计分析中获得各输入变量对响应值的贡献，而人工神经网路建模可建立多阶非线性模型来拟合任意数据，因此可在数据分析中被广泛应用。基于决定系数R2、RMSE、AAD 比较了响应面模型和人工神经网络与遗传算法，结果见表4。
表4 响应面与ANN-GA 模型评价参数比较
Table 4 Comparison of evaluation parameters of RSM and ANNGA model
参数决定系数R2均方根误差（RMSE）平均偏差（AAD）RSM 模型0.943 6 0.206 3 0.134 7 ANN-GA 模型0.930 5 0.162 7 0.104 1
由表4 可知，响应面模型的R2、RMSE、AAD 分别为0.943 6、0.206 3、0.134 7，ANN-GA 模 型 的R2、RMSE、AAD 分别为0.930 5、0.162 7、0.104 1，响应面与ANN-GA 模型的R2 都达到0.93 以上，表明模型整体拟合效果较好，ANN-GA 模型的RMSE、AAD 相比于响应面模型更小，因此模型拟合的预测值离散程度更低，预测结果更准确[18]。综上比较，ANN-GA 模型对比响应面模型预测副干酪乳杆菌发酵藕渣膳食纤维效果更佳。
2.5.2 响应面与ANN-GA 模型优化结果比较
鉴于建立的ANN-GA 模型比RSM 模型具有更高拟合度、精度和预测能力等特点，进一步检测模型可靠性，验证响应面与ANN-GA 模型优化的最佳组合及预测值，并对其两者进行比较，结果如表5 所示。
表5 响应面与ANN-GA 模型优化结果比较
Table 5 Comparison of RSM and ANN-GA model optimization results
模型RSM ANN-GA最优条件料液比/（g/mL）1∶42 1∶38发酵时间/h 47.5 48接种量/%3.4 4.0 SDF 含量/%预测值5.06 6.00试验值5.02 5.97相对误差/%0.79 0.50
由表5 可知，响应面模型与ANN-GA 模型的相对误差值均小于5%，但ANN-GA 模型相对误差值相对更低，表明ANN-GA 模型具有更高精确度与应用性。
3 结论
乳酸菌发酵可以有效提高果蔬残渣中可溶性膳食纤维含量，增加果蔬残渣作为食品原料的可操作性，本研究接种副干酪乳杆菌发酵藕渣制备可溶性膳食纤维含量，在前期试验基础上，确定影响可溶性膳食纤维含量的主要影响因素为料液比、发酵时间、接种量。
本研究基于RSM 和ANN-GA 方法分别构建发酵预测模型并对两者进行比较。通过Neural Network Tool 构建3 层BP 神经网络及3-10-1 的网络拓扑结构，在此基础上通过遗传算法迭代优化，得到最优发酵条件为料液比1∶37.944（g/mL）、发酵时间48 h、接种量4.017%，此时SDF 含量为6.009 23%，为便于实际操作，将最佳工艺参数调整为料液比1∶38（g/mL）、发酵时间48 h、接种量4.0%。同时，此模型与所构建的响应面模型相比，R2 值都达到0.93 以上，但RMSE、AAD 值更低，即ANN-GA 模型整体拟合效果更优，模型具有更高精确度与应用性。
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