沙苑子为豆科植物扁茎黄芪(Astragalus complanatus R.Br.)的干燥成熟种子[1],具有补肝、益肾、明目、固精的功效,用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、目昏等[1]。研究表明,沙苑子含有多种生物活性物质,包括多糖类、氨基酸类、黄酮类、脂肪酸类等,具有抗氧化、降血脂、抗衰老、抗肿瘤的作用[2-5]。
近年来,因中药植物蛋白的天然属性及其独特的生物活性功能,研究者开发出了大量的中药植物蛋白功能食品产品,备受消费者的青睐。由于中药植物的药食兼用属性,中药植物蛋白的开发潜力和市场价值逐渐受到关注,已成为功能食品研究领域的热点之一。沙苑子作为种子类中药材,富含丰富的蛋白质,由多种氨基酸组成,其中谷氨酸含量最高[6-7]。沙苑子中含有丰富的赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸7 种人体必需氨基酸[6-8]。因此,沙苑子是一种潜在的天然植物蛋白资源,具有很高的开发潜力[9]。目前关于沙苑子蛋白质开发研究较少,对于其分级蛋白研究鲜见,本研究基于Osborne 法对沙苑子中含有的组分蛋白成分进行分离提取工艺研究,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)法分析各组分蛋白进行亚基组成,并在此基础上对沙苑子组分蛋白的抗氧化活性进行探讨,以期能够为沙苑子药材资源的充分开发和沙苑子蛋白类成分的活性研究提供理论基础,丰富沙苑子药材的综合价值。
石油醚(沸程:60~90 ℃)、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、冰醋酸、甲醇(均为分析纯)、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、蛋白质Marker(10~180 kDa)、甘油、十二烷基硫酸钠、巯基乙醇、溴酚蓝、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]:北京索莱宝科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS](均为98%):上海源叶生物科技有限公司。
FSJ-A03E1 型粉碎机、HH-6 数显恒温水浴锅:常州佳美仪器制造有限公司;1-14 微型离心机:德国Sigma 有限公司;Infinite M200 PRO 酶标仪:瑞士TECAN 公司;Mini-PROTEAN Tetra 电泳仪、ChemiDoc MP Western 荧光成像分析仪:美国BioRad 公司;MS303S 千分之一分析天平、AL204 万分之一分析天平:美国METTLER-TOLEDO 仪器有限公司。
将沙苑子进行粉碎过筛,得沙苑子粉,按照料液比1∶10(g/mL)加入石油醚,于室温下搅拌48 h 脱脂,5 000 r/min 离心10 min 收集沉淀,置于通风橱内挥干石油醚,将沙苑子脱脂粉收集备用。
参考文献[10]的方法,采用Osborne 法分级分离提取沙苑子蛋白。
1.4.1 清蛋白提取
取适量沙苑子脱脂粉,按照料液比1∶10(g/mL)加入蒸馏水,分别于25、35、45、55 ℃下搅拌4 h,7 000 r/min离心10 min,收集上清液即为清蛋白溶液,透析(3 500 Da、pH7、24 h),冷冻干燥,得沙苑子清蛋白粉。
1.4.2 球蛋白的提取
取1.4.1 项下离心后的沉淀,按照1∶10(g/mL)料液比分别加入1%、2%、3%、4%、5%和6% NaCl 溶液,搅拌1、2、3、4 h,7 000 r/min 离心10 min,收集上清液即为球蛋白溶液,透析(3 500 Da、pH7、24 h),冷冻干燥,得沙苑子球蛋白粉[11]。
1.4.3 醇溶蛋白的提取
取1.4.2 项下离心后的沉淀,按照1∶10(g/mL)料液比分别加入50%、60%、70%和80%乙醇溶液,搅拌1、2、3、4 h,7 000 r/min 离心10 min,收集上清液即为醇溶蛋白溶液,透析(3 500 Da、pH7、24 h),冷冻干燥,得沙苑子醇溶蛋白粉。
1.4.4 谷蛋白的提取
取1.4.3 项下离心后的沉淀,按照1∶10(g/mL)料液比分别加入0.01、0.05、0.10 mol/L 和0.15 mol/L 的NaOH 溶液,搅拌1、2、3、4 h,7 000 r/min 离心10 min,收集上清液即为谷蛋白溶液,透析(3 500 Da、pH7、24 h),冷冻干燥,得沙苑子谷蛋白粉。
采用考马斯亮蓝比色法[12]进行沙苑子组分蛋白提取率测定。
参照Laemmli[13]的凝胶电泳法,将各组分蛋白与上样缓冲液按照比例混合,煮沸5 min,温度冷却至室温后上样。SDA-PAGE 浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为10%,上样量为10 μL。采用恒压电泳,浓缩胶电压设为70 V,时间30 min,分离胶电压设为140 V,时间60 min。电泳结束后,用考马斯亮蓝R-250 染液于室温染色30 min,脱色液脱色后,采用荧光成像分析仪拍照分析。
1.7.1 DPPH 自由基清除能力测定
参照文献[14-16]的方法,取2 mL 沙苑子组分蛋白冻干粉样品液于试管中,分别于各试管中加入2 mL DPPH 溶液,涡旋,使之混匀。于暗室反应30 min,在517 nm 处测定吸光度A1;以2 mL 甲醇代替DPPH 溶液作为样品对照组,测定吸光度A2;以2 mL 蒸馏水代替样品液作为空白对照组,测定吸光度A0。以1 mL甲醇+1 mL 水作空白调零,以VC 作为对照组。按下式计算DPPH 自由基清除率(D,%)。
1.7.2 ABTS+自由基清除能力测定
参照文献[14-18]的方法,取400 μL ABTS 工作液,用磷酸缓冲盐(phosphate buffered saline,PBS)溶液(pH7.4)稀释至734 nm 处吸光度为0.7±0.2。将200 μL ABTS 工作液与10 μL 不同浓度样品混合,常温避光反应6 min,在734 nm 波长测定吸光度A1;以10 μL PBS溶液代替样品液,在734 nm 波长测定吸光度A0。ABTS+自由基清除率(B,%)由下式计算。
所有试验重复操作3 次,取平均值,数据采用Origin 2023 软件进行计算绘图,结果用平均值±标准差表示。
2.1.1 提取温度对沙苑子清蛋白提取率的影响
提取温度对沙苑子清蛋白提取率的影响如图1所示。
图1 不同提取温度对沙苑子清蛋白提取率的影响
Fig.1 Effects of different extraction temperatures on the extraction rate of semen Astragali complanati albumin
由图1 可知,沙苑子蛋白提取率随温度的升高先增加后减小,45 ℃时蛋白提取率最高,高于45 ℃,清蛋白提取率下降。温度是影响蛋白质提取率的主要因素之一,提取温度的变化会影响蛋白质的溶解性,在一定温度范围内,提高提取温度可以显著增加蛋白质的溶解度,蛋白质分子受热分解,氢键解离,空间结构改变,聚合性降低,分散性增加,有利于沙苑子清蛋白的溶出。但当温度过高,蛋白质结构遭到破坏,发生变性反应产生沉淀,蛋白提取率降低[19-23]。因此,沙苑子清蛋白最佳提取温度为45 ℃。
2.1.2 NaCl 浓度对沙苑子球蛋白提取率的影响
NaCl 浓度对沙苑子球蛋白提取率的影响如图2所示。
图2 不同NaCl 浓度对沙苑子球蛋白提取率的影响
Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on the extraction rate of semen Astragali complanati globulin
由图2 可知,在NaCl 浓度为1%~6% 时,随着NaCl 浓度升高,球蛋白提取率逐渐增加,当NaCl 浓度增加到6% 时,球蛋白提取率随时间的延长呈先上升后下降趋势。在NaCl 低浓度溶液中,蛋白质分子间电子双层重叠力克服范德华力,产生排斥力,随NaCl 浓度增加,蛋白质分子表面电荷增多,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质溶解度增大,出现盐溶现象,当NaCl 溶液达到一定浓度时,解离产生的离子吸附了溶液中大部分自由水,从而破坏蛋白质的水化作用,引起蛋白质溶解度降低,从溶液中沉淀[24]。且随着NaCl 浓度增加,盐的解离可抑制蛋白质弱电解质的解离,使蛋白质带电荷减少,更易聚集析出[25]。因此,沙苑子球蛋白最佳提取盐(NaCl)浓度为6%。
2.1.3 乙醇浓度对沙苑子醇溶蛋白提取率的影响
乙醇浓度对沙苑子醇溶蛋白提取率的影响如图3所示。
图3 不同乙醇溶液对沙苑子醇溶蛋白提取率的影响
Fig.3 Effects of different ethanol concentration on the extraction rate of Astragali complanati semen gliadin
醇溶蛋白具有独特的溶解性,它不溶于水和无水醇类,但可以溶解于浓度为50%~95% 的醇类水溶液[25-27]。由图3 可知,随乙醇浓度增大,醇溶蛋白提取率增大,当乙醇浓度为70% 时,醇溶蛋白提取率达到最大值,当乙醇浓度为80% 时,蛋白质变性导致沉淀,溶解度降低。因此,醇溶蛋白最佳提取醇浓度为70%。
2.1.4 NaOH 溶液浓度对沙苑子谷蛋白提取率的影响NaOH 溶液浓度对沙苑子谷蛋白提取率的影响如图4 所示。
图4 不同NaOH 浓度对沙苑子谷蛋白提取率的影响
Fig.4 Effects of different NaOH concentrations on the extraction rate of semen Astragali complanati glutelin
由图4 可知,当NaOH 溶液浓度为0.15 mol/L 时,谷蛋白提取率随时间延长呈升高趋势。在一定范围的碱性环境下,随着碱溶液浓度的增高,部分二硫键断裂,导致蛋白疏水性降低,增加其在水溶液中的溶解性。当碱溶液达到一定浓度时,蛋白质中的氢键发生断裂,疏水性增加,产生沉淀[25]。因此,谷蛋白最佳提取碱浓度为0.15 mol/L。
沙苑子蛋白组分SDS-PAGE 结果如图5 所示。
图5 沙苑子组分蛋白SDS-PAGE 分析
Fig.5 SDS-PAGE analysis of semen Astragali complanati component proteins
由图5 可知,不同提取温度的沙苑子清蛋白亚基组成不同,提取温度为45 ℃时,亚基条带较多且颜色较深,说明清蛋白在45 ℃时各亚基组成完整,蛋白提取率较高,清蛋白的亚基分布在相对分子质量17~100 kDa。此外,在还原性沙苑子组分蛋白SDS-PAGE中,沙苑子清蛋白的亚基条带较多,说明沙苑子清蛋白中含有大量的二硫键,β-巯基乙醇能够破坏蛋白质中的二硫键,从而使亚基增多[28]。在不同浓度的盐溶液中,沙苑子球蛋白亚基组成不同,采用5% NaCl 提取的沙苑子球蛋白亚基条带较多且颜色较深,说明5% NaCl 能较好地提取沙苑子球蛋白各亚基组成,球蛋白各亚基相对分子质量主要分布在11~100 kDa。此外,添加β-巯基乙醇后,球蛋白亚基条带较多,说明球蛋白也含有二硫键,分布在11~17 kDa 的二硫键较多。醇溶蛋白条带较少,表明醇溶蛋白较少,采用不同浓度的乙醇溶液提取,亚基条带相同,说明乙醇溶液浓度会影响醇溶蛋白提取率,但对蛋白亚基影响较小。β-巯基乙醇加入前后亚基条带未有明显变化,说明醇溶蛋白中二硫键含量较少。不同浓度碱溶液提取谷蛋白亚基条带不同,表明碱浓度对沙苑子谷蛋白亚基组分有较大影响,0.01 mol/L NaOH 浓度提取亚基条带较多。沙苑子谷蛋白各亚基相对分子质量主要分布在17~75 kDa,随NaOH 浓度增大,分子量为17~75 kDa 的亚基条带减少,分离胶顶端颜色逐渐加深,推测低浓度NaOH 有利于提取小分子量沙苑子谷蛋白,而高浓度NaOH 有利于提取大分子量沙苑子谷蛋白,NaOH 浓度为0.05 mol/L 时既可以提取大分子量谷蛋白也可以提取部分小分子量亚基。分子量在35~75 kDa 的亚基,在还原剂存在下,二硫键断裂,迁移率变大。
2.3.1 DPPH 自由基清除能力
DPPH 法是一种常用的测定食品、药品等样品抗氧化性的方法。通过测定反应前后DPPH 自由基的吸光度差异,可以计算出样品的抗氧化能力。沙苑子组分蛋白DPPH 自由基清除能力如图6 所示。
图6 沙苑子组分蛋白DPPH 自由基清除能力
Fig.6 DPPH free radical scavenging abilities of semen Astragali complanati component proteins
由图6 可知,在0.5~2.5 mg/mL 浓度范围内,4 种组分蛋白的DPPH 自由基清除率随浓度增大而升高,呈现一定的剂量依赖性,当浓度高于2.0 mg/mL 时,谷蛋白DPPH 自由基清除率趋于平缓且接近VC,因此,沙苑子谷蛋白可以作为一种DPPH 自由基清除剂。沙苑子中4 种组分蛋白的DPPH 自由基清除能力大小为谷蛋白>清蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。
2.3.2 ABTS+自由基清除能力
ABTS 法是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法。ABTS 与K2S2O4 反应后在734 nm 下有最大吸收且会显蓝绿色,当自由基被清除,溶液颜色会变浅,从而导致734 nm 下吸光度降低[27]。沙苑子不同组分蛋白的ABTS+自由基清除能力如图7 所示。
图7 沙苑子组分蛋白ABTS+自由基清除能力
Fig.7 ABTS+free radical scavenging abilities of semen Astragali complanati component proteins
由图7 可知,沙苑子清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的自由基清除能力相当,谷蛋白ABTS+自由基清除能力最好,在0.5~2.5 mg/mL 浓度范围内,清除率随浓度增大而升高,呈现一定的剂量依赖性,可以用作ABTS+自由基清除剂。
单因素试验结果表明,确定采用Osborne 分级提取法提取沙苑子蛋白组分的最佳提取条件为清蛋白最佳提取温度为45 ℃,球蛋白最佳提取盐浓度为6%,醇溶蛋白最佳提取醇浓度为70%,谷蛋白最佳提取碱浓度为0.15 mol/L;针对最佳工艺获得的组分蛋白,其蛋白提取率的大小为谷蛋白>清蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。沙苑子各蛋白组分经SDS-PAGE 分析,清蛋白和球蛋白各亚基相对分子质量主要分布在11~100 kDa,分布在35~75 kDa 的清蛋白和谷蛋白亚基、17~75 kDa的球蛋白亚基可能是通过二硫键作用形成的。沙苑子醇溶蛋白可能分子量较大,电泳条带不明显。此外,沙苑子清蛋白中含有较多亚基,营养更为均衡。不同提取条件对沙苑子组分蛋白提取率有较大影响,且在一定程度上影响蛋白亚基组成。沙苑子中4 种组分蛋白的DPPH 自由基清除能力大小为谷蛋白>清蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。ABTS+自由基清除能力大小为清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白清除能力相当,均低于谷蛋白,谷蛋白随浓度增大清除力呈上升趋势。综上所述,沙苑子4 种组分蛋白均具有一定的自由基清除能力,其中沙苑子谷蛋白的抗氧化能力最好,在一定浓度下其抗氧化活性接近VC,具有良好的抗氧化应用前景。
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