清洁标签这一理论在20 世纪80 年代被欧盟首次提出,是指产品中尽量避免使用E 编码(一种食品添加剂的编码系统,每个食品添加剂对应一个编码)的食品添加剂成分[1],即在产品中尽量避免使用人造或化学添加剂,使配料表简单易懂,保持标签配料栏中食品的天然属性,同时应该尽可能地减小加工强度并简化加工流程[2]。
肉类工业在加工过程中为满足技术需求和感官特性需要加入大量的添加剂,但目前消费者对于安全优质的肉及肉制品的需求更加多元化,更倾向于天然、加工程度低的肉制品[3]。作为食品工业的组成部分,肉类工业需要向清洁标签产品进行转变[4]。卤牛肉作为我国最典型的肉制品之一,是干腌、用各种香料和调味料在水中卤煮而成。由于营养丰富、风味独特、颜色鲜艳,受到许多消费者的喜爱[5]。由于卤牛肉营养丰富,为微生物的生长繁殖提供了有利条件,而微生物的大量繁殖是使肉制品腐败变质的主要原因[6]。因此,卤牛肉的保质期比较短,在运输和贮存的过程中对环境的要求比较严格,保存不当会使细菌迅速生长繁殖,加快产品腐败变质。在2022 年以前肉制品中经常使用脱氢乙酸钠作为抑菌防腐剂,根据2021 年3 月国家食品安全国家标准评审委员会发布的GB 2760《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》征求意见稿[7],淀粉制品、面包、糕点、烘烤食品馅料及表面用挂浆、黄油和浓缩黄油、预制肉制品、熟肉制品、果蔬汁等产品中,都将禁用脱氢乙酸及其钠盐作为防腐剂。
消费者对“清洁标签”产品的需求使对于天然成分的研究成为了研究人员和行业的研究热点[8]。乳清发酵粉是以乳清、葡萄糖为原料,经费氏丙酸杆菌、植物乳杆菌等定向发酵而成[9],2020 年6 月8 日获批为新食品原料,生产单元归属为食用香精香料。其中的有机酸和小分子肽可抑制微生物,对食品保鲜具有重要作用[10]。其发酵产生的代谢产物具有抗微生物活性的效果。乳清发酵粉对枯草杆菌、大肠杆菌具有一定的抑制效果[9],可作为天然抗菌剂被使用于肉制品、乳制品、烘焙制品、面制品中。乳清发酵粉产品作为合成抑菌防腐剂的替代产品,具有性价比高、效果好等优点且符合清洁标签理念,对食品保鲜行业发展具有积极的推动作用[11]。 乳酸链球菌素(Nisin)是一种由乳酸乳球菌亚种乳酸菌株产生的34 个氨基酸的抗菌肽,对许多革兰氏阳性菌具有活性,Nisin 是许多食品的天然防腐剂,主要用于乳制品和肉制品防腐。Nisin 可抑制致病性食源性细菌,如单核细胞增生李斯特菌和许多其他革兰氏阳性食品腐败微生物。Nisin 可以单独使用,也可以与其他防腐剂结合使用[12]。由于Nisin 的抗菌效果较好且对人体的毒性微不足道,Nisin 成为唯一被批准作为食品防腐剂的细菌素[13]。这两种具有防腐功能的物质符合消费者对“清洁标签”健康食品理念的追求,但关于其在卤牛肉产品中的具体添加量和使用方法研究较少,本文对乳清发酵粉和Nisin 在卤牛肉中的应用展开研究,以期为清洁标签卤牛肉的保鲜提供一定的数据支撑。
1.1.1 原辅料及化玻试剂
牛肉、香辛料:市售;大豆分离蛋白:山松生物制药有限公司;乳清发酵粉、Nisin:河南麦瑞克食品科技有限公司;平板计数琼脂(plate counting agar,PCA)培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar,VRBA)培养基:青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;D-异抗坏血酸钠(分析纯):郑州天顺食品添加剂有限公司。
1.1.2 配方
注射液基础配方(以肉质量计):水60%、大豆分离蛋白1%、注射盐2.5%、D-异抗坏血酸钠0.16%、乳清发酵粉及Nisin 按复配比例添加。
卤制料配方(以肉质量计):水200%、料酒3%、食盐1.5%、白糖0.3%、肉蔻0.2%、肉桂0.1%、八角0.08%、小茴香0.08%、白芷0.08%、花椒0.08%、辣椒0.08%、甘草0.072%、陈皮0.064%、味精0.04%、良姜0.04%、山奈0.028%、砂仁0.024%、豆蔻0.024%、丁香0.02%、草果0.02%。
XZ-GR-100 真空滚揉机:广东广州旭众机械公司;304 不锈钢煮制锅:潮汕市羽泰五金制品有限公司;SQFA2004 分析天平:苏州顺强机电设备有限公司;JYD400N 实验室无菌均质机:上海申鹿均质机有限公司;Hirayama HVR-50 高压灭菌锅:上海土森视觉科技有限公司;YJ-1340 洁净工作台:苏州市苏信净化设备厂;DHP-9080 欧莱博电热恒温培养箱:山东博科再生医学有限公司;XK97-A 菌落计数器:杭州微米派科技有限公司。
1.3.1 均匀设计试验
以5 个不同的乳清发酵粉添加量和5 个不同的Nisin 添加量作为因素,以感官评分、菌落总数、大肠菌群数作为考察指标,进行均匀设计试验,并且以不添加乳清发酵粉和Nisin 的空白组作为对照。U5(52)均匀设计试验见表1。
表1 U5(52)均匀设计试验
Table 1 U5(52)uniform design
处理1 2 3 4 5因素乳清发酵粉添加量/%0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nisin 添加量/%0.02 0.04 0.01 0.03 0.05
1.3.2 卤牛肉工艺流程
1.3.2.1 卤牛肉工艺流程
原料肉解冻→原料肉修整→注射→滚揉→腌制→卤煮→静置→切块包装→保藏。
1.3.2.2 操作要点
1)原料肉解冻:将原料肉自然解冻。
2)原料肉修整:解冻后原料及时进行修整,修去大块脂肪、骨渣、异物等,厚度保留6 cm,然后均匀横切,切块大小整体约450 g/块。
3)注射、滚揉、腌制:注射完的原料肉,真空滚揉1.5 h,正转25 min,间歇5 min,然后在0~4 ℃环境下进行腌制18 h。
4)卤煮:过血沫,按照配料表依次称取自来水和卤料,大火把水烧开,加入香辛料,熬煮30 min,加入白糖0.3%、味精0.04%、料酒3% 等充分溶解后加入过完血沫的原料肉[肉∶香辛料水=1∶2(料液比)],大火煮制20 min,中火煮制10 min,加食盐1.5%,小火煮制20 min,焖20 min。
5)静置:捞出放入清洗好的盆中,封上保鲜膜,冷却至30 ℃左右。
6)切块包装:切成质量一致的块状,装进自封袋包装,同时做好标记。
7)保藏:放在0~4 ℃冷库中保藏。
1.3.3 卤牛肉指标检测
1.3.3.1 菌落总数的检测菌落总数按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[14]进行测定。
1.3.3.2 大肠菌群的检测大肠菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[15]进行测定。
1.3.3.3 感官评定标准
感官评定值按照GB 2726—2016《食品安全国家标准熟肉制品》[16]进行测定。将每组样品切成两个大小一致的方块,放在洁净的白色盘中,由12 名食品专业人员(6 男,6 女,20~30 岁)组成评定小组,从组织状态、质地、气味、整体可接受性4 个方面进行感官评定。感官评定标准见表2。
表2 感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation criteria
项目组织状态质地特征描述切面整齐,结构紧密结实,有油光切面整齐,结构紧密结实,有少量油光切面粗糙,结构松散,无油光富有弹性,按压后可复原,不发黏弹性稍差,按压后复原较慢,有些发黏弹性差,发黏严重分值1~<4 4~<7 7~9 1~<4 4~<7 7~9
续表2 感官评定标准
Continue table 2 Sensory evaluation criteria
项目气味整体可接受性特征描述具有卤牛肉特殊的香味,无异味香味变淡,无异味香味消失,有些变臭整体可接受性高整体可接受性中等整体可接受性低分值1~<4 4~<7 7~9 1~<4 4~<7 7~9
数据分析采用SPSS 16.0 和MATLAB 7.0 软件,结果以平均值±标准差表示。
2.1.1 不同处理菌落总数变化情况直观分析
不同处理卤牛肉菌落总数增长趋势见图1。
图1 各组别菌落总数增长趋势
Fig.1 Growth trend of total bacterial count in each group
由图1 可知,与空白组相比,其余组均对微生物有抑制作用。从储存的第4~19 天,卤牛肉样品的菌落总数均呈上升趋势,其中空白组和处理1 在第4 天发现微生物的生长,且生长速度高于其他组;处理2~处理5 均从第8 天开始出现微生物生长;第13 天时,处理5 的菌落总数已达到4.44 lg(CFU/g),处理4 的菌落总数达到5.33 lg(CFU/g),处理3 的菌落总数达到6.00lg(CFU/g),处理2 的菌落总数达到了6.03 lg(CFU/g),处理1 的菌落总数达到6.94 lg(CFU/g)。
根据GB 2726—2016《食品安全国家标准 熟肉制品》[16]规定的最高安全限值(105 CFU/g),第19 天时,除处理5 组外,其余试验组别均超过最高安全限值(105 CFU/g),随后的菌落总数指标无测定价值。
综上,处理1(乳清发酵粉0.1%、Nisin 0.02%)对卤牛肉菌落总数的抑制效果最差,储存4 d 即发现有菌落生长;处理5(乳清发酵粉0.5%、Nisin 0.05%)对卤牛肉菌落总数抑制效果最好,微生物生长速度相对较慢,且处理5 相对应的卤牛肉产品在保证菌落总数在可接受水平限量值[104(CFU/g)]的条件下,可在0~4 ℃条件存放13 d。
2.1.2 菌落总数变化回归分析结果
以第13 天各处理组菌落总数作为目标变量,以乳清发酵粉添加量及Nisin 添加量为自变量,进行回归分析,得到下列回归方程(1)。
式中:z 为菌落总数,lg(CFU/g);x 为乳清发酵粉添加量,%;y 为Nisin 添加量,%。
菌落总数随乳清发酵粉和Nisin 添加量变化的直观图如图2 所示。
图2 乳清发酵粉和Nisin 添加量对菌落总数影响的回归分析曲面
Fig.2 Curved surface of regression analysis of the effect of the supplemental levels of whey baking powder and nisin on the total bacterial count
由图2 可知,在Nisin 添加量一定的情况下,菌落总数随着乳清发酵粉添加量的增加而减少。周玥等[11]将乳清发酵粉应用于鲜湿河粉的储存过程中,在乳清发酵粉添加量为0.10%和0.15%时,可分别将鲜湿河粉的贮存期由12 h 延长至36 h 和48 h。说明发酵物可有效抑制微生物的生长繁殖,这与本试验的研究结果相近。在乳清发酵粉添加量一定的情况下,菌落总数随着Nisin 添加量的增加而减少;Chung 等[17]研究发现,Nisin 对附着在肉上的革兰氏阳性菌(单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和乳酸链球菌)具有抑制作用,可以延迟一些附着在肉上的革兰氏阳性细菌的生长,以防止肉类变质,这与本试验的结果相似。并且乳清发酵粉和Nisin 之间存在着一定的交互作用,在乳清发酵粉和Nisin 添加量最小时,菌落总数在曲面上有最高点(对菌落总数抑制效果最差),在乳清发酵粉和Nisin 添加量最大时,菌落总数在曲面上有最低点(对菌落总数抑制效果最好)。因此具有最佳抑制效果为处理5,在试验考察的指标范围内,抑制菌落总数效果随乳清发酵粉和Nisin 的添加量增大而增强。
2.2.1 不同处理大肠菌群变化情况直观分析
各组的大肠菌群的增长趋势见图3。
图3 大肠菌群增长趋势
Fig.3 Growth trend of coliform
根据GB 2726—2016《食品安全国家标准熟肉制品》[16]可知,熟肉制品的大肠菌群可接受水平的限量值为10 CFU/g,最高安全限值为102 CFU/g。由图3可知,与空白组相比,其他组对大肠菌群均有抑制作用,除处理5 外,所有卤牛肉样品的大肠菌群均呈增加趋势,其中空白组及处理1 在第8 天已发现有大肠菌群的生长,且生长速度高于其他组;第13 天时,空白组和处理1(乳清发酵粉0.1%、Nisin 0.02%)的大肠菌群数已经超过最高安全限值;第19 天时,只有处理4、处理5 未超过最高安全限值;第23 天时,只有处理5(乳清发酵粉0.5%、Nisin 0.05%)的大肠菌群数仍然为0。
综上可知,处理1(乳清发酵粉0.1%、Nisin 0.02%)的抑制效果最差,第13 天的大肠菌群数就已经超过最高安全限值;处理5(乳清发酵粉0.5%、Nisin 0.05%)的抑制效果最好,相应的卤牛肉产品在0~4 ℃下存放23 d 也未发现大肠菌群的生长。
2.2.2 大肠菌群变化回归分析结果
以第13 天各处理组大肠菌群数作为目标变量,以乳清发酵粉添加量及Nisin 添加量为自变量,进行回归分析,得到回归方程(2)。
式中:z 为大肠菌群数,lg(CFU/g);x 为乳清发酵粉添加量,%;y 为Nisin 添加量,%。
再由MATLAB 绘图小程序对方程(2)进行绘图,得到大肠菌群数随乳清发酵粉和Nisin 添加量变化关系直观图,如图4 所示。
图4 第19 天乳清发酵粉和Nisin 添加量对大肠菌群影响的回归分析曲面
Fig.4 Curved surface of regression analysis of the effect of the addition of whey baking powder and Nisin on the coliform population at the 19th day
由图4 可知,在Nisin 添加量一定的情况下,大肠菌群数随着乳清发酵粉添加量的增加而减少;在乳清发酵粉添加量一定的情况下,大肠菌群数随着Nisin添加量的增加先减少再增加,Nisin 的最佳添加量为0.03%,由此发现Nisin 的添加量对于卤牛肉样品的大肠菌群影响不大,主要是乳清发酵粉对大肠菌群起着更重要的抑制作用,这可能是因为添加量较高的乳清发酵粉中丙酸杆菌和乳酸菌较多,它们发酵产生的代谢产物(如丙酸和乳酸等)具有抗微生物活性的功能[18]。这与Novickij 等[19]发现乳酸链球菌素在实验室环境中对大肠杆菌没有潜在的抗菌作用的结果相似。处理5对大肠菌群的抑制性最好,在试验考察的指标范围内,抑菌效果随乳清发酵粉的添加量增大而增强。
卤牛肉储存过程中不同时间节点的感官评分结果见表3。
表3 感官评价结果(n=12)
Table 3 Sensory evaluation results(n=12)
注:不同字母表示差异显著(p<0.05)。
处理空白组1 2 3 4 5感官评分第4 天29.53±2.08a 27.33±0.58a 26.67±1.00a 28.17±1.15a 28.83±1.71a 28.00±1.00a第8 天26.10±4.04a 27.50±0.00a 26.50±1.32a 27.67±0.58a 28.17±0.76a 28.17±0.76a第13 天18.47±2.89b 22.17±6.93a 24.50±4.58a 26.67±4.54a 23.67±0.29a 23.33±5.06a
由表3 可知,卤牛肉储存8 d 内,各处理间感官评分无显著性差异(p>0.05),这表明不同添加量条件下乳清发酵粉和Nisin 的添加不会影响产品感官。
在储存第13 天时,空白组感官评分显著下降,与其他5 组之间产生显著差异(p<0.05),但各处理组间感官评分无显著差异(p>0.05)。这表明将乳清发酵粉和Nisin 复配使用时,并不会影响卤牛肉的组织状态、质地、气味、整体可接受性等。各处理组和空白组随着贮藏时间的延长,感官评分具有一定程度的下降,其中空白组下降速度最快。这表明采用乳清发酵粉和Nisin 复配处理可以有效延长保藏期,可延缓卤牛肉样品在储存期间感官属性的下降,与Sureshkumar 等[20]的研究结果一致,确认乳酸链球菌素与丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)联合使用或单独使用可以延缓煮熟的牛肉香肠在储存期间感官属性(风味和质地评分)的下降。
以卤牛肉为对象,运用均匀设计试验方法,选用5 个不同的复配比例的乳清发酵粉和Nisin 作为保鲜配料,加到卤牛肉中,采用自封袋包装的方式,在0~4 ℃的冷库中保藏,通过测定第4、8、13、19 天的菌落总数和大肠菌群数,并进行相应样品的感官评价,结果表明,Nisin 和乳清发酵粉的复配组合对于卤牛肉产品的保鲜效果较好。在储藏期间卤牛肉配方中使用Nisin 和乳清发酵粉复配进行保鲜处理对感官特性有着积极的影响,且与空白组相比,5 组复配比例的感官均无显著差异,这表明乳清发酵粉和Nisin 在复配使用时,不会影响卤牛肉的组织状态、质地、气味等感官指标。
此外,Nisin 和乳清发酵粉的复配对各种微生物(菌落总数、大肠菌群)的生长具有一定抑制作用;所得产品也具有较高的稳定性,最佳保鲜配方是乳清发酵粉0.5%、Nisin 0.05%。Nisin 和乳清发酵粉复配组合可以有效地应用于卤牛肉配方中,以延长其货架期,达到替代防腐剂的作用。
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