柑橘(Citrus reticulate Blanco.)为芸香科柑橘属乔本植物的果实,是世界第一大水果,也是世界上重要的经济作物之一,涵盖橙、橘、柚、柑等1 300 余个品种[1-2]。我国作为世界第一大柑橘生产国和消费国,据统计,截至2021 年,我国柑橘种植面积达248.7 万hm2,产量达5 595.61 万t[3-4]。已有研究表明,柑橘果实中含有丰富的无机盐、维生素、有机酸、类黄酮、蛋白质和糖类等多种有益人体健康的物质,其果皮中同样富含多种生物活性成分,如类黄酮、生物碱、橙皮苷、柠檬苦素类似物、类胡萝卜素、精油和香豆素等,具有维持人体健康、预防疾病等作用,还可用作天然抗氧化剂及抑菌产品的重要来源,使机体免受活性氧自由基的损伤。在临床药用方面,柑橘果皮还具有“理气健脾、燥湿化痰”等功效[5-6]。此外,研究发现柑橘果皮中含有的挥发性物质——橘皮精油,具有促进胃肠蠕动和消化液分泌等作用,在减肥、美容等方面具有一定效果[7]。
果皮作为柑橘果实的重要组成部分,也是重要的可食用资源,其质量占果实总重的25%~40%,截至2021 年,我国年产柑橘果皮超1 600 万t,但绝大部分果皮被当作生产废弃物处理,造成了资源的极大浪费[2,4-5]。因此,科学合理开发利用柑橘果皮,从而达到柑橘产业高效绿色发展,已成为目前学术界、行业界共同关注的问题[8]。目前,关于对柑橘果皮营养品质和抗氧化能力测定的研究鲜有报道,且对其综合品质进行系统性评价的相关报道尤为缺乏。基于此,本研究通过对常见的4 种宽皮柑橘和4 种橙类柑橘果皮营养指标含量和抗氧化能力进行测定,结合主成分分析法完成对其营养品质的综合评价,以期为以柑橘果皮为主要原料制备新型功能性食品和天然抗氧化剂的研发提供新的思路,助推柑橘果皮在食品领域的深度开发利用。
4 种宽皮柑橘分别为砂糖橘(Citrus reticulata′Sha Tang Ju′):产自广省武鸣市;沃柑(Citrus reticulata′Orah′):产自广西省武鸣市;芦柑(Citrus reticulata′Ponkan′):产自湖北省宜昌市;不知火(Citrus reticulata′Shiranui′):产自四川省雅安市;4 种橙类柑橘分别为冰糖橙(Citrus×aurantium′ Bing Tang′):产自湖南省洪江市;脐橙(Citrus×aurantium′Gan Nan Zao′):产自江西省赣州市;血橙(Citrus×aurantium′Tarocco′):产自江西省赣州市;蜜香橙(Citrus×junos′Siebold ex Tanaka′):产自广西省桂林市。
陈皮:云南新世纪中药饮片有限公司;过氧化氢、邻苯三酚、磷酸氢二钠(均为分析纯):天津市风船化学试剂科技有限公司;L-抗坏血酸、水杨酸(均为分析纯):天津市致远化学试剂有限公司;蒽酮、石油醚、三氯化铁、三氯乙酸、硫酸铵(均为分析纯):广东光华科技股份有限公司;2,6-二氯靛酚钠盐水化合物(分析纯):阿法埃莎(中国)化学有限公司;芦丁标准品、D-半乳糖醛酸、1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-pyridylhydrazine,DPPH)(均为优级纯):上海源叶生物科技有限公司;新橙皮苷、对硝基苯酚(均为分析纯):上海麦克林生化科技股份有限公司;2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(分析纯):北京索莱宝科技股份有限公司。
SH10A 电子水分测定仪:上海菁海仪器有限公司;CP-214 电子分析天平、ST3100 pH 计:奥豪斯仪器(常州)有限公司;KDN-12C 数显温控消化炉、SZF-06A粗脂肪测定仪:上海新嘉电子有限公司;SX2-4-10 电阻炉:上海意丰电炉有限公司;SB-5200D 超声波清洗机:宁波新芝生物科技股份有限公司;SC-3614 低速离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司;UV-2550 紫外可见分光光度计:岛津(上海)实验器材有限公司。
1.3.1 8 种柑橘果皮营养指标含量测定
水分含量采用电子水分测定仪测定;橙皮苷含量采用分光光度法测定;维生素C 含量参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》中的2,6-二氯靛酚滴定法进行测定;总黄酮含量采用文献[9]中的分光光度法测定;蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的分光光度法测定;总糖含量采用蒽酮比色法[10]测定;还原糖含量参照3,5-二硝基水杨酸比色法[11]进行测定;粗脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法进行测定;灰分含量参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》进行测定;果胶含量参照NY∕T 2016—2011《水果及其制品中果胶含量的测定分光光度法》进行测定;相对电导率采用电极法[12]进行测定。
1.3.2 8 种柑橘果皮抗氧化能力测定
1.3.2.1 样品预处理及样品溶液制备
样品预处理:将柑橘果实洗净晾干,手工剥皮,置于105 ℃干燥箱中干燥至恒重后,粉碎过80 目筛制得橘皮粉末,准确称取干燥的橘皮粉末1 g 于锥形瓶中,加入70%乙醇40 mL,超声辅助提取5 min 后过滤,收集滤液,滤渣继续添加70%乙醇重复提取3 次,过滤,将3 次滤液合并后以70%乙醇定容至刻度,备用。
1.3.2.2 样品铁离子抗氧化能力测定
柑橘果皮的铁离子抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)测定参照文献[13]的方法,稍作调整,取1 mL 样品溶液与4 mL 70% 乙醇混合均匀后,移取0.2 mL 上述混合溶液加入6 mL 经37 ℃水浴加热20 min 的FRAP 工作液,于波长593 nm 处测定其吸光度。同时,以70%乙醇溶液代替样品溶液为空白,并以维生素C 和陈皮为阳性对照。依据FRAP 标准曲线(y = 1.123 6x + 0.010 5,R2= 0.999 2)即可计算各样品的FRAP。
1.3.2.3 样品还原力测定
柑橘果皮还原力参照文献[14]的方法进行测定,取样品溶液40 mL、蒸馏水20 mL、磷酸钠缓冲液3 mL 和铁氰化钾溶液1.5 mL 混匀后于50 ℃水浴加热20 min,快速冷却至室温后于反应液中加入2 mL 三氯乙酸溶液终止反应,3 000 r∕min 离心5 min,移取5 mL上层清液至试管中,随后加入蒸馏水5 mL 和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL,摇匀后于波长700 nm 处测定吸光度。相同条件下,以维生素C 和陈皮为阳性对照。依据吸光度大小判断样品还原力。
1.3.2.4 DPPH 自由基清除率测定
柑橘果皮1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率参照文献[15]的方法,稍作修改,准确吸取0.2 mL 样品溶液于洁净试管中,加入4 mL 0.1µmol∕L DPPH 溶液轻摇混匀,静置避光反应20 min 后于波长517 nm处测吸光度A1;相同条件下,以无水乙醇代替DPPH溶液,测定吸光度A2;以70% 乙醇代替样品溶液测定空白对照的吸光度A0;同时,以维生素C 和陈皮为阳性对照。DPPH 自由基清除率(Y,%)的计算公式(1)如下。
1.3.2.5 羟基自由基清除率测定
柑橘果皮羟基自由基清除率参照文献[14]的方法,稍作修改,分别准确移取样品溶液、水杨酸-乙醇溶液、FeSO4 溶液各1 mL 于试管中,随后加入1 mL H2O2 溶液,轻摇混匀后于37 ℃恒温水浴反应15 min,于510 nm 波长处测吸光度A1;相同条件下,以蒸馏水分别代替H2O2 和样品溶液,以此测定溶液本底吸光度A2 和空白对照的吸光度A0;同时,以维生素C 和陈皮为阳性对照。根据公式(1)计算出不同样品对·OH 的清除率。
1.3.2.6 超氧阴离子自由基清除率
柑橘果皮超氧阴离子自由基清除率参照文献[16]的方法,稍作修改,准确吸取1 mL 样品溶液和5 mL Tris-HCl 缓冲液于试管中混匀后于25 ℃水浴加热20 min,随后加入1 mL 经25 ℃预热的邻苯三酚溶液,继续加热反应5 min 后,往反应液中加入1 mL HCl 终止反应,并于波长320 nm 处测定反应液的吸光度A1。相同条件下,以蒸馏水分别代替邻苯三酚溶液和样品溶液,以此测定溶液本底吸光度A2 和空白对照的吸光度A0;同时,以维生素C 和陈皮为阳性对照。根据公式(1)计算出不同样品对O2-·的清除率。
所有试验重复3 次,数据以平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 26.0 软件完成数据的处理分析和标准化;采用SPSS 26.0 软件的变异数分析法完成单因素方差分析;采用Origin 2021 完成皮尔逊相关性分析、主成分分析、聚类分析和数据可视化。
对8 种柑橘果皮营养指标含量的测定结果见表1,包括水分、橙皮苷、维生素C、总黄酮、蛋白质、总糖、还原糖、粗脂肪、灰分、果胶含量和相对电导率。
表1 8 种柑橘果皮营养指标测定结果
Table 1 Determination results of nutritional indicators of eight citrus peels
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
果皮样品砂糖橘沃柑芦柑不知火冰糖橙脐橙血橙蜜香橙水分含量∕%68.58±0.34e 76.35±0.33b 71.48±0.24d 75.45±1.10b 72.57±0.43c 73.40±0.29c 78.99±0.34a 78.50±0.22a橙皮苷含量∕(mg∕g)49.04±0.40f 38.99±0.23g 77.95±1.17b 65.51±0.47e 84.34±0.30a 75.88±0.30c 77.45±0.30b 73.61±0.80d维生素C 含量∕(mg∕100 g)120.31±2.60c 75.07±1.40e 66.31±2.42e 98.36±2.94d 145.51±8.83a 145.80±10.79a 137.88±7.45ab 127.30±5.69bc总黄酮含量∕%1.00±0.08b 0.70±0.01de 1.25±0.01a 0.91±0.03bc 0.84±0.02c 0.63±0.06e 0.65±0.05de 0.71±0.01d蛋白质含量∕%3.91±0.42a 1.87±0.40d 1.87±0.40d 1.27±0.07e 3.41±0.14abc 3.07±0.18c 3.20±0.20bc 3.75±0.30ab总糖含量∕%27.68±0.59d 24.98±0.95d 18.45±0.34e 30.38±1.20d 38.13±3.85c 41.44±3.66c 63.29±2.53a 52.57±6.66b还原糖含量∕%9.32±0.13a 6.77±0.02b 6.72±0.04b 2.66±0.02e 6.71±0.11b 5.08±0.06d 6.48±0.11c 6.72±0.05b粗脂肪含量∕%1.40±0.18b 0.85±0.19b 1.35±0.50b 0.79±0.16b 7.66±0.12a 7.32±0.14a 7.19±0.40a 7.69±0.46a灰分含量∕%1.38±0.45a 0.89±0.06b 0.73±0.02b 1.36±0.06a 0.98±0.05b 0.87±0.04b 0.87±0.04b 0.91±0.02b果胶含量∕(g∕kg)18.61±2.15a 13.41±2.10b 11.06±0.58bc 5.14±0.83e 9.05±1.33cd 7.08±0.84de 5.32±0.66e 10.60±1.08c相对电导率∕%64.69±0.85d 25.21±0.87g 48.87±0.73e 78.28±0.14c 81.79±0.56a 12.07±0.20h 79.76±0.24b 35.85±0.69f
由表1 可知,8 种柑橘果皮水分含量为(68.58±0.34)%~(78.99±0.34)%,其中血橙果皮的水分含量最高,为(78.99±0.34)%,其次为蜜香橙果皮,水分含量为(78.50±0.22)%,砂糖橘果皮水分含量最低,为(68.58±0.34)%,砂糖橘果皮与其余7 种柑橘果皮的水分含量相比,差异显著(P<0.05)。橙皮苷作为柑橘果皮的主要有效成分之一,具有维持血管正常渗透压、抗癌、抗菌、抗氧化等多种生理活性[6]。8 种柑橘果皮橙皮苷含量测定结果显示,冰糖橙果皮的橙皮苷含量最高,达(84.34±0.30)mg∕g,显著高于其余柑橘果皮(P<0.05),其中沃柑果皮的橙皮苷含量最低,为(38.99±0.23)mg∕g。维生素C 可通过还原反应消除超氧化物、羟基自由基和单线态氧,从而保护机体免受过氧化损伤,因此在维持机体正常生长发育和增强机体对疾病的抵抗力方面发挥着重要作用[17-19]。本研究中,8 种柑橘果皮维生素C 含量分布在(66.31±2.42)~(145.80±10.79)mg∕100 g,其中脐橙果皮的维生素C 含量最高,为(145.80±10.79)mg∕100 g,其次为冰糖橙,芦柑果皮的维生素C含量最低,为(66.31±2.42)mg∕100 g,显著低于砂糖橘、不知火、冰糖橙、脐橙、血橙和蜜香橙6 种果皮的维生素C 含量(P<0.05)。
黄酮是指两个苯环通过中心的3 个碳原子与苯酚羟基连接而形成的一系列化合物,广泛存在于各种植物中,具有较强的抗氧化、抗炎、调节血压和血糖等特性,通常被用作膳食补充剂,以促进机体健康和预防疾病[20-21]。8 种柑橘果皮总黄酮含量分布在(0.63±0.06)%~(1.25±0.01)%,芦柑果皮的总黄酮含量最高,显著高于其余柑橘果皮(P<0.05)。砂糖橘果皮的蛋白质含量最高,为(3.91±0.42)%,其次为蜜香橙果皮,不知火果皮的蛋白质含量最低,为(1.27±0.07)%,显著低于其余7 种柑橘果皮的蛋白质含量(P<0.05)。血橙果皮的总糖含量最高,为(63.29±2.53)%,显著高于其余柑橘果皮(P<0.05),芦柑果皮的总糖含量最低,为(18.45±0.34)%。8 种柑橘果皮的还原糖含量分布在(2.66±0.02)%~(9.32±0.13)%,其中砂糖橘果皮的总糖含量最高,不知火果皮最低;粗脂肪含量分布在(0.79±0.16)%~(7.69±0.46)%,其中4 种橙类柑橘(冰糖橙、脐橙、血橙和蜜香橙)果皮与4 种宽皮柑橘(砂糖橘、沃柑、芦柑和不知火)果皮的粗脂肪含量相比,差异显著(P<0.05);砂糖橘果皮灰分含量最高,为(1.38±0.45)%,其次是不知火果皮,为(1.36±0.06)%,砂糖橘和不知火果皮灰分含量显著高于其他6 种样品(P<0.05);果胶含量分布在(5.14±0.83)~(18.61±2.15)g∕kg,其中砂糖橘果皮果胶含量最高,不知火果皮果胶含量最低。
相对电导率的大小可以反映植物细胞的衰老程度[12]。8 种柑橘果皮相对电导率的测定结果分布在(12.07±0.20)%~(81.79±0.56)%,冰糖橙果皮相对电导率最高,达(81.79±0.56)%,显著高于其余柑橘果皮样品(P<0.05),其次是血橙果皮,相对电导率为(79.76±0.24)%,脐橙果皮相对电导率最低,为(12.07±0.20)%。
物质清除自由基的能力在很大程度上反映其本身的抗氧化活性[22]。由于不同抗氧化成分存在着不同的抗氧化机理,采用单一指标不能充分反映样品的抗氧化能力[23],因此本研究通过测定样品的铁离子抗氧化能力(FRAP)、还原力、DPPH 自由基清除率、羟基自由基(·OH)清除率和超氧阴离子自由基(O2-·)清除率来评价8 种柑橘果皮的抗氧化能力,测定结果见图1。
图1 8 种柑橘果皮抗氧化能力
Fig.1 Antioxidant capacity of eight citrus peels
A.铁离子抗氧化能力;B.还原力法评价样品抗氧化能力;C.对DPPH 自由基清除率;D.羟基自由基清除率;E.超氧阴离子自由基清除率。不同小写字母表示样品间差异显著(P<0.05)。
由图1A 可知,以维生素C 和陈皮为阳性对照,8 种柑橘果皮样品的铁离子抗氧化能力分布在(25.99±3.01)~(53.67±1.42)mmol∕100 g,其中脐橙果皮铁离子抗氧化能力最强,显著高于其余7 种样品及对照陈皮(P<0.05),不知火果皮铁离子抗氧化能力最弱。由图1B 可知,芦柑果皮还原力最强,吸光度为0.30±0.02,其次为脐橙果皮,吸光度为0.29±0.01,血橙果皮还原力最弱,吸光度为0.16±0.00,8 种柑橘果皮样品还原力均高于对照陈皮。由图1C 可知,8 种柑橘果皮DPPH 自由基清除率均显著高于对照陈皮(P<0.05),DPPH 自由基清除率分布在(61.08±1.24)%~(92.17±1.12)%,其中芦柑果皮DPPH自由基清除率最高,显著高于其余样品(P<0.05),血橙果皮清除率最低。由图1D 可知,砂糖橘果皮羟基自由基清除率最高,为(37.85±1.15)%,其次为脐橙果皮,为(37.37±0.74)%,砂糖橘果皮和脐橙果皮与其余6 种样品及对照陈皮的羟基自由基清除率相比,差异显著(P<0.05),蜜香橙果皮羟基自由基清除率最低,仅为(9.41±0.91)%。由图1E 可知,冰糖橙果皮超氧阴离子自由基清除率最高,达(91.67±2.21)%,其次为脐橙果皮,清除率为(85.05±3.49)%,显著高于对照陈皮及其余6 种样品(P<0.05)。
2.3.1 8 种柑橘果皮营养指标含量与抗氧化能力相关性分析
皮尔逊相关性分析常用于评估两个指标间的相关程度[24]。通过Origin 2021 软件将8 种柑橘果皮的营养指标含量与抗氧化能力进行皮尔逊相关性分析,结果见图2。
图2 8 种柑橘果皮营养指标含量与抗氧化能力相关性分析
Fig.2 Pearson correlation analysis of nutritional indicator content and antioxidant capacity of eight citrus peels
黑色和灰色椭圆分别表示两个指标间相关性呈正相关和负相关,椭圆越扁,相关性越强。
由图2 可知,柑橘果皮橙皮苷、总黄酮和维生素C含量与样品抗氧化能力、自由基清除率呈现出一定正相关性,尤以样品总黄酮含量与DPPH 自由基清除率相关性最高,相关系数达0.96。
2.3.2 8 种柑橘果皮营养品质主成分分析和聚类分析
根据营养指标含量和抗氧化能力测定结果,构建8 种柑橘果皮营养价值和抗氧化能力分类模型,结果如图3 所示。
图3 8 种柑橘果皮主成分分析及聚类分析
Fig.3 Principal component analysis and cluster analysis of eight citrus peels
A.8 种柑橘果皮主成分分析;B.8 种柑橘果皮聚类分析;I 和II 表示根据Origin 2021 软件提供的“树状聚类热图”工具进行的聚类分析,将8 种柑橘分为I 和II 两类。
由图3A 可知,4 种宽皮柑橘果皮和4 种橙类柑橘果皮未完全分离,表明8 种柑橘果皮营养品质和抗氧化能力差异较小。由图3B 可知,当距离约为5 时,可将8 种样品分为两类,第1 类包括脐橙、血橙、蜜香橙、冰糖橙和不知火,第2 类包括芦柑、沃柑和砂糖橘。
2.3.3 基于主成分分析模型的8 种柑橘果皮营养品质综合评价
根据主成分分析结果,以特征值大于1 为提取标准,共提取出5 个主成分,结果见表2。
表2 各主成分对8 种柑橘果皮综合品质的特征值和累计贡献率
Table 2 Eigenvalues and cumulative contribution of each principal component to the comprehensive quality of eight citrus peels
主成分(PC)PC1 PC2 PC3 PC4 PC5特征值(λ)5.69 3.68 2.56 2.24 1.10方差贡献率∕%35.54 22.97 15.98 14.01 6.88累计方差贡献率∕%35.54 58.51 74.49 88.50 95.38
由表2 可知,所提取的5 个主成分累计方差贡献率达95.38%,几乎可反映样品所有信息,可用这5 个主成分来评价8 种柑橘果皮的综合品质[25-26]。其中主成分1 包括水分、维生素C、总糖和粗脂肪含量,主成分2 包括铁离子抗氧化能力、还原力、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除率,主成分3 包括蛋白质、还原糖、灰分和果胶含量,主成分4 包括橙皮苷、总黄酮含量以及相对电导率和DPPH 自由基清除率,主成分5为还原糖含量。据此,根据标准化数据,采用SPSS 26.0 软件计算出每个样本的主成分得分,以F1、F2、F3、F4 和F5 表示。随后对各主成分的方差贡献率进行加权,并根据下列公式计算各样品综合得分。
Cq = F1 × Z1 + F2 × Z2 + F3 × Z3 + F4 × Z4 + F5 × Z5
式中:Cq 为样品综合得分;F1~F5 分别表示5 个主成分得分;Z1~Z5 分别表示分别表示5 个主成分的加权方差贡献率。
8 种柑橘果皮样品加权综合得分和排名见表3。
表3 8 种柑橘果皮营养品质综合得分及排名
Table 3 Comprehensive nutritional quality score and ranking of the eight citrus peels
F1 F2 F3 F4 F5样品砂糖橘沃柑芦柑不知火冰糖橙脐橙血橙蜜香橙得分-87.73-55.61-94.31-27.26 36.25 56.10 100.19 72.37排名排名排名排名排名排名76854312得分12.90-15.24 17.36-48.17 21.01 34.81-17.08-5.59 46382175得分20.74 0.50-14.71-6.91-0.34-6.88 4.20 3.40 14875623得分2.26-13.25 3.55 5.09 9.90-7.36 0.05-0.23 48321756得分-0.58 0.55 1.44-1.66-0.17-1.91 0.52 1.81 63275841综合评价得分-25.56-25.97-32.63-22.22 19.77 26.78 33.73 26.11 67854213
由表3 可知,4 种橙类柑橘冰糖橙、脐橙、血橙和蜜香橙果皮的综合营养品质均优于4 种宽皮柑橘砂糖橘、沃柑、芦柑和不知火果皮,表明橙类柑橘果皮与宽皮柑橘类果皮相比,橙类柑橘果皮具有更好的营养价值和抗氧化活性;而橙类柑橘果皮样品中综合得分由高到低排序为血橙>脐橙>蜜香橙>冰糖橙,表明8 种柑橘果皮样品中,血橙果皮营养价值最高、抗氧化能力最高,综合营养品质最优。
本研究结果表明,8 种柑橘果皮营养价值较高、抗氧化能力较强。皮尔逊相关性分析结果显示柑橘果皮橙皮苷、总黄酮和维生素C 含量与样品抗氧化能力呈现出一定正相关性,其中总黄酮含量与DPPH 自由基清除率相关性最高,相关系数达0.96。主成分分析结果表明8 种柑橘果皮间差异较小,聚类分析将其分为两类。综合评价模型结果显示,橙类柑橘果皮综合营养品质均优于宽皮柑橘,表明相较于宽皮柑橘果皮,橙类柑橘果皮具有更优的营养品质,橙类柑橘果皮中又以血橙果皮综合营养品质得分最高,综合得分的大小排序为血橙>脐橙>蜜香橙>冰糖橙,表明8 种柑橘果皮中,血橙果皮营养价值和抗氧化活性最佳。综上所述,这些发现揭示了8 种柑橘果皮的潜在健康益处,有助于指导以柑橘果皮为主要原料制备新型功能性食品和天然抗氧化剂的研发,也可为柑橘果皮在食品领域的深度开发利用提供数据支持和理论参考。
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