清酒乳杆菌是食品发酵中的常用菌，是食品用乳酸菌目录里重要的菌种之一，多应用于发酵肉制品、乳制品[1]、蔬菜类食品[2]，具有改变食品风味、口感和产细菌素等功能[3-4]。由于清酒乳杆菌在发酵食品中的突出特点，其已被发酵食品行业广泛应用，但菌体密度不高限制了其使用范围，将清酒乳杆菌制备成直投式发酵菌剂，有利于解决上述缺陷。直投式发酵菌剂是传统发酵食品实现工艺现代化改造过程的关键[5]，高密度菌体是制备直投式菌剂的核心技术，培养基优化是提高菌密度的最常见的应用方法[6-7]。
目前国内外对清酒乳杆菌的培养基优化的研究较少，大多采用MRS 培养基或者在MRS 培养基基础上进行改良来增加乳酸菌数量[8]。杨瑞冬等[9]在MRS 培养基基础上优化氮源、碳源、缓冲盐体系，使布氏乳杆菌IMAU80233 发酵液活菌数达3.81×109 CFU/mL；高欣伟等[10]在MRS 培养基基础上优化碳氮比，使长双歧杆菌CCFM 687、CCFM 1029 和FGSZY 17L7 最高活菌数 分 别 达 到10×1010、9.4×1010、7.9×1010 CFU/mL，是MRS 基础培养基的50 倍～70 倍；张娜等[11]在MRS 培养基基础上优化葡萄糖、玉米浆、乙酸钠等营养成分，使干酪乳杆菌菌体生物量OD600 值达到3.686，比优化前的MRS 培养基提高了81.8%。
综上，低成本、高收益、易配制且增菌效果优良适合大规模生产的优化工艺成为研究的热点。在培养基优化过程中，主要集中在对碳源和氮源的优化[12]，不同乳杆菌菌株的营养需求也不同。本研究以发酵谷物筛选的清酒乳杆菌为出发菌株，利用响应面法优化该菌株生长的培养基配方，为清酒乳杆菌工业化生产提供方法借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯玉米发酵液：黑龙江省哈尔滨市阿城区农户。
MRS 肉汤、MRS 培养基、蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、乳酸菌营养素、胃蛋白胨、全胃蛋白胨、血粉蛋白胨、脑心浸粉、牛肉浸粉、葡萄糖：北京奥博星生物技术有限公司；柠檬酸三铵、乙酸钠、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸镁：天津市天力化学试剂有限公司；吐温-80：天津市瑞金特化学品有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
MRS 肉汤培养基：蛋白胨10.00 g/L，牛肉粉5.00 g/L，葡萄糖20.00 g/L，酵母粉4.00g/L，乙酸钠5.00 g/L，磷酸氢二钾2.00 g/L，硫酸镁0.20 g/L，柠檬酸三铵2.00 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温-80 1.0 mL。
1.2 仪器与设备
DHP-微生物恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；DL-CJ-1NDII 洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；YXQ-A 立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；VORTEX2 漩涡混匀器：德国IKA（中国）有限公司；BSA124S-CW 分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；FE28-standad 台式pH仪：梅特勒-托利多科技（中国）有限公司；BLBI0-5SJ-2 5L 发酵罐：上海百伦生物科技有限公司；CN-SN2105水浴锅：巩义市予华仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种筛选
取糯玉米发酵液用梯度稀释法稀释适当倍数，将稀释液涂布于乳酸菌筛选培养基平板上，37 ℃培养24 h。用接种环挑取有颜色变化的菌株划线分离，培养后挑取单菌落保藏于脱脂乳冻干，编号为B.2103。
1.3.2 菌株的鉴定
通过生理生化试验、菌落和菌株形态观察及16S rRNA 测序鉴定菌株。使用DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后测序。通过GenBank 数据做同源性分析，使用MEGA7.0 软件构建系统发育树[13-14]。
1.3.3 菌株活化、纯化、传代和种子液制备
保藏在-80 ℃清酒乳杆菌菌粉于MRS 培养基中划线分离，37 ℃培养12 h，挑取单菌落划线分离，如此重复3 次完成菌种的活化和纯化；挑取单菌落接入5 mL液体培养基，37 ℃培养16 h。再以2%（体积分数）的接种量接入到250 mL 的MRS 肉汤培养基中，37 ℃培养16 h，发酵液在4 ℃、8 000×g 的条件下离心10 min，弃上清液，菌泥用无菌蒸馏水在相同的离心条件下洗涤2 次。最后，菌泥用相同发酵液体积的无菌蒸馏水重悬，得到的菌悬液作为后续发酵的种子液。
1.3.4 活菌数测定
参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行活菌数的测定[15]。
1.4 发酵培养基成分确定单因素试验
1.4.1 碳源种类和添加量对清酒乳杆菌活菌数影响
分别以20.00 g/L 的葡萄糖、乳糖、果糖、海藻糖、大豆低聚糖、低聚异麦芽糖和蔗糖作为基础发酵培养基中的碳源进行发酵培养，以活菌数为指标，确定最佳碳源种类。设置碳源添加量分别为0、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00、40.00 g/L，以活菌数为指标，确定碳源添加量。
1.4.2 氮源种类和添加量对清酒乳杆菌活菌数影响
分别以10 g/L 的大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、乳酸菌营养素、胃蛋白胨、全胃蛋白胨、血粉蛋白胨、脑心浸粉和牛肉浸粉作为基础发酵培养基中的氮源进行发酵培养，以活菌数为指标，确定最佳氮源种类。设置酵母浸粉添加量分别为0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00 g/L 及鱼蛋白胨添加量分别为0、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 g/L，以活菌数为指标，确定氮源添加量。
1.4.3 无机盐添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响
根据预试验中清酒乳杆菌对无机盐的偏好性，基础培养基的条件下，将柠檬酸三铵和磷酸二氢钾分别以浓度为0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L 进行添加，硫酸锰与硫酸镁分别以0、0.048、0.096、0.144、0.192、0.240、0.288、0.336 g/L 进行添加，以活菌数为指标，确定无机盐添加量。
1.4.4 吐温-80 添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响
将基础发酵培养基中的吐温-80 分别按0、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL/L 进行添加，以活菌数为指标，确定吐温-80 添加量。
1.5 发酵培养基配方优化的响应面试验
以单因素试验结果为基础，确定对清酒乳杆菌活菌数具有明显影响的3 个因素鱼蛋白胨添加量、葡萄糖添加量、酵母浸粉添加量，以发酵液活菌数（Y）作为响应值，采用Design-Expert 10.0.1 软件，应用Box-Behnken 方法设计试验组合，优化增殖清酒杆菌的最佳发酵条件，因素与水平见表1。
表1 响应面设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface design
水平因素A 鱼蛋白胨添加量/（g/L）B 葡萄糖添加量/（g/L）C 酵母浸粉添加量/（g/L）-1 15.00 30.00 7.50 0 10.00 25.00 5.00 1 5.00 20.00 2.50
1.6 数据处理
采用OriginPro 2019b、MEGA7.0 和Design Expert V 8.0.6.1 软件作图和试验数据与结果分析。
2 结果与分析
2.1 菌株鉴定
2.1.1 菌株形态学观察
菌株B.2103 菌落和菌体形态见图1。
图1 B.2103 菌落和菌体形态
Fig.1 Colony and cell morphology of strain B.2103
a.单菌落平板划线，30 ℃下培养36 h 的菌落形态；b.单菌落通过革兰氏染色的菌体形态。
由图1a 可知平板上的单菌落呈乳白色、有光泽、圆形、菌落较大、湿润、边缘整齐、易挑起；由图1b 可知，菌株在显微镜下呈短杆状、两端钝圆、链状、革兰氏染色呈阳性。
菌株B.2103 采用乳酸菌成套生化鉴定管进行生理生化试验鉴定结果见表2。
表2 菌株B.2103 生化结果鉴定结果
Table 2 Biochemical test results of strain B.2103
注：+表示可利用（阳性）；-表示不可利用（阴性）
七叶苷 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 蔗糖 棉子糖 菊糖 乳糖 液化明胶 过氧化氢-++-+-+-++-+
由表2 可知，在菌株B.2103 的碳源同化试验中纤维二糖、麦芽糖、水杨苷、蔗糖、菊糖、乳糖均能被利用，七叶苷、甘露醇、山梨醇、棉子糖不能被利用，菌株对液化明胶试验为阴性，过氧化氢试验为阳性，通过菌落形态和生理生化试验进行初步判断菌株B.2103为乳酸菌。
2.1.2 分子鉴定
菌株B.2103 与相关菌株16S rRNA 进化树的同源性分析见图2。
菌株B.2103 测序的全长序列为1 468 bp，在美国国家生物技术信息中心核酸系列数据库中通过BLAST进行同源序列比对，下载相似性较高的乳杆菌的相关序列，通过MEGA 7.0 软件进行系统分析并构建系统发育树[16]。根据图2 结果显示菌株B.2103 为Lactobacillus菌属，其中菌株B.2103 与菌株MT611762.1 的相似性达到99%。通过菌种细胞形态、生理生化、16S rRNA基因序列，参考《伯杰氏系统细菌学手册》可以认为菌株B.2103 为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）。
图2 B.2103 菌株与相关菌株16S rRNA 进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of B.2103 and related strains based on the 16S rRNA sequences
2.2 发酵培养基成分的确定
2.2.1 碳源对活菌数的影响
碳源种类对清酒乳杆菌活菌数的影响见图3，葡萄糖添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响见图4。
图3 不同碳源对活菌数的影响
Fig.3 Effects of different carbon sources on viable bacterial count
图4 葡萄糖添加量对活菌数的影响
Fig.4 Effect of glucose addition on viable bacterial count
由图3 可知，葡萄糖作为碳源时，清酒乳杆菌的活菌数为1.50×109 CFU/mL，明显高于其他糖类物质，可能原因是葡萄糖分子为单糖，且易进入清酒乳杆菌细胞内部，能够快速被菌体利用，因此选择葡萄糖作为清酒乳杆菌的最适碳源。从图4 可知，清酒乳杆菌活菌数随着培养基中葡萄糖的添加量不断增加，呈现先增加后降低的变化趋势，葡萄糖的添加量为25.00 g/L时活菌数最高，达到了1.80×109 CFU/mL。这可能是因为当培养基中葡萄糖添加量较低时不能满足菌体的生长需求，碳源不足，影响菌体生长繁殖，故活菌数较低；当培养基中葡萄糖的添加量较高时会形成高渗透压的环境，导致清酒乳杆菌的活菌数较低，这与李翠凤等[17]研究的嗜酸乳杆菌Z-43 高密度发酵配方及关键工艺条件优化中的结果一致。根据本试验结果，选定培养基中碳源为葡萄糖，且葡萄糖的添加量为20.00 g/L～30.00 g/L。
2.2.2 氮源对活菌数的影响
氮源种类对清酒乳杆菌活菌数的影响见图5，酵母浸粉添加量和鱼蛋白胨添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响见图6 和图7。
图5 不同氮源对活菌数的影响
Fig.5 Effects of different nitrogen sources on viable bacterial count
图6 酵母浸粉添加量对活菌数的影响
Fig.6 Effect of yeast extract powder addition on viable bacterial count
图7 鱼蛋白胨添加量对活菌数的影响
Fig.7 Effect of fish peptone addition on viable bacterial count
由图5 可知，当鱼蛋白胨、酵母浸粉作为氮源时活菌数较高，最高分别为1.850×109 CFU/mL、1.350×109 CFU/mL，其余依次为酪蛋白胨、血粉蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨等，这可能是因为鱼蛋白胨中含有大量的清酒乳杆菌所需要的氨基酸或肽段。相较与其它氮源鱼蛋白胨对清酒乳杆菌的活菌数影响明显，且酵母浸粉性价比较高，具有经济实惠的优势，因此选择鱼蛋白胨、酵母浸粉进行后续试验[18-19]。从图6 与图7 可知，清酒乳杆菌活菌数随着鱼蛋白胨、酵母浸粉添加量增加，呈现出先增加后减少的趋势，当酵母浸粉添加量为5.00 g/L 时活菌数最多，达到了1.670×109 CFU/mL，当鱼蛋白胨添加量为10.00 g/L 时活菌数最高，达到了1.800×109 CFU/mL，这可能是因为清酒乳杆菌在菌体繁殖过程需要足够的氮源，浓度较低导致微生物营养不充分，影响生长繁殖，但氮源浓度过高促使有机酸的快速积累，不利于菌体繁殖[20-22]。根据本试验结果，选择酵母浸粉、鱼蛋白胨作为优化发酵培养基氮源，酵母浸粉、鱼蛋白胨添加量分别为2.50 g/L～7.50 g/L、5.00 g/L～15.00 g/L。
2.2.3 无机盐添加量对活菌数的影响
磷酸氢二钾、柠檬酸三铵的添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响见图8，Mn2+、Mg2+的添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响见图9。
图8 柠檬酸三铵与磷酸二氢钾添加量对活菌数的影响
Fig.8 Effects of ammonium citrate tribasic and potassium dihydrogen phosphate addition on viable bacterial count
图9 Mn2+、Mg2+添加量对活菌数的影响
Fig.9 Effects of Mn2+and Mg2+addition on viable bacterial count
从图8 中可知，清酒乳杆菌活菌数随着基础培养基中缓冲盐柠檬酸三铵与磷酸二氢钾的添加量增加，呈现先上升后下降趋势。当柠檬酸三铵添加量为1.50 g/L 时活菌数达到最高为5.70×108 CFU/mL。当磷酸二氢钾添加浓度在2.50 g/L～3.00 g/L 时，清酒乳杆菌活菌数快速下降，之后趋于平稳，磷酸二氢钾添加量为2.00 g/L 时，活菌数最高，达到了5.50×108 CFU/mL。因此，柠檬酸三铵与磷酸二氢钾最适添加量分别是1.50 g/L与2.00 g/L。
从图9 可知，清酒乳杆菌活菌数随着基础培养基中硫酸镁、硫酸锰的添加量增加，总体呈现先上升后下降的趋势。当硫酸锰添加量继续升高时，清酒乳杆菌的活菌数快速上升后下降，且最适添加量为0.12 g/L，活菌数最高，达到了5.10×108 CFU/mL。硫酸镁添加量继续升高时，活菌数平稳上升后快速下降，当此时硫酸镁添加量为0.20 g/L 时，活菌数最高，达到了5.25×108 CFU/mL。这可能是因为Mg、Mn、Fe、Cu 等微量元素在微生物生长过程中，作为酶的激活剂或生物活性物质的组成成分是不可或缺的，但需要量及其微小[23]。因此，选择硫酸锰、硫酸镁最适添加量分别为0.12 g/L、0.20 g/L。
2.2.4 吐温-80 对活菌数的影响
吐温-80 添加量对清酒乳杆菌活菌数的影响见图10。
图10 吐温-80 添加量对活菌数的影响
Fig.10 Effect of Tween-80 addition on viable bacterial count
根据图10 可知，清酒乳杆菌活菌数随着吐温-80添加量增加，呈现先增加后降低的趋势，吐温-80 添加量在1.00 mL/L 时，活菌数最高，为5.88×108 CFU/mL。这可能是因为吐温-80 作为表面活性剂，添加到乳酸菌生长培养基中，可以增加细胞表面流动性，提高了细胞利用增殖环境中的营养物质，若过量添加会产生毒性[17]。因此选择吐温-80 最适添加量为1.00 mL/L。
2.3 响应面设计结果与分析
2.3.1 响应面试验结果
响应面优化试验结果见表3。
表3 中心组合设计试验结果
Table 3 Results of the central composite design experiment
序号 A 鱼蛋白胨添加量B 葡萄糖添加量C 酵母浸粉添加量活菌数/（×108 CFU/mL）1 -1 1 0 12 2 0 1 -1 16 3 0 -1 1 18 4 0 -1 -1 24 5 -1 0 1 12 6 0 0 0 39 7 0 0 0 42 8 1 -1 0 23 9 0 0 0 45 10 -1 -1 0 12 11 1 1 0 25 12 1 0 -1 43 13 0 0 0 46 14 0 0 0 42 15 0 1 1 25 16 -1 0 -1 18 17 1 0 1 25
根据Design-Expert 软件对试验数据进行多元回归分析得到多元回归方程：Y=43.00+7.75A+0.87B-3.38C+0.5AB-3AC+5.25BC-9.87A2-15.12B2-8.63C2。
失拟项反映了试验数据与模型之间的差异，由表4 可知，失拟项P 值=0.124 4＞0.05，失拟项不显著。C、C2、A2 对清酒乳杆局菌活菌数具有显著性影响（P＜0.05），A、B2 对活菌数影响为极显著（P＜0.001），交互相AB、AC 影响不显著，BC 具有显著性（P＜0.05）；通过F值可知各因素影响大小顺序为鱼蛋白胨添加量（A）＞酵母浸粉添加量（C）＞葡萄糖添加量（B）。该模型的决定系数R2=0.959 0，校正因子R2=0.906 4，表明该模型适合实际情况。因此，该模型可用于清酒乳杆菌的实际增殖培养中。鱼蛋白胨（A）、葡萄糖（B）和酵母浸粉（C）最佳添加量分别为14.41 g/L、27.94 g/L 和6.48 g/L，活菌数预测值为3.299 4×109 CFU/mL。
表4 回归模型方差分析
Table 4 ANOVA of the regression model
注：*表示在P＜0.05 水平上影响显著；**表示在P＜0.001 水平上影响极显著。
?
2.3.2 响应面优化试验预测结果验证
为了验证清酒乳杆菌优化培养基实际生产效果与预测值的真实性，按照响应面优化结果以鱼蛋白胨14.50 g/L、酵母浸粉6.50 g/L、葡萄糖28.00 g/L、柠檬酸三铵1.5 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.12 g/L、吐温-80 1.00 mL/L 的添加量配制培养基，在5 L 发酵罐中以30 ℃、pH6.0、接种量为2%、发酵时间为18 h，以MRS 基础培养基为对照进行3 次重复验证试验，结果表明：MRS 培养基的活菌数最高达到了1.980×108 CFU/mL，优化培养基活菌数最高达到了3.125×109 CFU/mL，优化培养基比基础MRS 培养基的活菌数提高了1 478.28%。同时优化培养最高活菌数与响应面模型预测值非常接近，表明该模型能很好地预测实际的发酵情况。
2.3.3 5 L 发酵罐中清酒乳杆菌生长曲线分析
清酒乳杆菌在优化培养基与MRS 基础培养基的生长曲线见图11。
图11 清酒乳杆菌B.2103 的生长曲线
Fig.11 Growth curve of Lactobacillus sakei B.2103
由图11 可知，在优化培养基发酵液中，随者发酵时间延长，清酒乳杆菌的活菌数在0～4 h 时，缓慢生长，在6 h～14 h 时，成倍数生长，14 h～18 h 生长速度逐渐减缓，18 h 后趋于平稳，活菌数不再增加。所以清酒乳杆菌发酵培养最佳时间为18 h，此时活菌数最高，达到了3.125×109 CFU/mL。
3 结论
本试验从阿城农户糯玉米发酵液中筛选出一株乳酸菌，通过16s rRNA 鉴定为清酒乳杆菌。同时对该菌株进行培养基成分及添加量的优化研究，根据试验结果优化培养基为：鱼蛋白胨14.50 g/L、酵母浸粉6.50 g/L、葡萄糖28.00 g/L、柠檬酸三铵1.5 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.12 g/L、吐温-80 1.00 mL/L，培养条件为30 ℃、pH6.0、接种量为2%、发酵时间为18 h，此条件下，活菌数最高，达到了3.125×109 CFU/mL，相比MRS 基础培养基活菌数量提高1 478.28%。优化后的培养基的增菌效果显明显，可以显著提高生产发酵水平。
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