茯苓（Poria cocos）为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，是我国重要的传统药物之一[1]。作为一种药食同源的物质，我国传统医学认为茯苓有利水渗湿、健脾和宁心的功效，可以用来治疗水肿、小便不利等。研究发现，茯苓中多糖成分约占菌核干重的70%～90%[2]，其余为三萜类化合物、甾体类、蛋白质等成分[3]。自20世纪70年代报道茯苓多糖抗肿瘤作用以来[4]，茯苓多糖的功效报道集中于免疫活性调节、抗肿瘤、抗氧化等作用[5]。茯苓中的多糖不易溶于水，经过结构改性后得到溶于水的茯苓多糖，抗肿瘤活性得以提高[6-7]。因此，研究如何高效提取茯苓多糖及后续的活性、结构研究成为研究的热点。本文综述了茯苓多糖的提取、结构研究、功能活性机制及安全性的研究进展。
1 茯苓多糖的制备及结构研究
1.1 茯苓多糖及多糖衍生物的制备方法
茯苓多糖的制备方法包括溶剂法、酶解法和物理辅助法等见表1。茯苓多糖不易溶于水，衍生化后不仅提高茯苓多糖的溶解度，还增强生物活性[8]。茯苓多糖的纯化方法与其它多糖基本一致，主要包括蛋白质的脱除、茯苓多糖的脱色和酸性与中性茯苓多糖的分离等，采用的纯化技术分别为Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸沉淀法、双氧水氧化法和离子交换法、二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纤维素柱层析等[9]。
表1 茯苓多糖的提取方法
Table 1 Extraction method of Poria cocos-derived polysaccharides
注：-表示无相关数据。
参考文献溶剂法提取方法 特点 优缺点 得率或取代度工艺水提 茯苓粉→热水回流提取→浓缩→醇沉→干燥→茯苓粗多糖水溶性多糖 以水为溶剂，成本低、无毒、操作安全；所需时间长，得率较低1.3% [10-11]碱提 茯苓粉→碱液→提取液用醋酸中和→醇沉→干燥→茯苓粗多糖碱溶性多糖 低温下进行，多糖得率高；水难溶 80% [12-13]酶解法茯苓粉→加缓冲溶液→加酶→升温→灭酶→抽滤→醇沉→茯苓粗多糖条件温和，专一性强水溶性多糖得率高；限制提取温度、pH值、时间及酶浓度等3.56% [14]发酵醇沉法胞内多糖 发酵液→菌丝体→碱液→浓缩→胞内多糖 快速获得预期多糖产量大，可大批量生产；总糖含量较天然茯苓多糖低胞外多糖 发酵液→上清液→浓缩→醇沉→胞外多糖- [15]物理辅助法超声辅助 茯苓粉→浸泡→超声辅助提取→浓缩→茯苓粗多糖 利于多糖溶出操作简单、提取速度快；得率不高 5.58% [16]微波辅助萃取茯苓粉→浸泡→微波辅助提取→浓缩→茯苓粗多糖 多糖活性高 受热均匀、方便、高效、安全、节能；得率不高2.96% [17]超临界CO2萃取茯苓粉→超临界二氧化碳提取→茯苓粗多糖 水溶性茯苓多糖低温、周期短、传质快、渗透力强；一次性投资大、运行成本高，水溶性成分的提取有局限性3.104% [18]衍生化羧甲基化 水媒法：茯苓粉→碱液→氯乙酸取代→醇沉→干燥→羧甲基茯苓多糖抗肿瘤、增强免疫、抗氧化、抗放射、抗病毒、保肝、催眠作用0.4～1.21 [19]溶媒法：茯苓粉→碱溶→加醇→氯乙酸取代→中和→醇沉→干燥→羧甲基茯苓多糖硫酸化 氯磺酸-吡啶法：吡啶→冷却→加茯苓聚糖→氯硫酸取代→除吡啶→中和→浓缩→干燥→硫酸化茯苓多糖抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、免疫增强作用0.34～0.96 [20]磷酸化 茯苓粉→茯苓多糖馏分→磷酸化反应→透析→干燥→磷酸化茯苓多糖抗氧化、抗肿瘤作用 0.056～0.153[21]
1.2 茯苓多糖的结构研究
来自茯苓菌核和菌丝体的茯苓多糖大多是以β-（1→3）-糖苷键为主链，伴有少量 β-（1→6）-糖苷键的分支葡聚糖[22]。然而，也有新型结构茯苓多糖发现的报道，如黄灿等[23]采用水提醇沉法提取得到的抗肿瘤活性茯苓多糖，是以（1→6）-糖苷键为主链，（1→4）-糖苷键为支链的α-型和β-型吡喃糖，其中吡喃糖包括甘露糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖和半乳糖。茯苓多糖的二级、三级和四级结构称为茯苓多糖的高级结构。茯苓多糖中以β-（1→3）-葡聚糖为主链的高级结构在中性溶液中一般为三股螺旋构象[24]。目前，对于茯苓多糖的高级结构的研究较为困难，常用的方法有：刚果红法、扫描电子显微镜、原子力显微镜、圆二光色谱等，但对高级结构的表征都比较粗糙。
2 茯苓多糖的功能活性研究
2.1 免疫调节
近几年，茯苓多糖的免疫调节活性主要是研究茯苓多糖通过某些信号传导途径调节机体免疫功能[25-26]（如图1）。茯苓多糖不仅能提高机体的非特异性免疫功能，还能提高特异性免疫，包括体液免疫和细胞免疫，有利于血清免疫球蛋白A（immunoglobulin A，I－gA）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）的合成[27]。茯苓多糖通过促进巨噬细胞、B细胞和T细胞等免疫细胞产生免疫调节因子，进而刺激NK细胞、辅助性T细胞和杀伤T细胞等参与免疫调节[28-31]。此外，茯苓多糖还可以促使巨噬细胞上调诱导型一氧化氮合酶基因的表达[32]。目前发现，茯苓多糖在巨噬细胞中的信号传导有两条途径（图 2）：1）Ca2+/蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）/p38蛋白激酶/核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路可能参与茯苓多糖的免疫调节作用[25]；2）茯苓多糖激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR 4）信号通路，增加髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和肿瘤坏死因子受体相关因子 6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）的表达，从而增强下游TRAF 6/NF-κB信号转导，促进体内外的免疫调节和抗癌活性[26]。
图1 茯苓多糖对免疫系统的调控作用
Fig.1 Regulation effect of Poria cocos-derived polysaccharides on immune system
干扰素（interferon，IFN）；白细胞介素（interleukin，IL）；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）；辅助性 T（T helper cells，Th）细胞；杀伤 T（cytotoxic T cells，Tc）细胞；淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，LAK）。
图2 茯苓多糖在巨噬细胞中的信号传导途径
Fig.2 Signal transduction of Poria cocos-derived polysaccharides in macrophages
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）；c-JUN为一种转录调节因子；CD11b为一种整合素。
2.2 抗肿瘤作用
Liu X等[33]研究纯化后的羧甲基茯苓多糖对人结肠癌细胞（HT-29）、人肝癌细胞（HepG-2）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人胃癌细胞（SGC-7901）和人肺癌细胞（A549）的体外抗肿瘤活性，结果表明纯化得到的羧甲基茯苓多糖具有良好的抗肿瘤作用和抗炎作用。在小鼠实验中，羧甲基茯苓多糖（carboxymethyl pachymaran，CMP） 能有效地增强 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）对CT26荷瘤小鼠的疗效，同时减轻5-Fu所致的小鼠肝损伤，并认为羧甲基茯苓多糖的调控机制可能与NF-κB、NF-E2-相关核因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）及丝裂原活化蛋白激酶/P38蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶通路有关[34]。茯苓多糖促使宿主的噬菌体、T细胞、B细胞和NK细胞通过释放细胞因子增强免疫系统活性、上调凋亡相关基因的表达，进而使肿瘤细胞凋亡[35-37]（如图3）。其中，茯苓多糖既可以由Fas配体介导细胞凋亡，也可以由内源线粒体途径引发细胞的凋亡[38]。
图3 茯苓多糖的抗肿瘤机制猜想
Fig.3 Conjecture on the anti-tumor mechanism of Poria cocos-derived polysaccharides
磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）；N-乙酰氨基半乳糖转移酶-9（polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase 9，ppGalNac-T9）；唾液酸（sialic acid，SA）；酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）；磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶（phosphotyrosine protein phosphatase PTPP）；B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）；一种促进凋亡的蛋白（Bcl-2 assaciated X protein，Bax）；一种肿瘤坏死因子受体（factor associated suicide，Fas）。
2.3 抗氧化作用
茯苓多糖能升高机体组织中的超氧化物歧化酶活力并降低丙二醛含量，从而增强机体组织的抗氧化能力，降低脂质过氧化水平，其中胞内多糖的抗氧化活性优于胞外多糖和菌核多糖[39-40]。通过采用凝胶渗透色谱-示差检测-多角度激光光散射联用法检测羧甲基茯苓多糖的结构，并分析羧甲基茯苓多糖抗氧化活性的“构-效”关系，得出类球形羧甲基茯苓多糖的抗氧化活性较强，无规卷曲的活性最弱[41]。利用过氧化氢降解制备不同分子量的CMP研究其抗氧化与分子量之间的关系，表明随着分子量的降低CMP的抗氧化活性提高[42]。动物水平的研究发现硫酸化茯苓多糖（sulfation pachymaranon，SP） 对 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的神经元损伤具有神经保护作用，其潜在机制可能是提高脑组织抗氧化能力，减轻氧化应激反应[43]。
2.4 抗炎
茯苓多糖在肝炎和肠炎模型中均有抗炎作用。对茯苓多糖的抗炎机理进行研究发现，茯苓多糖对醋氨酚诱导的小鼠肝损伤之所以具有药理活性，可能是因为抑制了肝细胞中NF-κB途径的细胞凋亡和炎性应激[44]。采用蛋白质组学和代谢组学评估羧甲基茯苓多糖对三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎模型的干预作用，表明羧甲基茯苓多糖通过降低结肠炎小鼠血清中的促炎细胞因子水平，提高抗炎细胞因子水平对肠炎小鼠起到保护作用。一方面是通过脂肪酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信号通路等发挥抗炎作用；另一方面可通过油酸和二氢睾丸激素途径进行抗炎，进而降低肠炎的严重性[45]。石振国等[46]采用不同剂量的茯苓多糖灌胃大鼠，对大鼠肠道分别用逆转录聚合酶链反应技术（reverse transcription-polymerase chain reac－tion，RT-PCR）和蛋白质印迹法进行检测，结果发现茯苓多糖可减轻急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能损伤和炎性反应，可能是由于抑制了JANUS激酶2/信号转导因子和转录激活因子3通路，进而减少细胞因子的产生。在机体受到病原体入侵时，茯苓多糖能促进免疫因子分泌从而提高机体免疫系统的功能。但过度的免疫反应却会对机体自身造成伤害，炎症反应就是剧烈的免疫反应的结果之一。此时，茯苓多糖可能通过抑制白介素-6、肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达和抑制丝裂素活化蛋白激酶信号通路相关的磷酸化应激激活蛋白激酶和磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达进而达到抗炎效果[47]。
2.5 抗病毒
茯苓多糖的抗病毒活性主要集中于细胞层面的研究。王楠[48]研究证明羧甲基茯苓多糖钠对病毒所致的细胞病变具有抑制作用。采用细胞病变抑制试验方法分析了羧甲基茯苓多糖钠体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus－Ⅰ，HSV－Ⅰ）所具有的作用，证明羧甲基茯苓多糖钠量为2.0 mg/mL时，对HSV－Ⅰ所致猪肾传带细胞中的细胞病变有明显的抑制作用。以阿昔洛韦作为阳性对照，观察CMP的人肝癌HepG2.2.15细胞毒作用，并观察羧甲基茯苓多糖对肝纤维化小鼠细胞因子的影响，蛋白质印迹法检测Smad3和Smad7的表达结果显示，羧甲基茯苓多糖具有抑制乙型肝炎病毒，调节转化生长因子β/Smad信号转导通路等作用[49]。
2.6 抗菌
茯苓多糖还具有抗菌作用。茯苓多糖对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的抑菌性[50]。别蒙等[51]研究不同取代度（0.350～0.728）的羧甲基茯苓多糖的理化性质、结构表征及体外抑菌活性，认为羧甲基茯苓多糖取代度越高，其抑菌效果越好，且对革兰氏阳性菌的抑菌效果比阴性的要高。原因可能是羧甲基茯苓多糖的取代度越高，其水溶性及电位绝对值越高，进而破坏了细菌的细胞膜，抑制细菌的生长繁殖。此外，茯苓多糖与莲花种子中的低聚原花青素具有协同抗菌作用，一方面由于茯苓多糖和原花青素间的氢键、疏水性和静电相互作用使得二者混合物的电位发生变化，影响细菌细胞壁的电荷分布从而降低细胞壁的稳定性；另一方面茯苓多糖和原花青素的混合增加了氧化应激反应对细胞膜造成的损害[52-53]。
3 茯苓多糖的安全性研究
林丽霞等[54]在 3 个不同剂量组（400、200、100mg/kg）下研究灌胃茯苓多糖对小鼠一般行为、自发活动、睡眠时间、转棒运动及急性毒性反应的影响；在3个不同剂量组（352、176、88 mg/kg，十二指肠给药）下研究茯苓多糖对犬的影响，发现茯苓多糖对小鼠和犬均无明显影响。体内研究证实，SP灌胃小鼠给药的半数致死量为7.358 g/kg，属低毒性物质[55]。郑丽红等[56]按0.750、1.50、3.00 g/kg剂量的茯苓多糖均匀拌入饲料中连续喂养80只随机分组的远交群大鼠，发现微波辅助提取的茯苓多糖对大鼠无毒副作用。羧甲基茯苓多糖静脉注射小鼠的半数致死量为（3.13±0.14）g/kg，羧甲基茯苓多糖313 mg/（kg·d）静脉注射3个月，对犬没有呈现毒副作用；羧甲基茯苓多糖250 mg/kg腹腔注射小鼠没有出现突变、大鼠没有出现畸胎[57]。由此表明，茯苓多糖和羧甲基茯苓多糖毒副作用小。
4 展望
目前，茯苓多糖的提取分离和纯化技术较为成熟。但一些方面的研究还是相对比较薄弱，如由于缺乏测定茯苓多糖完整的高级结构的方法，目前主要是采用间接法进行测量，如刚果红法；还可以深入研究其它直观检测方法，如扫描电子显微镜和原子力显微镜等。对茯苓多糖的免疫调节、抗肿瘤、抗炎作用虽有较多的报道，但与茯苓多糖分子量、取代度、取代基团的构效关系研究尚浅。多糖结构与活性研究是学术界研究热点。然而，以β-（1→3）-D-葡萄糖为主链特征的一大类β-葡聚糖，其口服作用机制报道却很少，仅有的少量研究表明β-葡聚糖口服难以吸收。用荧光标记3种可溶性β-葡聚糖（laminarin、scleroglucan和glucan phosphate）对大鼠进行口服给药，尽管在血液中检测到了多糖被吸收，最终发现3种β-葡聚糖中最高的生物利用度仅为4.9%[58]；而人体口服400 mg β-葡聚糖（重均分子量为20 kDa）能增加唾液免疫球蛋白A水平，但在血液里检测不出β-葡聚糖[59]。至今为止，β-葡聚糖口服作用机制仍不清楚，使其功效作用常受到质疑、应用受阻，因此亟需开展β-葡聚糖的口服作用机制研究。茯苓多糖是一种典型的β-葡聚糖，在茯苓菌核中含量高，具有产业化应用的经济适宜性，可用于功能性食品的开发与应用。随着对茯苓多糖的研究更加深入，相信茯苓多糖未来在产业化中将会拥有广阔的前景。
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