我国是世界第一渔业大国[1]，也是鱼鳞鱼皮等副产物产出大国。2019年我国水产品总产量为6 480.36万吨，水产品加工企业达9323家，加工总量达2171.41万吨[2]。鱼鳞鱼皮按鱼体总重的10%～12%计，年产量预估可达200万吨以上。目前，水产品加工企业的鱼鳞鱼皮一般用于制作鱼饲料，价格低廉、加工利用率低、生物资源浪费严重[3-4]，因此亟需对其进行高值化转化和利用。鱼鳞鱼皮中富含高品质胶原蛋白，可用于食品、保健品、护肤品当中[5]。以鱼鳞鱼皮为原料制备胶原蛋白肽，不仅能够充分利用资源，提高其附加值，而且可以减少环境污染，对水产品加工业健康持续发展具有重要意义[6-7]。
目前，市场上胶原蛋白肽产品种类繁多，分子量在500 Da～2 500 Da不等[8]。传统的胶原蛋白肽主要从陆生动物的皮或骨骼中提取，如猪皮、牛皮。但由于一些人畜共患病、原料成本高、产品分子量大等原因，该来源的胶原蛋白肽已逐渐失去市场优势。鱼源肽具有来源安全、分子量小、易吸收、相容性好、刺激性小等优点[9]，逐渐成为食品、保健品、护肤品等市场中炙手可热的产品。其中，用鱼鳞鱼皮制备的生物活性肽，由于原料价格低廉、工艺简单可控、产品品质高等优势，成为鱼源肽加工的首选。
目前，国内外对胶原蛋白肽的相关研究主要集中在提取制备、结构鉴定和功能表征等方面，因此本文主要综述了鱼鳞鱼皮肽的制备方法、肽分离鉴定及生物活性等方面的研究进展，并对其市场前景进行了分析和展望。
1 鱼鳞鱼皮肽的提取方法
从鱼鳞鱼皮中提取胶原蛋白肽的方法主要包括酸法、碱法、酶法、热水法等。酸碱提取法是通过提取介质改变蛋白质的酸碱性，进而破坏其结构将肽提取出来[10]。酶法是通过酶切位点破坏被提取物原有结构进行提取。热水法是将原料经过前处理后在热水中进行提取的方法。鱼鳞前处理中需要注意灰分（羟基磷灰石）的脱除，鱼皮则需要注意脂肪的脱除[11]。
鱼鳞鱼皮胶原蛋白肽的主要提取方法见表1。
表1 鱼鳞鱼皮胶原蛋白肽的提取方法
Table 1 Extraction methods of collagen peptide from fish scales and skins
方法 介质 优点 缺点酸法 盐酸、醋酸、柠檬酸等 提取时间较短[12] 提取介质易残留，纯化过程复杂碱法 石灰水、氢氧化钠、碳酸钠等 提取时间较短[14] 提取介质易残留，破坏多肽原有结构酶法 植物蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶等 提取时间短，操作简单，不破坏肽的螺旋结构[13]产品颜色深、腥味重，后续需要脱色脱腥热水法 60℃～90℃去离子水 提取成本低[15] 提取效率低、产品分子量大复合法 酸、碱、酶 前处理较好，产品品质高 酸碱残留，需后续处理
由表1可知，酸法中常用盐酸、醋酸、柠檬酸等作为提取介质。王信苏等[12]研究表明，利用不同类型的酸提取草鱼鱼鳞胶原蛋白肽，提取效果由高到低分别为柠檬酸＞乳酸＞醋酸。酶法制备中常采用植物蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠萝皮蛋白酶等）、碱性蛋白酶、胰蛋白酶等，该方法对工艺中的温度、pH值、酶浓度等条件要求严格。杨贵兰等[13]利用胰蛋白酶酶解阿拉斯加鳕鱼皮制备降血压肽，获得最优酶解条件为温度40℃，酶与底物质量比 3%，料液比 1∶7（g/mL），pH7，酶解时间2 h。目前，鱼鳞鱼皮肽在实际生产中多采用复合提取的方式，即先利用酸对鱼鳞鱼皮进行脱钙脱杂，再利用碱使鱼鳞鱼皮脱腥脱臭并使其结构疏松，最后采用酶法酶解获得胶原蛋白肽。
2 鱼鳞鱼皮肽的膜分离
膜分离是以膜两侧压力差为驱动力的一种筛分过程[16]，在工业生产中可用于脱杂、除菌、除酶、脱盐、产品分级等。与传统的分离工艺相比，膜分离技术具有分离效率高、能耗小、选择性高等优势，可应用于蛋白肽的分离、提纯和浓缩。膜分离在工业化生产中一般采用多级耦联的模式，以达到连续除杂、分级和脱盐的效果。根据膜孔径或传质驱动力的不同，膜分离方式可以分为微滤、超滤、纳滤、反渗透等，其主要分类及用途见表2。
表2 分离膜的种类及用途
Table 2 Types and uses of separation membrane
注：/表示孔径范围不一，可根据实际产品确定。
用途微滤 0.1 μm～10 μm 去除细菌、霉菌、乳化物、悬浮物、胶体超滤 100 nm～200 nm 截留分子量1 000 Da～5×105Da的物质，去除脂肪、杂蛋白等大分子物质纳滤 1 nm～2 nm 截留200 Da～1 000 Da分子量的物质，可用于肽产品分级反渗透 ＜1 nm 可用于肽产品除盐、提纯、浓缩多级耦联膜 / 微滤、超滤、纳滤等联用，用于肽的连续化、规模化生产膜种类 孔径
膜分离主要用于目标物质的分离截留和功能验证。Sonklin等[17]利用超滤技术对粗分离的绿豆粕蛋白水解肽MMPH进行分级分离，得到4个部分，其中分子量小于1 kDa的F4表现出最高的DPPH自由基、超氧化物及羟基自由基清除活性和金属螯合活性。膜分离也可以和液相色谱技术结合，用于目标物质的筛选和鉴定。Wang等[18]对苍耳果实提取物利用超滤-高效液相色谱筛选出3种具有竞争性抑制酪氨酸酶的物质。Li等[19]利用超滤-液相质谱法筛选和鉴定人参提取物α-葡萄糖苷酶抑制剂。
3 鱼鳞鱼皮肽的序列鉴定及结构解析
3.1 序列鉴定
肽的鉴定可使用正交加速电喷雾串联质谱法（quadrupole-time of flight，Q-TOF）。测定过程中质谱条件常选用Ar作碰撞气体，N2作雾化气体。将需要鉴定的肽进行一级质谱扫描，得到电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS） 图，再从ESI-MS图中选出待测离子进行ESI-MS/MS分析，最后根据分析结果推导出肽段的氨基酸序列[20]。周明等[21]利用Q-TOF进行了12个组分峰的肽序列鉴定，其中，YGPQ、LSPY、AYPQ和AYLQQQ这4个肽段的总抗氧化能力比玉米低聚肽强。
3.2 二级结构测定
肽的二级结构测定可采用远紫外圆二色谱法[22]。先将选取的目标肽加热到指定温度后进行恒温保持，然后进行紫外波长（190 nm～250 nm）扫描，该方法要求每个肽至少重复扫描两次，求其平均值，再利用Pro-Date Viewer、CDNN 等软件测定构象[23-24]。
3.3 表面结构观察
肽表面结构的观察可使用原子力显微镜观察（atomic force microscope，AFM），AFM 可以直接测试物体表面，得到清晰度高、分辨率高的物体表面图像[25]。由于AFM不受样品导电性能的影响，测试过程中对样品表面无损害，同时还可以获得样品颗粒厚度等信息，多用于观测粉末状样品的表面结构[26]。AFM镜检可采用接触模式、非接触模式、轻敲模式及相位移模式观察[27]。Tinazli等[28]先利用接触模式AFM探针将已经吸附的蛋白质部分刮除得到图案化模板，再在模板上附着另外一种蛋白质，制备出功能性多蛋白复合体。甘田生[29]利用AFM对大肠杆菌外膜孔蛋白OmpF三聚体脂质膜表面进行观察，观察到表面小突起是连接到β链上的短肽环（含有2个～3个氨基酸）。
3.4 空间结构解析
肽空间结构的解析多采用核磁共振法。Roch等[30]利用核磁共振对抗菌肽Mytilin B结构进行研究，结果表明，Mytilin B分子结构是由4对二硫键将1段α-螺旋和2段β-折叠片稳定的特殊空间结构。此外，二维核磁共振（2D nuclear magnetic resonance，2DNMR）可将核磁共振中谱线强度、耦合常数及化学位移等参数表现在二维平面上，避免一维核磁中的信号重叠并且可以提供自旋核之间相互作用的信息，从分子水平分析肽的功能活性位点[31]。
4 鱼鳞鱼皮肽的生物学功能
4.1 鱼鳞鱼皮肽对黑色素的抑制
利用B16小鼠黑色瘤细胞可以验证鱼鳞鱼皮肽对黑色素的抑制情况[32]。将B16小鼠黑色素瘤细胞接种于含双抗的达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养、消化传代。待细胞附着后，进行黑色素含量、酪氨酸酶活性等测定。高雅倩等[33]在对α-促黑素诱导B16细胞模型中表明，棕榈酰三肽-5可以通过抑制酪氨酸酶活性降低黑色素水平。
4.2 鱼鳞鱼皮肽保湿功能的测定
成纤维细胞细胞增殖率、细胞透明质酸含量、胶原蛋白含量等指标能反映鱼鳞鱼皮肽的保湿功能。Sun等[34]从罗非鱼皮中鉴定出3个关键肽段GYTGL、LGATGL和VLGL，该肽段可以有效降低胶原蛋白的降解并能抑制紫外诱导的成纤维细胞基质金属蛋白酶 1（matrix metallopeptidase 1，MMP-1）活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）活性，促进人体成纤维细胞增值。Okawa等[35]水解胶原蛋白后得到Pro-Hyp、Cys-Thr-Gly两种寡肽，该肽段具有明显提高成纤维细胞中透明质酸合成的作用。邵茜等[36]通过MTT法比较了浓度为 10 μg/mL～1 000 μg/mL 的鳕鱼皮胶原肽、海蜇胶原肽、牛骨胶原肽对光老化皮肤成纤维细胞的影响。结果表明，鳕鱼皮胶原肽组成纤维细胞的增殖率要高于海蜇胶原肽组和牛骨胶原肽组。
4.3 鱼鳞鱼皮肽对皮肤的改善作用
通过对大鼠皮肤弹性、蛋白质含量、羟脯氨酸（Hyp）含量、皮肤含水量、皮肤组织中MMP-1含量等进行测定，表明羟脯氨酸的含量可直接反映真皮内纤维含量，与皮肤衰老状况呈正相关[37-38]。紫外线照射下皮肤中MMP-1含量升高导致胶原纤维合成受阻，胶原蛋白快速降解，皮肤弹性下降[39-40]。Chen等[41]通过小鼠实验得到平均分子量为1 200 Da的鳕鱼皮胶原蛋白肽可以抑制MMP-1的活性，有改善小鼠皮肤的作用。
5 鱼鳞鱼皮肽的应用前景与展望
本文对鱼鳞鱼皮肽的提取方法、分离提纯、序列鉴定、结构解析及其生物学功能进行了系统分析。目前鱼鳞鱼皮肽已广泛应用于医药、保健品、食品、日用化学品等领域，但仍存在高价值转化水平不高，产品单一，规模化智能化生产技术不够成熟等问题。在提取工艺方面，可应用一些新型提取工艺（超声波、超临界萃取、高压脉冲电场技术等）相互结合提高鱼鳞鱼皮肽提取率和工业化程度。此外，市场上肽的开发聚焦于分子量小于500 Da可被肠道直接吸收的小肽上，其产品功能性受到诸多质疑，可以考虑开发分子量3 000 Da～10 000 Da具有实际生物学活性的多肽。目前我国大健康产业蓬勃发展，蛋白质与肽类产品或将成为需求量最大的产品类型，确定肽的生产工艺与配方，集成产业化生产技术，进行目标生物活性肽的生产是极具市场前景的。因此，利用我国丰富的鱼鳞鱼皮资源，深入研究鱼鳞鱼皮肽的提取工艺和生物学功能，扩大应用范围，有利于改善我国鱼类副产物加工现状，促进我国鱼鳞鱼皮肽的产业发展。
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