莼菜（Brasenia schreberi），别称马蹄菜、水葵等，属睡莲科的莼属，多年生水生宿根草本植物[1]，广泛分布于东亚、大洋洲、西非和北美地区。莼菜是一种珍贵的水生蔬菜，富含多糖、蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素等，具有良好的食用和药用价值[2-3]。莼菜具有清热补血、润肺解毒、利尿消肿、健胃促消化、止泻止呕、增强免疫力、抗肿瘤、降三高、抗衰老等功效[4-5]，对胃溃疡、肿痛、黄疸和热痢等有治疗作用[6-8]，有“水中人参”、“美容佳蔬”和“抗癌佳品”之称[9]。莼菜多糖（Brasenia schreberi polysaccharide，BSP）是莼菜中含有的一种重要的生物活性成分，具有提高免疫力和改善亚健康的作用[10-11]。
目前，植物多糖的提取主要有热水浸提、酶解[12]、微波辅助、超声波辅助[13]和微波协同酶解[14]等方法，这些方法都各有优缺点。高压脉冲电场（high intensity pulsed electric fields，HPEP）是一种新兴的现代高新提取技术，其原理是利用瞬间脉冲高压破壁植物细胞壁，使细胞膜电位混乱，使其可逆或不可逆破裂，促进极性分子在细胞内定向排列，功效成分溶出。该技术具有非热性传递均匀、效率高、能耗低、环保等优点，广泛应用于天然产物功能成分的提取[15-19]。酶解法是利用酶破坏细胞壁，溶出功效成分。高压脉冲电场耦合复合酶技术是一种新型、先进的天然产物提取技术，具有提取率高、提取温度低、提取时间短、能耗低、对活性成分损伤小等优点[20-21]。然而，高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP的研究尚未见报道。因此，本研究采用高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化提取工艺，以期提高BSP提取率，为后续BSP的开发利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
莼菜（人工种植）：苏州东山东湖莼菜厂；纤维素酶（20 000 U/g）：河北利华生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：陕西源优生物科技有限公司；果胶酶（20 000 U/g）：北京蓝博斯特生物有限公司；硫酸、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、氢氧化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
DE-100型高精度双极高压静电场发生器：宁波新芝生物科技有限公司；RE-3000A旋转蒸发器：上海耀特仪器设备有限公司；760CRT紫外-可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；PE-28酸度计：北京梅特勒-托利多仪器有限公司；D2015W电动搅拌器：上海梅颖浦仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 莼菜粉的制备
将莼菜经氢氧化钠溶液脱去体外胶质后，再用清水淋洗，热风干燥，匀浆机剪切制得莼菜粉，备用。
1.3.2 BSP的提取
莼菜粉→按比例加水搅拌均匀→高压脉冲电场提取→取出调节pH值（柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液）→复合酶法提取→提取液Sevag法[22]脱蛋白→离心（5 000 r/min，10 min）→上清液减压浓缩→加乙醇沉淀（3倍体积95%乙醇）→静置（放入4℃冰箱，静置24h）→离心（5 000 r/min，10 min）→真空冷冻干燥→莼菜粗多糖。
1.3.3 BSP测定
BSP测定采用苯酚-硫酸法[23]。
1.3.4 BSP提取率计算
BSP提取率计算公式如下。
1.3.5 高压脉冲电场提取BSP试验设计
1.3.5.1 高压脉冲电场提取BSP的单因素试验设计
按1.3.2的方法，称取10 g莼菜粉5份进行高压脉冲电场提取BSP，研究不同因素对BSP提取率的影响。固定条件：料液比 1∶30（g/mL），电场强度 20 kV/cm，脉冲数8，提取时间30 min。分别设定料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），电场强度为 10、15、20、25、30 kV/cm，脉冲数为 2、4、6、8、10，提取时间为10、20、30、40、50 min，进行单因素试验。每组重复3 次，取平均值。
1.3.5.2 高压脉冲电场提取BSP的正交试验设计
在预试验和单因素试验的基础上，选取表1列出的4个因素，采用L9（34）正交试验优化提取工艺。试验水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design
水平（kV/cm） C脉冲数 D提取时间/min 1 1∶20 15 6 20 2 1∶30 20 8 30 3 1∶40 25 10 40因素A料液比/（g/mL）B电场强度/
1.3.6 高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP试验设计
1.3.6.1 高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP的单因素试验设计
经高压脉冲电场提取后，再按1.3.2的方法称取10 g莼菜粉5份耦合复合酶法提取BSP，研究不同因素对BSP提取率的影响。固定条件：复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶质量比为1∶1∶1）添加量 2.5%，酶解pH4.5，酶解温度50℃，酶解时间50 min。分别设定复合酶添加量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，酶解pH3.0、3.5、4.0、4.5 和 5.0，酶解温度 30、40、50、60、70℃，酶解时间 20、30、40、50、60 min，进行单因素试验。每组重复3次，取平均值。
1.3.6.2 高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP的正交试验设计
在预试验和单因素试验的基础上，选取表2列出的4个因素，采用L9（34）正交试验优化提取工艺。试验水平设计见表2。
表2 正交试验因素水平
Table 2 Factor levels table of orthogonal experimental design
水平H酶解时间/min 1 2.0 4.0 40 40 2 2.5 4.5 50 50 3 3.0 5.0 60 60因素E复合酶添加量/% F酶解pH值 G酶解温度/℃
1.3.7 数据处理
试验所得数据均为3个平行测定的结果的平均值。试验数据采用Excel整理，采用正交设计助手进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 高压脉冲电场提取BSP工艺条件优化
2.1.1 料液比对BSP提取率的影响
料液比对BSP提取率的影响见图1。
图1 料液比对BSP提取率的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the BSP extraction rate
由图1可知，BSP提取率随着溶剂用量的增加先升高后趋于平缓。这是因为溶剂用量增加，莼菜细胞与其接触面之间的浓度差增大，促进了多糖的浸出，提取率升高。但当溶剂用量达到一定值时，多糖基本完全被溶出，提取率不再显著升高，而趋于稳定。这与代名君等[24]的研究结果趋势相似。因此，料液比1∶30（g/mL）为佳。
2.1.2 电场强度对BSP提取率的影响
电场强度对BSP提取率的影响见图2。
图2 电场强度对BSP提取率的影响
Fig.2 Effect of electric field intensity on the BSP extraction rate
由图2可知，BSP提取率随着电场强度的增加先升高再降低。这是因为电场强度增加，莼菜细胞破坏增多，极性溶剂运动加快，进入细胞的溶剂增多，多糖溶出更易，提取率升高。当电场强度≥20 kV/cm时，过大的电场强度会使多糖降解，提取率降低。这与Wang Ke等[25]的研究结果趋势相似。因此，电场强度20kV/cm为佳。
2.1.3 脉冲数对BSP提取率的影响
脉冲数对BSP提取率的影响见图3。
图3 脉冲数对BSP提取率的影响
Fig.3 Effect of the number of pulses on the BSP extraction rate
由图3可知，BSP提取率随着脉冲数的增加先升高再降低。这是因为脉冲次数增加，电场作用于提取液的程度和频率增加，莼菜细胞破坏的程度和数量增加，提取率升高。当脉冲数≥8时，过大的电场和脉冲频率增强了多糖的电解，促使多糖部分降解，提取率降低。这与Zhou Yajun等[26]的研究结果趋势相似。因此，脉冲数8为佳。
2.1.4 提取时间对BSP提取率的影响
提取时间对BSP提取率的影响见图4。
图4 提取时间对BSP提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on the BSP extraction rate
由图4可知，BSP提取率随着提取时间的延长先升高后降低。这是因为提取时间增加，高压电场作用程度增加，细胞破裂程度和数量增多，提取率升高。当提取时间≥30 min时，细胞基本完全破裂，再继续延长提取时间，多糖结构会部分被破坏，提取率降低。这与周亚军等[27]的研究结果趋势相似。因此，提取时间30 min为佳。
2.1.5 高压脉冲电场提取BSP正交试验结果
高压脉冲电场提取BSP的正交试验结果见表3。
表3 正交试验结果
Table 3 The result of orthogonal experimental design
试验编号度/（kV/cm）C脉冲数D提取时间/min 1 1∶20 15 6 20 7.68 2 1∶20 20 8 30 8.53 3 1∶20 25 10 40 9.27 4 1∶30 15 8 40 10.28 5 1∶30 20 10 20 9.14 6 1∶30 25 6 30 10.73 7 1∶40 15 10 30 9.57 8 1∶40 20 6 40 9.11 9 1∶40 25 8 20 9.34 k1 8.493 9.053 9.390 8.647 k2 9.993 9.177 9.287 9.477 k3 9.417 9.673 9.227 9.780 R 1.500 0.620 0.163 1.133 A料液比/（g/mL）B电场强因素 BSP提取率/%
高压脉冲电场提取BSP的方差分析结果见表4。
表4 方差分析结果
Table 4 The variance analysis results
注：* 表示差异显著，P＜0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A料液比 3.435 2 83.780 19.000 *B电场强度 0.646 2 15.756 19.000 C脉冲数 0.041 2 1.000 19.000 D提取时间 2.065 2 50.366 19.000 *误差 0.04 2
由表3、表4结果分析可知，各因素影响关系为：A＞D＞B＞C。料液比和提取时间对BSP提取率的影响较大，达到显著水平，其它不显著。通过k值的分析，其最佳工艺参数为：料液比1∶30（g/mL），提取时间40 min，电场强度25 kV/cm，脉冲数6。在上述最佳条件下做验证试验，平行验证3次，BSP提取率为10.75%（3次平均值）。
2.2 高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP工艺条件的优化
在高压脉冲电场提取BSP的最佳工艺条件下，再进一步耦合复合酶法提取BSP。
2.2.1 复合酶添加量对BSP提取率的影响
复合酶添加量对BSP提取率的影响见图5。
图5 复合酶添加量对BSP提取率的影响
Fig.5 Effect of compound enzyme addition on the BSP extraction rate
由图5可知，BSP提取率随复合酶添加量的增加先升高再趋于稳定。这是因为，酶添加量的增加，加大了与底物接触面积，酶解更充分，多糖溶出增多，提取率升高。当复合酶添加量≥2.5%时，酶解反应基本完全，再继续增加添加量，多糖提取率也不会显著变化而是趋于稳定。HUYNH等[28]的研究也表明酶添加量过多，酶解已完全，对提取率影响不明显而趋于稳定。因此，复合酶添加量2.5%为佳。
2.2.2 酶解pH值对BSP提取率的影响
酶解pH值对BSP提取率的影响见图6。
图6 酶解pH值对BSP提取率的影响
Fig.6 Effect of enzymolysis pH value on the BSP extraction rate
由图6可知，BSP提取率随着酶解pH值的增大呈先升高再降低的趋势。这是因为，pH值是影响酶活性的重要因素之一，酶解反应在最适宜pH值时，酶活性最高，酶解最充分，提取率也最高，反之提取率降低。这与孟利娜等[29]的研究结果趋势相似。因此，酶解pH值为4.5最佳。
2.2.3 酶解温度对BSP提取率的影响
酶解温度对BSP提取率的影响见图7。
图7 酶解温度对BSP提取率的影响
Fig.7 Effect of enzymolysis temperature on the BSP extraction rate
由图7可知，BSP提取率随着酶解温度的升高呈先升高再降低的趋势。这是因为酶解温度升高，酶活性增强，酶解反应加快，多糖溶出增多，提取率升高；当酶解温度≥50℃后，酶活性开始降低，再继续增加酶解温度，部分酶会失去活性，提取率降低。这与李晓等[30]的研究结果趋势基本一致。因此，酶解温度50℃最佳。
2.2.4 酶解时间对BSP提取率的影响
酶解时间对BSP提取率的影响见图8。
图8 酶解时间对BSP提取率的影响
Fig.8 Effect of enzymolysis time on the BSP extraction rate
由图8可知，BSP提取率随着酶解时间的延长先升高再趋于平缓。这是因为，酶解时间过短，酶解程度较低，酶解不充分，多糖溶出不多；而酶解时间达到最佳时间后，酶解已经完全，再延长酶解时间，提取率也不会明显升高而趋于平缓。这与Sowbhagya等[31]的研究结果趋势基本相似。因此，酶解时间50 min最佳。
2.2.5 高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP正交试验结果
高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP正交试验结果见表5。
表5 正交试验结果
Table 5 The result of orthogonal experimental design
试验序号H酶解时间/min 1 2.0 4.0 40 40 10.51 2 2.0 4.5 50 50 11.64 3 2.0 5.0 60 60 10.43 4 2.5 4.0 50 60 12.25 5 2.5 4.5 60 40 12.19 6 2.5 5.0 40 50 11.83 7 3.0 4.0 60 50 10.64 8 3.0 4.5 40 60 11.56 9 3.0 5.0 50 40 9.71 k1 10.860 11.133 11.300 10.803 k2 12.090 11.797 11.200 11.370 k3 10.637 10.657 11.087 11.413 R 1.453 1.140 0.213 0.610 E复合酶添加量/%F酶解pH值因素 BSP提取率/%G酶解温度/℃
高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP的方差分析结果见表6。
表6 方差分析结果
Table 6 The variance analysis results
注：* 表示差异显著，P＜0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性E复合酶添加量 3.675 2 54.044 19.000 *F酶解pH值 1.967 2 28.192 6 19.000 *G酶解温度 0.068 2 1.000 19.000 H酶解时间 0.695 2 10.221 19.000误差 0.07 2
由表5、表6结果分析可知，各因素的影响顺序为：E＞F＞H＞G，复合酶添加量和酶解pH值对BSP提取率的影响较大，达到了显著水平，其它不显著。通过对k值的分析，高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP的最佳工艺参数为：E2F2G1H3，即复合酶添加量2.5%，酶解pH值4.5，酶解时间60 min，酶解温度40℃。在此最佳条件下进行验证试验，平行验证3次，得到BSP提取率为12.27%（3次平均值）。
3 结论
本试验为了比较单一提取方法提取BSP和复合提取方法提取BSP的不同，试验先进行高压脉冲电场法提取BSP，再进行高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP，并对其工艺进行优化，得到最佳工艺参数为：料液比 1∶30（g/mL），提取时间 40 min，电场强度 25 kV/cm，脉冲数6；然后再耦合复合酶法提取，复合酶添加量2.5%，酶解pH值4.5，酶解时间60 min，酶解温度40℃，该条件下，BSP提取率为12.27%。本试验所用的高压脉冲电场耦合复合酶法提取BSP，与单一的高压脉冲电场提取相比，其提取率明显提高，是一种新的提取BSP的方法，为后续BSP的开发利用提供基础。
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