金牡丹、金观音和黄观音为福建省茶叶科学研究所选育的高香种茶树品种，3种高香品种源自铁观音与黄棪为亲本人工杂交，属于中叶类，早生种。其中金牡丹和金观音为灌木型茶树，黄观音属于小乔木型[1]。茶叶香气方面，高香品种具有花果香馥郁的典型特征[2]，并存在香气类型的细微区别，故香气也可作为区分高香种茶树品种特性的重要依据。黄赟发现金牡丹春茶中浓度较高的挥发性组分为芳樟醇及氧化芳樟醇，金观音春茶中浓度较高的挥发性组分为棕榈酸和氧化芳樟醇[3]。王蔚等发现金观音中浓度较高的挥发性组分为1-戊烯-3-醇和2-甲基丁醛[4]。
对比传统工夫红茶制作工艺，乌龙茶的制作工艺更有利于高沸点的花果香的清新风味保留[5]，这是由于摇青工序中鲜叶内源酶水解糖苷配体，形成多种芳香醇和萜烯醇类芳香组分[6]。故本红茶与传统工夫红茶的制作工艺相比，在萎调过程中采用了乌龙茶的摇青工艺，以突出高香茶叶品种的香气特征。
香气活度值（odor active values，OAV）能够将气相色谱-质谱所测定的挥发性物质浓度，与每种挥发性物质的感官阈值相结合分析，此方法可有效评估单个挥发性成分对最终香气所做的贡献，且有助于构建关键香气成分和样品感官风味间的因果联系[7]。OAV值是样品中挥发性物质浓度与该物质香气阈值的比值，OAV值大于1则说明挥发性成分能被感官察觉，对茶样的整体香气有贡献[8]。目前尚未有文献针对不同种类高香种工夫红茶的香气组分OAV值的比较分析。
本文采用顶空固相萃取技术（hea-dspace solidphase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对3种高香种茶叶所制的成品红茶进行挥发性成分定性和定量检测，并通过挥发性成分的香气活力值（OAV）筛选出构成茶样中香气特征的关键香气成分。再通过偏最小二乘回归法（partial least squares regression，PLSR）评估高香种茶样关键香气成分与感官特征的相关性，探索构成高香种工夫红茶不同感官特征的香气化合物组成，为工夫红茶的香气品质控制和优化提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
高香种工夫红茶的茶样信息见表1。
表1 3种高香种茶样信息
Table 1 The detail information of three species of highly fragrant tea samples
编号 鲜叶嫩度 规格 茶树品种 产地 树龄 采摘时间1 1芽2叶 中开面 金牡丹 武夷山市毛岭碓生态茶园基地 5年 2017.4.20 2 1芽2叶 中开面 金观音 武夷山市毛岭碓生态茶园基地 5年 2017.4.20 3 1芽2叶 中开面 黄观音 武夷山市毛岭碓生态茶园基地 5年 2017.4.20
高香种工夫红茶制作流程为：鲜叶→萎调（摇青）→揉捻→发酵→烘焙→归堆→复火→毛茶，其工艺技术要点除萎调外，均参考自DB35/T 1505-2015《红茶加工通用技术规程》。摇青采用竹制圆筒式摇青机，装叶量为筒容积40%，转速30 r/min。摇青次数3次，分别历时3、5 min和10 min，促使茶叶碰撞细胞壁破损，促使内源酶释放。由福建省武夷山市中远生态茶业有限公司完成。
1.1.2 试剂
环己酮（色谱纯）：上海安谱科学仪器有限公司；C8-C40正构烷烃混标（色谱纯）：美国o2si公司。
1.2 仪器与设备
7820/5977A气质联用仪：美国Aglient公司；SPME-GC固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手动进样手柄、DVB/CAR/PDMS萃取头50 μm：美国Supelco公司；标准筛80目：上海精网筛滤器材有限公司；20 mL固相微萃取专用顶空瓶：上海安谱科学仪器有限公司；DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理方法
茶叶样品磨碎后过80目筛，称取3 g茶粉（精确值0.01 g）放入顶空瓶，迅速加入220 μL浓度为9.46 mg/kg的环己酮作为内标并密封瓶盖[9]。将顶空瓶在80℃恒温水浴中平衡30 min，每隔10 min动瓶身，然后将固相萃取头插入顶空瓶上部空间中萃取30 min。萃取结束后，将SPME纤维萃取头快速插入GC-MS进样口，250℃解吸 5 min[10]。
1.3.2 色谱条件
色谱柱：Agilent DB-5ms石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。
升温程序：起始柱温50℃，保持5 min，以5℃/min升至80℃，以2℃/min升至140℃，最后以5℃/min升至 210℃，保持 5 min；载气（He）流速 1 mL/min，进样口温度250℃；不分流模式[11-13]。
1.3.3 质谱条件
电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；全扫描模式，扫描质量范围40 m/z～400 m/z。
1.3.4 定性分析
正构烷烃混标1 μL液体进样，1∶10分流模式，按照香气成分测定时的程序升温进行分析，测定其相同升温程序下的保留时间，利用C8-C40正构烷烃的保留时间换算RI值，将所得的RI值与相关文献中对应的RI值进行比较来进一步确定化合物。
式中：RI为待分析挥发性物质的保留指数；n为待分析物前正构烷烃的碳原子数；ta为待分析物的保留时间，min；tn为待分析物前正构烷烃的保留时间，min；tn+1为分析物后正构烷烃的保留时间，min。（待分析物a的保留时间落在正构烷烃tn和tn+1之间）。
1.3.5 定量分析
根据对茶叶挥发性风味化合物进行分离鉴定时添加内标的量，逐一将茶叶挥发性风味化合物的色谱峰面积与内标环己酮的色谱峰面积进行比较，计算每一种挥发性风味化合物相对于内标的量。
式中：Ci为待测挥发性成分的浓度，μg/kg；Si为内标物环己酮的浓度，μg/kg；CA为待测挥发性成分的色谱峰面积；SA为内标物环己酮的色谱峰面积；M为茶样品质量，kg。
1.3.6 OAV的计算
根据下面公式计算香气活度值OAV。
式中：Ci为根据公式2计算出的浓度，μg/kg；OTi为该化合物在乙醇溶液中的嗅觉阈值，μg/kg。
1.3.7 感官测评方法
感官测评小组由28位优选评价员组成，小组成员均按照GB/T 16291.1-2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》要求，经过专业背景初筛和气味辨别测试。感官测评方法参照GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》中5.3.2.1红茶（柱形杯审评法），仅对香气进行测评。参考GB/T 14487-2017《茶叶感官审评术语》，结合高香种红茶的香气特征，整理出6个香气术语：甜香、花香、果香、烘烤香、辛香、青草香，用于描述茶样的香气特征。用0～7分的评分法来表示特征香气的强度。
1.4 数据处理
根据NIST 14质谱图库进行检索，质谱匹配度大于80的挥发性成分作为质谱（MS）鉴定标准，并结合保留指数（ethyl ester retention index，RI）文献值对挥发性成分进行了辅助鉴定。通过内标浓度和峰面积测得各挥发性成分的浓度，在利用文献阈值计算挥发性成分的香气活度值。挥发性成分含量和感官数据分析采用SPSS 22进行ANOVA方差分析，多元统计检验P＜0.05认为存在显著性差异。运用Unscrambler version X 10.4对3种高香种工夫红茶的关键香气组分和感官评分进行PLSR相关性分析。
2 结果与分析
2.1 3种高香种工夫红茶的挥发性成分及含量分析
3种工夫红茶中挥发性成分鉴定及含量见表2。
表2 3种工夫红茶中挥发性成分鉴定及含量
Table 2 Aroma compounds and relative contents detected in congou black tea samples
序号 实测RI文献RI 参考文献①实测浓度/（μg/kg）金牡丹 金观音 黄观音A1 861 1 391 [12] 5.729 叶醇；顺-3-己烯醇 MS 0.07 [12] 48.4a 62.7a 60.2a A2 1 030 1 030 * 12.99 苯甲醇 MS、RI 2.54 [12] 124.8b 161.2a 115.4b A3 1 105 1 101 * 16.66 脱氢芳樟醇 MS、RI 110 [13] 16.0a 29.0a NDb A4 1 118 1 118 * 17.03 苯乙醇 MS、RI 0.75 [12] 208.6a 346.3a 160.0c B1 - 645 [14] 1.89 异戊醛 MS 9 [14] 62.0a 65.8a 30.7b B2 - 655 [14] 1.961 2-甲基丁醛 MS 1.3 [14] 86.3a 96.9a 63.2b B3 956 961 * 9.725 苯甲醛 MS、RI 3.5 [12] 26.0b 37.4b 55.0a B4 1 040 1 040 * 13.42 苯乙醛 MS、RI 0.75 [12] 56.2a 43.6a 25.2b B5 1 255 1 757 [12] 23.01 3，5-二甲基苯甲醛 MS、RI 0.2 [12] 95.2a NDc 62.4b保留时间/min 化合物 鉴定方法阈值/（μg/kg）参考文献②
续表2 3种工夫红茶中挥发性成分鉴定及含量
Continue table 2 Aroma compounds and relative contents detected in congou black tea samples
注：A为醇类；B为醛类；C为酯类；D为酮类；E为酸类；F为其它类；G为烷烃类；T为萜烯类；N表示保留指数未查找到相关资料；参考文献①是保留时间的参考文献；参考文献②是阈值的参考文献；*表示RI指数参考自http：//www.flavornet.org/flavornet.html；MS为质谱鉴定，RI为保留指数鉴定；ND表示未检测到该物质；none表示该物质阈值未见文献报导；-表示保留指数无法计算或文献中未查到；同行小写字母表示红茶样品间是否存在挥发性化合物含量的显著差异（P＜0.05）。
序号 实测RI文献RI 参考文献①实测浓度/（μg/kg）金牡丹 金观音 黄观音B6 1 258 1 254 * 23.25 柠檬醛 MS、RI 0.04 [12] 18.6b NDc 47.8a C1 1 208 N 19.94 乙酸苯甲酯 MS 0.2 [15] 62.0b 177.4a 192.3a C2 1 234 1 234 * 21.65 水杨酸甲酯 MS、RI 0.04 [12] 117.6b 144.8a 145.9a C3 1 392 N 31.52 （Z）-己酸-3-己烯酯 MS 1000 [15] 41.9a NDb 46.9a C4 1 527 1 547 [14] 36.57 二氢猕猴桃内酯 MS、RI none 71.7a NDc 34.8b C5 1 561 1 571 [16] 38.15 苯甲酸叶醇酯 MS、RI none NDb 29.0a 22.1a C6 1 616 1 626 * 40.32 茉莉酮酸甲酯 MS、RI 0.07 [12] 63.4a NDb 52.8a C7 1 901 1 924 [17] 48.08 棕榈酸甲酯 MS、RI none 30.6a NDb 19.7a D1 1 397 1 397 * 31.85 顺茉莉酮 MS、RI 0.7 [12] 68.7b 68.2b 112.3a D2 1 462 1 455 [18] 34.04 香叶基丙酮 MS、RI 0.186 [12] 26.7a NDb 26.2a D3 1 817 1 846 [18] 45.92 植酮 MS、RI none 58.3a NDc 22.7b E1 - 600 * 1.75 乙酸 MS 0.55 [12] 315.8a 177.4b 192.3b E2 1 371 N - 30.29 3，7-二甲基-2，6 辛二烯酸 MS none 33.8b NDc 51.8a E3 1 372 1 363 [18] 30.3 香叶酸 MS、RI none 53.7a NDb 47.8a E4 1 915 1 963 [17] 48.89 棕榈酸 MS、RI none 36.1b 69.7a 44.1b E5 1 984 N - 53.02 十八碳烯酸 MS none 40.2a NDb 29.0a F1 977 994 * 10.67 2-戊基呋喃 MS、RI 6 [15] NDb NDb 27.6a F2 1 054 1 066 [14] 14.29 2-乙酰基吡咯 MS、RI 58.59 [12] NDb NDb 21.1a F3 1 066 N - 14.87 顺-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇保留时间/min 化合物 鉴定方法阈值/（μg/kg）参考文献②MS none 35.5a 43.1a NDb F4 1 162 N - 18.3 邻甲基苯腈 MS none NDb NDb 31.0a F5 1 369 1 214 * 30.16 1，2 加氢-1，1，6三甲基萘 MS、RI none 18.9b 80.3a NDb F6 1 439 1 439 * 33.29 香豆素 MS、RI 0.025 [12] NDb 44.4a NDb F7 1 501 N - 35.36 Z-四氢-6-（2-戊烯基）-2H-吡喃-2-酮 MS none 99.6a NDb 118.0a F8 1 513 1 514 [19] 35.93 2，6-二叔丁基对甲酚 MS、RI 36.37 [19] 60.9b NDc 99.4a F9 1 815 1 845 [10] 45.64 咖啡因 MS、RI none 512.5b 995.7a 589.0b F10 1 974 1 965 52.42 叶绿醇 MS、RI none 10.3b 72.3a NDb G1 1 017 1 000 [14] 12.5 癸烷 MS、RI 870 [15] 16.7a NDb 12.9ab G2 1 411 1 400 [20] 32.37 十四烷 MS、RI none 14.1c 64.9a 46.1b G3 1 514 1 500 [20] 35.97 十五烷 MS、RI none NDb 33.7a 5.7b G4 1 583 1 600 [10] 39.18 正十六烷 MS、RI none 33.0ab 46.2a 26.2b G5 1 703 1 702 [14] 42.06 二十一烷 MS、RI none 42.3a NDc 20.1b T1 1 026 1 025 * 12.9 D-柠檬烯 MS、RI 10 [15] 159.4b 351.9a 113.9c T2 1 048 1 059 [16] 14 萜品烯 MS、RI 108 [13] 9.3b 37.5a NDb T3 1 100 1 100 * 16.51 芳樟醇 MS、RI 0.5 [12] 16.0b NDc 97.6a T4 1 262 1 261 [21] 23.5 乙酸芳樟酯 MS、RI 1000 [15] NDb NDb 215.5a T5 1 200 1 134 [22] 25.4 3-蒈烯 MS、RI 44 [13] 452.4a 21.9b 32.8b T6 1 291 981 * 25.38 β-蒎烯 MS、RI 140 [17] NDb 1 287.4a1 356.7a T7 1 500 1 504 [16] 35.31 α-法尼烯 MS、RI 107 [13] NDb NDb 314.8a T8 1 539 1 859 [10] 37.15 α-二去氢菖蒲烯 MS、RI none 28.0a NDb NDb T9 1 555 1 509 [23] 37.87 （E）-β-金合欢烯 MS、RI none 320.0a NDb 19.5b T10 1 540 1 539 * 37.18 橙花叔醇 MS、RI 0.01 [12] NDb 103.5a 83.8a T11 1 816 1 836 [17] 45.8 新植二烯 MS、RI none 22.8b NDc 56.9a
由表2可知，在茶样中共检测并鉴定出51种挥发性物质，其中包括：醇类4种，醛类6种，酯类和内酯类7种，酮类3种，酸类5种，其他类10种，烷烃类5种，萜烯类11种。各类挥发性成分浓度比较结果如图1所示。
图1 3种工夫红茶挥发性成分分类浓度的比较
Fig.1 Comparisons of the total contents of all classes of aroma components in different congou black teas samples
3种高香种工夫红茶中，萜烯类浓度最高，其他类、醇类、酯类其次，酸类、醛类含量较低，烷烃类含量最低。萜烯类在3种高香红茶的挥发性成分中，种类最多，含量最高，种间差异显著，是形成3种红茶挥发性成分差异的关键组分。其他类主要是杂环类化合物，它们的含量与茶叶底物和干燥工艺相关，由于其他类含量较高主要来自咖啡因（500 μg/kg～900 μg/kg）的贡献，减去咖啡因的含量后，其他类的浓度与醇类、酯类相近。3种高香种工夫红茶挥发性物质在类别上存在显著差异，其中黄观音中萜烯类、其他类、酯类成分含量显著高于其他两种。金观音中仅醇类成分较高，而其余种类挥发性成分含量均较低。
3种高香种工夫红茶中，含量均较高的挥发性成分（＞48 μg/kg）包括具有青草香的叶醇和水杨酸甲酯，具有煮樱桃香味的苯甲醇，具有花果香的苯乙醇、异戊醛、茉莉酮、D-柠檬烯、3-蒈烯和乙酸苯甲酯，具有烘烤香的2-甲基丁醛，以及发酵过程中产生的乙酸。3种茶样中浓郁而丰富的花果香和青草香特征与萎调过程中引入摇青工艺有关，其中冬青叶香味的水杨酸甲酯是用于区分乌龙茶和红茶的关键风味物质[24]，而形成发酵香和烘烤香的酸类和杂环类挥发性成分与工夫红茶的发酵和干燥工艺有关，这说明本研究中高香种工夫红茶兼具乌龙茶和工夫红茶的部分香气特征。
2.2 主要香气组分的OAV分析
3种工夫红茶中关键香气成分（OAV＞1）的OAV值见表3。
表3 3种工夫红茶中关键香气成分（OAV＞1）的OAV值
Table 3 Key aroma components`s data（OAV ＞1）from three types congou black tea samples by OAV calculation
编号香气类别化合物阈值/（μg/kg）参考文献OAV值金牡丹 金观音 黄观音B6 果香 柠檬醛 0.04 [12] 465 ND 1 196 A2 果香 苯甲醇 2.54 [12] 49 63 45 B4 果香 苯乙醛 0.75 [12] 75 58 34 T1 果香 D-柠檬烯 10 [15] 16 35 11 B3 果香 苯甲醛 3.5 [12] 7 11 16 B1 果香 异戊醛 9 [14] 7 7 3 T5 果香 3-蒈烯 44 [13] 10 0 1 B2 烘烤香 2-甲基丁醛 1.3 [14] 66 75 49 F1 烘烤香 2-戊基呋喃 6 [15] ND ND 5 T10 花香 橙花叔醇 0.01 [12] 0 10 349 8 380 C6 花香 茉莉酮酸甲酯 0.07 [12] 906 ND 754 C1 花香 乙酸苯甲酯 0.2 [15] 310 887 961 D1 花香 顺茉莉酮 0.7 [15] 98 97 160 A4 花香 苯乙醇 0.75 [12] 278 462 213
续表3 3种工夫红茶中关键香气成分（OAV＞1）的OAV值
Continue table 3 Key aroma components`s data（OAV ＞1）from three types congou black tea samples by OAV calculation
注：ND表示未检测到该物质，0表示OAV值小于1。
编号香气类别化合物阈值/（μg/kg）参考文献OAV值金牡丹 金观音 黄观音D2 花香 香叶基丙酮 0.186 [12] 144 ND 141 T3 花香 芳樟醇 0.5 [12] 32 ND 195 C2 草木香 水杨酸甲酯 0.04 [12] 2 941 3 621 3 647 A1 草木香 叶醇 0.07 [12] 691 896 860 T6 草木香 β-蒎烯 140 [17] 0 9 10 B5 杏仁香 3，5-二甲基苯甲醛 0.2 [12] 476 ND 312 E1 醋香 乙酸 0.55 [12] 574 323 350 F6 豆香 香豆素 0.025 [12] 0 1 775 ND F8 药味 2，6-二叔丁基对甲酚 36.373 [19] 2 ND 3
由表3可知，3种工夫红茶中共有OAV大于1的挥发性化合物23种，根据美国食品香料和萃取物制造者协会 （flavor and extract manufacturers′association，FEMA）对不同挥发性化合物的香味描述，可将23种挥发性化合物按照其香气特征分为果香、花香、烘烤香、草木香、杏仁香、醋香、豆香和药香。3种高香红茶中，果香、花香、草木香的挥发性化合物种类多，OAV值大于1 000的化合物共4种，为柠檬醛、橙花叔醇、水杨酸甲酯、香豆素，这些化合物赋予高香红茶果香、花香和草香特征。3种高香红茶中，OAV值大于100的差异香气成分包括柠檬醛、橙花叔醇、茉莉酮酸甲酯、香叶基丙酮、芳樟醇、3.5-二甲基苯甲醛、香豆素，这7种关键香气成分形成3种高香红茶间的香气差异。3种高香红茶中，OAV值大于1的共性香气成分有苯甲醇、苯乙醇、D-柠檬烯、苯甲醛、异戊醛、2-甲基丁醛、乙酸苯甲酯、顺茉莉酮、苯乙醇、水杨酸甲酯、叶醇、乙酸，这12种关键香气成分相互支撑，构成高香工夫红茶的基本香型。
2.3 3种高香种工夫红茶关键香气成分与感官测评结果的相关性分析
3种高香种工夫红茶感官测评结果见表4。
如表4所示，3款高香种工夫红茶的香气感官指标项评分相似度较高，其中金牡丹和金观音6个感官指标均不存在差异，黄观音与前两者仅在花香、果香和辛香3个感官指标上存在显著差异。对比金牡丹和金观音，黄观音的花香、果香和辛香感官特征更强，评分更高。
高香红茶关键香气成分与感官评分的偏最小二乘回归法模型分析见图2。
表4 3种高香种工夫红茶感官测评结果
Table 4 Sensory evaluation of three types of congou black tea
注：同行小写字母表示红茶样品间是否存在该香气特征评分的显著差异（P＜0.05）；n=28。
香气特征 金牡丹 金观音 黄观音甜香 1.89±1.20a 1.75±1.17a 1.75±1.29a花香 3.32±1.59b 3.00±1.31b 4.43±1.69a果香 4.36±1.25b 4.29±1.24b 5.54±1.35a烘烤香 2.61±1.37a 2.68±1.33a 2.68±1.72a辛香 3.68±1.70b 3.39±1.59b 4.61±1.64a青草香 2.43±1.40a 2.29±1.46a 1.96±1.26a
图2 高香红茶关键香气成分与感官评分的偏最小二乘回归法PLSR模型分析
Fig.2 Standardized and estimated regression coefficients from partial least squares regression prediction models for the senory attributes variables
如图2所示，高香种红茶香气特征感官评分与关键香气成分（OVA筛选出23种）的加权回归系数（weighted regression coefficient，BW），其中 BW 绝对值越大，则香气特征与香气成分相关性越高。23种关键香气成分中，与感官指标较相关（|BW|＞1.0×10-6）的香气成分共8种，其中B6（柠檬醛）、C1（乙酸苯甲酯）、C2（水杨酸甲酯）、C6（茉莉酮酸甲酯）、T3（芳樟醇）、T10（橙花叔醇）与花香、果香、烘烤香、辛香4种香气感官特征呈显著正相关，而与甜香和青草香呈显著负相关。A4（苯乙醇）、F6（香豆素）与甜香和青草香呈正相关，而与花香、果香、烘烤香、辛香4种香气感官特征呈显著负相关。
3 结论
本次研究采用HS-SPME结合GC-MS技术，检测了源自铁观音和黄琰杂交的3种不同高香茶叶品种（金牡丹、金观音、黄观音）所制工夫红茶的挥发性成分，并采用OAV法进一步筛选出对香气特征贡献较大的关键香气成分，最后利用偏最小二乘回归法分析茶样香气特征与关键香气成分之间的关联。
3种花果香工夫红茶中共鉴定出51种挥发性成分，其中萜烯类物质含量最高、醇类和酯类含量其次。基于OAV大于1共筛选出23种关键香气成分，其中柠檬醛、橙花叔醇、水杨酸甲酯、香豆素（OAV值＞1 000）对3种高香种工夫红茶的香气贡献较大。
根据感官评分，黄观音的花香、果香和辛香的香气特征，比金牡丹和金观音更为突出。感官分值和关键香气成分的PLSR模型显示，花香、果香、烘烤香、辛香四种香气特征与柠檬醛、乙酸苯甲酯、水杨酸甲酯、茉莉酮酸甲酯、芳樟醇、橙花叔醇呈正相关，而甜香和青草香这两种香气特征与苯乙醇和香豆素呈正相关。结果显示，摇青工艺的引入使高香种工夫红茶具备乌龙茶花、果和青草香气的感官特征，感官特征与香气成分间建立起相互联系，这为工夫红茶的香气改良提供了理论依据。
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