壳聚糖是几丁质经脱乙酰作用后的产物，而几丁质主要可从虾、蟹等甲壳类动物外骨骼以及某些低等动植物（如藻类、真菌）中提取得来[1-2]，来源非常广泛。壳聚糖作为自然界中唯一一种天然碱性多糖，具有游离的碱性氨基，这赋予它很多独有的生物、生理特性，因此在食品、化工、生物医学等领域受到广泛关注[3]，并且已于2014年作为增稠剂、被膜剂列入国家食品添加剂使用标准中[4]。由于壳聚糖具有良好的抗菌作用[5]，成膜机械强度高，阻隔性能好，是非常理想的天然涂膜原料[6]，已广泛应用于食品保鲜上[7-8]。
壳聚糖成膜效果与膜液的流动和形变密切相关，因此研究膜液的流变行为对壳聚糖膜品质控制具有重要意义。多项研究[9-11]表明壳聚糖的固有性质如分子量（molecular weight，MW）和脱乙酰度（degree of deacetylation，DD），及环境因素如温度、pH值、溶液保存时长等均会一定程度上影响所得溶液的流变性能。李星科等[9]指出壳聚糖溶液是剪切变稀的假塑性流体，黏度随分子量与溶液浓度的增大逐渐增加；随着脱乙酰度和pH值的增大，壳聚糖溶液的黏度先减小后增大，分别在脱乙酰度70.8%和pH 4.9时黏度达到最小。
然而，本文在研究过程中发现壳聚糖溶液在低浓度下呈现胀塑性流体特性，其流变行为并非为固定的假塑性特性，且胀塑性与假塑性特性在食品最终成膜产生重大影响[12]，故本文着重考察壳聚糖分子量、脱乙酰度及浓度对成膜溶液流变性能的影响，深入研究壳聚糖溶液在不同浓度梯度下流变特性的变化情况，为壳聚糖涂膜在食品工业中应用提供一定理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
壳聚糖粉末（脱乙酰度80.8%，分子量分别为5、19、61 kDa，三者代号分别为 1，2，3；分子量为 4.5 kDa，脱乙酰度分别为81.0%、88.1%、95.2%，三者代号分别为4，5，6）：山东奥康生物科技有限公司。
吐温80（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；丙三醇、无水乙酸（分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
pH计：梅特勒-托利多公司，瑞士；R/S PLUS流变仪：Brookfield公司，美国；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ETS-D5磁力搅拌器：IKA集团，德国；Heal Force Rop超纯水机：力新仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 壳聚糖溶液制备
将定量壳聚糖溶于5 g/L的100 mL乙酸溶液中，添加30%（体积分数）壳聚糖干重的甘油和5%（体积分数）壳聚糖干重的吐温80，常温25℃下搅拌30 min至完全溶解，制成不同浓度（浓度梯度范围在1.0%～3.3%）的壳聚糖样品。根据zhuang等[13]试验方法，用冰乙酸调节溶液pH值至4.5后，将溶液于-0.1 MPa下抽真空1 h去除气泡，备用。
1.3.2 流变性能测定
将10 mL壳聚糖溶液缓缓倒入R/S PLUS流变仪盛具中，采用CC25转子剪切溶液测定溶液表观黏度随剪切速率的变化。测试条件：25℃下，剪切速率在5 min内从 0～300 s-1递增，再于 5 min 从 300 s-1～0 递减[13]。
剪切速率递增经历的流变曲线被称为上行线（uplink，UL），而递减过程经历的流变曲线为下行线（downlink，DL），这样一个完整循环称滞后回路或滞后环，其围合面积为滞后面积。
对非时间依赖性的假塑性和胀塑性流体，剪切应力和剪切速率的关系可用牛顿幂律关系模型解释：τ=Kγn。式中：τ为剪切应力，Pa；γ 为剪切速率，s-1；K 为稠度系数；n为非牛顿指数。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖溶液流变特性测定
触变性是指流体受剪切力作用，稠度发生变化，而在停止剪切后稠度又回复的一种可逆现象[14]，其强弱可以用滞后面积大小来表示[15]。滞后面积愈大，流体触变性愈强，回复能力则愈差[16]。研究表明[17]，高分子溶液在浓度很低时，由于分子之间相距很远，导致各个分子链彼此独立，即使在较快的剪切速率下，分子结构回复速度仍然很快，下行线处于上行线上方；而浓度大时，分子链间相距紧密，受到剪切应力后结构发生破坏且回复缓慢，出现滞后性，上行线处于下行线上方。
浓度2%，分子量5 kDa，脱乙酰度80.8%的壳聚糖溶液黏度随剪切速率变化的上下行线与滞后回路如图1所示。
图1 1-2%壳聚糖溶液流变性能
Fig.1 Rheological properties of chitosan film-forming solution of 1-2%
UL.上行线；DL.下行线；1=DD：80.8%，MW：5 kDa壳聚糖。
从图1中可见，壳聚糖溶液为封闭型滞后回路，在0～300 s-1剪切速率下形成顺时针方向的滞后回路，上行线处在下行线上方，但滞后面积极小，说明其回复能力良好，受到剪切作用后，内部结构依旧能在外力撤去后短时间内回复。故后续试验仅讨论上行线图。
2.2 不同分子量对壳聚糖溶液流变性能的影响
为考察分子量影响，壳聚糖溶液浓度定为1.5%，不同分子量壳聚糖溶液流变性能见图2。从图2a中可以看出，随着分子量增大，壳聚糖黏度线性提升，该结果与王伟等[18]的结果相一致。壳聚糖在水溶液中分子链充分伸展，会产生特殊的相互作用力，如分子间氢键等。分子量大的壳聚糖代表其聚合度较高，分子链较长，在溶液中的相互缠结能力、聚集能力都极大提升，在溶液中引起的氢键与疏水相互作用增大，故可得到更大的黏度[5]。
图2 不同分子量壳聚糖溶液流变性能
Fig.2 Rheological properties of chitosan film-forming solution with different MW
MW：19 kDa壳聚糖；3=DD：80.8%，MW：61 kDa壳聚糖。
随剪切速率的增加，19、61 kDa的壳聚糖溶液黏度发生了下降，属于假塑性流体，与多项研究[9-11]结果相符合。其中，吴国杰等[11]认为壳聚糖大分子链受到剪切力作用引发了触变效应与局部取向，在与取向垂直的方向上，分子链上分子间作用力主要是范德华力，呈现各向异性从而引起了假塑性现象；本研究中，分子量为5 kDa的壳聚糖黏度却随剪切速率增加而上升，属于胀塑性流体，其原因可能归因于此时壳聚糖分子内作用力小，而分子间发生缠结作用的几率也小，当发生剪切作用时，分子的流动性反而使得多个分子间出现吸引缠结等作用，发生剪切变稠的现象。
以上行线剪切速率与对应剪切应力值的自然对数取商值作得拟合直线，如图2b所示，该直线的斜率即为非牛顿指数n，用以表征溶液偏离牛顿流体的程度，n＜1，则表示该溶液为假塑性流体；n=1时为牛顿流体；而n＞1则是胀塑性流体，且n值越大，则随剪切速率增加流体表观黏度上升的幅度越大。从图2b中可看出，随分子量增大，n值分别为1.573 0、0.909 9、0.692 2。说明壳聚糖溶液由剪切变稠转为剪切变稀且稀化程度增大。另外，分子量越大，K值从0.001 8上升到2.460 1，增稠能力增强。
2.3 不同脱乙酰度对壳聚糖溶液流变性能的影响
不同脱乙酰度壳聚糖溶液流变性能见图3，溶液浓度定为3.0%。壳聚糖分子链是由乙酰氨基葡萄糖与氨基葡萄糖结构单元所组成的，氨基葡萄糖结构单元所占的比例即壳聚糖的脱乙酰度。图3a显示的是分子量为4.5 kDa但脱乙酰度不同的壳聚糖溶液流变特性曲线。由图3a可见，壳聚糖黏度均呈现随剪切速率增加先增大（剪切速率在0～45 s-1范围）后减小（45～300 s-1范围）的趋势，Benchabane A等[19]对羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose，CMC）溶液流变性能进行了研究发现，CMC溶液的浓度在1.5%～5.0%时，经较低速率剪切（小于10 s-1）表现为胀塑性流体特性。这可能是因为高分子溶液在较高浓度下，分子链结构较为紧密，分子间作用力较大，当剪切速率很小时，分子链构象变化缓慢，大分子链偏向于动态平衡构象，有足够时间松弛回复，分子链间作用的机会在动态平衡下大大增加，加强了分子间作用力；而随剪切速率增大，剪切应力破坏了这一平衡状态，分子链重新回归散乱状态，出现大量的缠结与聚集现象，经取向的分子链之间相对流动阻力下降，导致表观黏度减小，表现出假塑性流体特性。
图3 不同脱乙酰度壳聚糖溶液流变性能
Fig.3 Rheological properties of chitosan film-forming solution with different DD
a.上行线；b.lnτ/lnγ；4=DD：81.0%，MW：4.5 kDa壳聚糖；5=DD：88.1%，MW：4.5 kDa壳聚糖；6=DD：95.2%，MW：4.5 kDa壳聚糖。
在0～300 s-1剪切速率范围内，脱乙酰度为88.1%的壳聚糖黏度均为最小，而脱乙酰度为81.0%和95.2%的壳聚糖溶液黏度较为接近。李星科等[9]研究表明，在分子量为326 kDa，脱乙酰度为60.5%～86.1%范围时，溶液黏度在86.1%时得到最大值，约14.5 MPa·s。脱乙酰度的大小主要通过影响壳聚糖分子链的结构、电荷密度从而影响分子链间的相互作用，Lamarque G等[20]研究得到脱乙酰度大于75%时，壳聚糖分子链具有柔顺的构象。而乙酰基本身空间位阻较大、疏水性强[21]，脱乙酰度下降会引发分子链刚性的增加与疏水作用的增强，因此脱乙酰度为81.0%的壳聚糖黏度较大。而脱乙酰度达到95.2%时，氨基葡萄糖结构单元占比更高，产生更强的分子间与分子内氢键，也使得壳聚糖黏度有所提升。
图3b显示的是剪切速率与对应剪切应力自然对数的比值拟合曲线。由图3b可知，随脱乙酰度增大，n值相对接近，最大值在脱乙酰度为95.2%时得到，为1.023 6，稠度系数K值则在88.1%脱乙酰度时最小，为0.335 8。本试验中，脱乙酰度81.0%的壳聚糖溶液呈现假塑性流体性质，而脱乙酰度95.2%的壳聚糖溶液倾向于胀塑性流体特性。可见，脱乙酰度变化会改变壳聚糖流体的流变特性。
2.4 不同浓度对壳聚糖溶液流变性能的影响
图4a、图4b分别显示的是壳聚糖分子量4.5 kDa，脱乙酰度95.2%时，不同浓度下壳聚糖溶液的流变特性和lnτ/lnγ拟合曲线。
由图4a可知，壳聚糖浓度的上升会使溶液黏度呈指数级提升，可能的原因是浓度增加会引起溶液中壳聚糖分子链的缠绕和聚集效果增加，链与链之间相互作用增强。李永鹏等[22]通过对不同浓度下壳聚糖凝胶的应变扫描研究发现1.5%（m/V）的壳聚糖凝胶损耗模量与储能模量很小，而2.0%（m/V）的壳聚糖凝胶模量则有了显著提升，说明高浓度下分子链由于密集程度上升，其相互之间的交联和缠结几率继而提高，分子间作用力显著增强。
不同浓度下壳聚糖溶液的非牛顿指数n、稠度系数K与300 s-1剪切速率下的黏度值见表1。由表1可知，溶液浓度在3.0%及以下时非牛顿指数n＞1，呈现胀塑性行为，且非牛顿指数随浓度增加而下降，表明假塑性提高；而溶液达到3.3%时，溶液非牛顿指数小于1，呈现假塑性行为。溶液稠度系数随浓度增加而增大，系数值在1.8%～2.1%及2.7%～3.3%范围内变化较大，表明该区间壳聚糖分子链构象变化更为明显。本试验中，溶液浓度提升不到1倍（1.8%～3.3%），但溶液黏度提高3.7倍以上（0.0954～0.4491）。
图4 不同浓度壳聚糖溶液流变性能
Fig.4 Rheological properties of chitosan film-forming solution with different concentration
a.上行线；b.lnτ/lnγ；6=DD：95.2%，MW：4.5 kDa壳聚糖。
表1 不同浓度壳聚糖溶液非牛顿指数
Table 1 Non-Newtonian index of chitosan film-forming solution with different concentration
注：6=DD：95.2%，MW：4.5 kDa壳聚糖。
溶液非牛顿指数n稠度系数K相关系数R黏度/（Pa·s）6-1.8% 1.257 7 0.023 6 0.997 9 0.095 4 6-2.1% 1.114 0 0.102 0 0.995 9 0.163 0 6-2.4% 1.111 6 0.109 1 0.996 9 0.192 5 6-2.7% 1.087 7 0.152 7 0.995 9 0.233 2 6-3.0% 1.023 6 0.343 3 0.994 8 0.358 6 6-3.3% 0.964 5 0.594 5 0.996 7 0.449 1
2.5 壳聚糖溶液流变特性改变关键浓度
前述研究表明，在不同溶液浓度、分子量与脱乙酰度时，壳聚糖溶液均呈现了不同的流变属性，在高分子量、高浓度下，壳聚糖溶液由假塑性流体转变为胀塑性流体。究其原因，在低流速或者静止状态下，由于壳聚糖分子在溶液中处于卷曲无规则状态，且分子内存在氢键与疏水作用，分子链又有相互缠结作用，导致较大的黏度。受到剪切应力时，之前散乱分子之间的相互作用力被打破，大分子链沿着剪切方向取向，分子链运动阻力降低，产生剪切稀化的现象[23]。但在分子量较小或浓度过低的情况下，发生剪切作用时，分子的流动性反而使得多个分子间出现吸引缠结等作用的几率增大，形成更为牢固的结构，于是发生黏度增加的现象[24]。
为继续研究壳聚糖流变特性出现的浓度转折点，以浓度0.25%为梯度制备不同浓度、不同分子量的壳聚糖溶液（其中，3号壳聚糖分子量较高，提高0.1%的浓度流变性即发生了显著变化），以浓度0.30%为梯度制备不同浓度、不同脱乙酰度的壳聚糖溶液，以得到壳聚糖溶液从胀塑性流体转变为假塑性流体的浓度与最大剪切速率300 s-1下的黏度，结果见表2。
表2 壳聚糖溶液黏度转变非牛顿指数
Table 2 Viscosity-transforming non-Newtonian index of chitosan film-forming solution
注：1=DD：80.8%，MW：5 kDa壳聚糖；2=DD：80.8%，MW：19 kDa壳聚糖；3=DD：80.8%，MW：61 kDa壳聚糖；4=DD：81.0%，MW：4.5 kDa壳聚糖；5=DD：88.1%，MW：4.5 kDa壳聚糖；6=DD：95.2%，MW：4.5 kDa壳聚糖。
壳聚糖溶液非牛顿指数n稠度系数K相关系数R黏度/（Pa·s）1-2.75% 1.017 8 0.246 7 0.996 6 0.252 9 1-3.00% 0.974 0 0.406 6 0.995 4 0.324 9 2-1.25% 1.003 6 0.109 3 0.996 4 0.103 8 2-1.50% 0.909 9 0.274 1 0.994 2 0.153 0 3-1.00% 1.456 3 0.003 6 0.995 1 0.044 9 3-1.10% 0.903 7 0.268 6 0.991 5 0.141 5 4-2.70% 1.024 6 0.236 4 0.995 9 0.252 6 4-3.00% 0.965 9 0.456 3 0.995 1 0.349 0 5-3.00% 1.005 2 0.335 8 0.994 4 0.317 4 5-3.30% 0.921 0 0.775 5 0.997 1 0.462 1 6-3.00% 1.023 6 0.343 3 0.994 8 0.358 6 6-3.30% 0.964 5 0.594 5 0.996 7 0.449 1
由表2可知，对于分子量较小的1号壳聚糖（5kDa）与分子量为4.5 kDa的4、5、6号壳聚糖，流变特性转变所需浓度明显大于大分子量壳聚糖（19、61 kDa），约为2倍～3倍；此时，最大剪切速率下的黏度也明显增大。相对而言，脱乙酰度的变化对于流体性质转变所需浓度影响较小，但相应稠度系数及黏度则随脱乙酰度增加而提高。
3 结论
壳聚糖的分子结构特性对其流变特性具有显著影响。壳聚糖溶液的表观黏度随分子量的增加而增大；而随着脱乙酰度的增大，壳聚糖的黏度先减小后增大，在脱乙酰度88.1%时，溶液黏度达到最小值。壳聚糖溶液浓度增大，则分子链密集程度提高，黏度大大上升，对于分子量4.5 kDa、脱乙酰度95.2%的壳聚糖，浓度提高1.8倍，黏度可提高4.7倍。壳聚糖溶液在较低分子量情况下通过剪切应力作用增加了分子链相互缠结的几率，出现胀塑性流体特征，且转变浓度与分子量呈负相关。
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