黑豆（Glycine max），别名乌豆、冬豆子，为豆科植被大豆的黑色种子[1]，东北地区产量最大，其适应性强，耐旱、耐瘠、耐盐碱[2]。黑豆中不仅微量元素含量高，而且蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、微量元素和粗纤维的含量也很丰富[3]。黑豆中的花青素是很好的抗氧化剂来源，具有养颜美容，增加胃肠蠕动的功能[4]。
花青素主要是多酚类物质，是由黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二酚的配位缩合或聚合而成的低聚或多聚物，可以有效清除人体内产生的活泼自由基[5-7]；花青素具有抗氧化、防治心血管疾病、抗癌、抗高血压、降血糖等生物活性[8-11]，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，是迄今为止发现的最好天然抗氧化剂之一[12-15]。
花青素在化妆品、医药等领域有广泛的应用，可强化动脉、静脉和毛细血管，有效清淤化肿[16-18]，加快毛细血管血液流动速度，减少毛细血管阻力，改善血管渗透性，从而提高组织细胞新陈代谢过程，使组织器官吸收养分和排除废弃物更加自由[19]；花青素作为一种天然食用色素，安全无毒，不仅抗氧化活性强，而且在水和醇溶液中的溶解性也很好。目前，国内关于黑豆花青素中的功效成分方面研究较少，黑豆的价值没有充分发挥出来。因此该论文以黑豆为原料，响应面法优化黑豆花青素提取工艺并评价其抗氧化活性，为黑豆资源的开发与利用提供重要依据。
1 材料与方法
1.1 材料
黑豆：吉林省长春市欧亚超市，经150℃烘焙熟制后，用高速粉碎机粉碎1次～2次，过60目筛备用。
1.2 试剂
无水乙醇、醋酸钠、氯化钾、氢氧化钠、盐酸、硫酸、1，1-二苯基苦基苯肼、邻二氮菲、甲醇、香草醛：均为分析纯。
1.3 仪器
UV-2102C型紫外可见光分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-4型数显控温水浴锅：江苏省金坛市友联仪器研究所；CS-700Y型多功能粉碎机：永康市天祺盛世工贸有限公司；ZD-2自动电位滴定仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-52C型旋转蒸发器、SHZ-DⅢ循环水真空抽气泵：巩义市予华仪器有限责任公司；ALPHA 1-4 LD PLUS型真空冷冻干燥机：德国Marin Christ公司；R-404A超低温冰箱：赛默飞世尔科技有限公司。
1.4 方法
1.4.1 花青素最大吸收波长的确定
用乙醇将黑豆花青素溶液定容至500 mL，取1 mL花青素原液于试管中，加入2.5 mL 30%硫酸试剂和2.5mL1%的香草醛溶液，摇匀后避光30min，于400nm～600 nm进行全波长扫描见图1[20]。
图1 黑豆花青素的可见光谱图
Fig.1 Visible spectrum disgram of anthocyanin on black bean
1.4.2 黑豆花青素含量的测定
试验采取pH差示法测定花青素得率[21]，计算公式如下：
其中：A=（A510-A700）pH1.0-（A510-A700）pH4.5；MW 为矢车菊素-3-葡萄糖苷（449.2 g/mol）的分子量；DF为稀释因子；ε为摩尔吸光系数[26 900 L/（mol·cm）]；L为光长度（1 cm）。
1.4.3 响应面法优化黑豆花青素提取工艺条件-Box-Behnken设计
结合单因素试验结果，以影响黑豆花青素得率的主要因素，即提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为输入变量，花青素得率为试验指标，进行Box-Behnken中心组合设计。试验因素水平编码见表1。
表1 试验因素水平编码表
Tabel 1 The factors and levels of response surface methodology
水平 乙醇浓度X1/%料液比X4/（g/mL）-1 60 50 2 1∶10提取温度X2/℃提取时间X3/h 0 70 60 3 1∶15 1 80 70 4 1∶20
1.4.4 黑豆花青素的体外抗氧化能力测定
将最优工艺条件下提取的花青素溶液真空浓缩、冷冻干燥，测定其体外抗氧化活性，包括对DPPH自由基的清除作用，参照林海桢等[22]的测定方法；对羟自由基的清除作用，参照范艳丽等[23]的试验方法；对金属离子螯合剂的清除作用，参照邢颖等[24]的测定方法。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对黑豆花青素得率的影响
乙醇浓度对黑豆花青素得率的影响，见图2。
图2 乙醇浓度对花青素得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on anthocyanin yield
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图2可见，随着乙醇浓度的升高，黑豆花青素的含量逐渐增加，乙醇浓度达到70%（体积分数）时，黑豆花青素得率达到最大1.141 mg/g，此后乙醇浓度升高，黑豆花青素得率却呈现降低趋势。
2.1.2 提取温度对黑豆花青素得率的影响
提取温度对黑豆花青素得率的影响见图3。
图3 提取温度对花青素得率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图3可见，随着提取温度的升高，黑豆花青素得率先增加后减少，当提取温度为60℃时，黑豆花青素得率达到最大0.982 mg/g。
2.1.3 提取时间对黑豆花青素得率的影响
提取时间对黑豆花青素得率的影响，见图4。由图4可见，随着提取时间的延长，黑豆花青素得率先增加后减少，提取时间为3 h时，黑豆花青素得率达到最大0.949 mg/g。
图4 提取时间对花青素得率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanin yield
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
2.1.4 pH值对黑豆花青素得率的影响
pH值对黑豆花青素得率的影响见图5。
图5 pH值对花青素得率的影响
Fig.5 Effect of pH value on anthocyanin yield
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图5可见，花青素得率的变化趋势缓慢，说明pH值的变化对黑豆花青素得率的影响较小，所以在响应面优化试验中未考虑pH值的影响。
2.1.5 料液比对黑豆花青素得率的影响
料液比对黑豆花青素得率的影响，见图6。
图6 料液比对花青素得率的影响
Fig.6 The effects of ratio of liquid to solid on anthocyanin yield
不同字母表示差异显著（p<0.05）。
由图6可见，随着溶剂的增大，黑豆花青素得率先增加后减少，当料液比为1∶15（g/mL）时，花青素的得率最大为1.081 mg/g。
2.2 响应面试验方案及结果
2.2.1 试验方案及结果分析
运用Design Expert 8.06软件进行数据回归分析，建立各影响因素之间的数学模型，并获得黑豆花青素提取工艺的最优条件，试验方案及试验结果见表2。
表2 试验方案及试验结果
Table 2 Design and results of tests
试验号 乙醇浓度X1提取温度X2提取时间X3料液比X4花青素得率Y/（mg/g）1 0 0 0 0 0.798±0.094 2 0 0 0 0 1.329±0.042 3 -1 0 -1 0 1.303±0.055 4 0 -1 0 -1 0.703±0.024 5 0 0 0 0 0.871±0.032 6 0 1 1 0 1.227±0.043 7 1 1 0 0 0.902±0.028 8 0 1 0 -1 1.107±0.036 9 1 0 0 -1 1.028±0.03 10 0 0 1 1 0.807±0.008 11 -1 1 0 0 1.305±0.031 12 0 1 0 1 1.094±0.025 13 0 0 0 0 1.265±0.037 14 -1 0 0 -1 0.902±0.037 15 1 0 0 1 1.137±0.035 16 0 1 -1 0 1.061±0.013 17 1 -1 0 0 0.909±0.035 18 -1 0 1 0 1.124±0.035 19 -1 0 0 1 1.07±0.043 20 0 0 0 0 1.104±0.041 21 0 -1 1 0 0.704±0.044 22 0 -1 0 1 0.907±0.044 23 0 0 -1 1 1.185±0.053 24 0 0 -1 -1 0.813±0.043 25 0 -1 -1 0 1.115±0.031 26 1 0 1 0 0.904±0.03 27 1 0 -1 0 1.172±0.042 28 -1 -1 0 0 1.136±0.037 29 0 0 1 -1 0.704±0.002
2.2.2 数学模型的建立及检验
对响应面试验结果进行回归分析，结果见表3，回归模型方程为：Y=-13.701+0.204X1+0.213X2+0.144X3+0.223X4+0.001X1X2+0.005X1X3-0.001X1X4+0.002X2X3-0.001X2X4+0.006X3X4-0.002X12-0.002X22-0.110X32-0.007X42。
由表3可知，失拟项（p=0.25）不显著；模型组（p＜0.000 1）极显著；模型相关系数R2=0.960 7；回归方程的C.V.值=5.19%（＜10%），说明试验所受外界因素影响较小。综合分析表明用此模型来分析和预测黑豆花青素提取工艺结果比较合适。
表3 回归模型分析
Table 3 The analysis of variance for regression model
注：* 表示显著，p＜0.05；** 表示极显著，p<0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性模型 0.97 14 0.069 24.45 ＜0.000 1 significant X1 0.410 1 0.410 143.56 0.000 1 **X2 0.051 1 0.051 17.89 0.000 8 **X3 0.025 1 0.025 8.69 0.010 6 *X4 0.019 1 0.190 6.71 0.021 4 *X1X2 0.004 1 0.004 7.27 0.028 1 *X1X3 0.012 1 0.012 6.09 0.022 8 *X1X4 0.002 1 0.002 0.59 0.453 5 X2X3 0.001 1 0.003 0.42 0.527 0 X2X4 0.003 1 0.003 6.96 0.024 7 *X3X4 0.003 1 0.17 1.09 0.314 3 X12 0.210 1 0.210 73.36 ＜0.000 1 **X22 0.230 1 0.230 80.71 ＜0.000 1 **X32 0.079 1 0.079 27.92 ＜0.000 1 **X42 0.160 1 0.160 56.42 ＜0.000 1 **残差 0.040 14 0.003失拟项 0.033 10 0.003 2.07 0.252 5 不显著纯误差 0.006 4 0.002总和 1.01 28相关系数 0.960 7 C.V.% 5.19 信噪比 16.872
一次项 X1、X2 和二次项 X12、X22、X32、X42 的差异性极其显著；一次项 X3、X4 和交互项 X1X2、X1X3、X2X4 差异显著；单因素的主次影响顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞料液比。
2.2.3 最优工艺条件求取与验证
经过响应面软件最终确定黑豆花青素最优提取工艺，采用乙醇浓度63.97%，提取温度60.83℃，提取时间3.17 h和料液比1∶14.15（g/mL）的条件下获得的花青素得率为1.069 mg/g。由于考虑到试验条件和仪器等局限性和验证此结果是否可靠，通过修改工艺条件得到黑豆花青素最佳提取工艺为：乙醇浓度60%，提取温度 60℃，提取时间 3 h，料液比 1 ∶15（g/mL），在此基础上反复提取黑豆花青素5次并进行验证试验，所得到的黑豆花青素的得率为（1.101±0.101）mg/g，接近理论预测值。
2.3 黑豆花青素体外抗氧化活性的研究
花青素对DPPH自由基、羟基自由基和铁离子螯合剂的清除作用见图7。
图7 花青素对DPPH自由基、羟基自由基和铁离子螯合剂的清除作用
Fig.7 Scavenging effect of anthocyanin on DPPH radicals，hydroxyl radicals and Iron ion chelating agent
由图7可见，DPPH自由基、羟自由基和铁离子螯合剂清除率都随花青素浓度的升高而呈现上升的趋势。当花青素浓度为50 μg/mL时，DPPH自由基的清除能力出现最大值84.32%，其清除率强于李子皮花青素（8 000 μg/mL时清除率为82.3%）[25]；当花青素浓度为50 μg/mL时，羟自由基清除能力出现了最大值84.82%，其清除率强于海南蒲桃果花青素（80 μg/mL时清除率为75%）[26]；当花青素浓度为50 μg/mL时对铁离子螯合能力的最大值为93.09%，其铁离子螯合能力强于紫薯花青素（100 μg/mL时铁离子螯合能力为80%）[27]。
3 结论
该文采用溶剂回流法提取黑豆花青素，并评价其体外抗氧化活性。经响应面法优化得到黑豆花青素最佳提取工艺为：乙醇浓度60%，提取温度60℃，提取时间 3 h，料液比 1 ∶15（g/mL），黑豆花青素得率可达（1.101±0.101）mg/g。体外抗氧化研究说明黑豆花青素对DPPH自由基、羟自由基对铁离子具有较强的螯合能力，且剂量效应关系十分明显。黑豆花青素具有较强的抗氧化活性，关于黑豆花青素的体内抗氧化活性及机理的研究将在后续课题中进行探讨。
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