图1 绿原酸标准曲线
Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid
Study on the Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Chlorogenic Acid from Eucommia ulmoides Leaves
赵梦瑶，张文杰，张立攀，等.正交优化超声辅助法提取杜仲叶中绿原酸的工艺研究[J].食品研究与开发，2019，40（3）：93-97
ZHAO Mengyao，ZHANG Wenjie，ZHANG Lipan，et al.Study on the Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Chlorogenic Acid from Eucommia ulmoides Leaves[J].Food Research and Development，2019，40（3）：93-97
杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）属杜仲科落叶乔木，又名木棉、思仲。其入药在中国有着悠久的历史，《神农本草经》、《本草纲目》、《名医别录》中对其药用功能都有相应的描述。传统上杜仲树皮入药，由于产量等原因局限性很大。近年来研究表明杜仲叶药用成分与杜仲皮基本相同、药用功能相近，且杜仲叶价格低廉，产量较高[1]。杜仲叶主要有效成分为绿原酸，是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，叶中含量可达1%～5%，十分丰富[2-4]。绿原酸具有降血压、增高白血球、抗菌、抗病毒和肿瘤、增强免疫力，清除体内自由基等功效[5-8]。除了医药领域，绿原酸还可应用于食品、日用化工领域[9-10]。对绿原酸的研究及相关产品开发，有着良好的前景[11]。
超声波技术对植物有效成分提取有着提取得率高、提取速度快的优点，超声波本身的破碎作用使样品颗粒减小，表面积增大；同时超声波的空化作用使固液表面的接触更加充分，增大了接触面积，从而加快提取速度[12]。本文应用超声波辅助技术对杜仲叶中的绿原酸进行提取，以绿原酸的得率为考量指标，分别进行单因素和正交试验，对从杜仲叶提取绿原酸的工艺进行优化。
1.1.1 材料与试剂
杜仲叶：湖南省邵阳市；绿原酸标准品（纯度≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、盐酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.1.2 仪器与设备
FA2004电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；QJ-08B粉碎机：上海兆申科技有限公司；60目标准型分样筛：上虞市五四仪器厂；DHG-9052A型台式电热干燥箱：上海捷呈实验仪器有限公司；KQ-700DE型超声波发生器：上海昆山仪器有限公司；AL204-ICF分析天平：梅特勒-托利多国际贸易有限公司；RE-2000A快速旋转蒸发仪：上海科升仪器有限公司；UV-8000ST双光束紫外可见分光：上海元析仪器有限公司。
1.2.1 样品预处理
杜仲叶自然风干后，置于电热干燥烘箱中，于50℃烘6 h，之后再于80℃烘3 h；用粉碎机将烘干的样品磨碎后过60目标准分样筛，筛过的叶粉在烘箱中50℃烘3 h。
1.2.2 杜仲叶中绿原酸的超声波辅助提取工艺
称取设定质量的杜仲叶粉，加入到设定浓度和体积的溶剂中，按照设定的超声浸提时间、超声浸提温度和超声浸提次数进行提取。提取物经过滤，少量溶剂润洗滤渣；所有滤液合并，旋干溶剂，用70%乙醇复溶，并定容至100 mL容量瓶中，为样品待测储备液备用。
1.2.3 绿原酸含量的测定
1.2.3.1 标准曲线的绘制
根据文献[3]中方法测定绿原酸的标准曲线：y=54.153x-0.005，R2=0.999 8。标准曲线如图1所示。
1.2.3.2 绿原酸含量的测定
统一设定预处理杜仲叶粉的秤取重量为1.00 g，以保持样品待测储备液的移取量为1.00 mL，定容至50 mL，按照文献[3]中的操作方法进行测定。
根据公式（1）计算不同试验组杜仲叶提取物绿原酸得率。
图1 绿原酸标准曲线
Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid
式中：W为绿原酸得率，%；c为测定液中绿原酸的浓度，mg/mL；m为称取的杜仲叶样品的质量，g。
1.2.4 杜仲叶绿原酸超声波辅助提取单因素试验
1.2.4.1 溶剂pH值的影响
溶剂中乙醇浓度恒定取70%，料液比取1∶20（g/mL），超声浸提温度取50℃，超声浸提时间取30 min，溶剂pH 值取 3、4、4.5、5、5.5、6 分别进行试验。研究超声溶剂不同pH值与绿原酸提取得率的相互变化关系与趋势。
1.2.4.2 超声浸提温度的影响
溶剂中乙醇浓度恒定取70%，溶剂pH值取4.5，超声浸提时间取30 min，料液比取 1∶20（g/mL），超声浸提次数取1次，超声浸提温度分别取30、40、50、60、70℃，进行提取试验。研究不同超声浸提温度与绿原酸提取得率的相互变化关系与趋势。
1.2.4.3 溶剂中乙醇浓度的影响
取超声浸提温度恒定40℃，溶剂pH值取4.5，料液比取1∶20（g/mL），超声浸提时间取30 min，超声浸提次数取1次，溶剂中乙醇浓度分别取30%、40%、50%、60%、70%和80%，进行提取试验。研究不同溶剂中乙醇浓度与绿原酸提取得率的相互变化关系与趋势。
1.2.4.4 超声浸提时间的影响
溶剂中乙醇浓度恒定取70%，溶剂pH值取4.5，料液比取1∶20（g/mL），超声浸提温度取40℃，超声浸提次数取 1 次，超声浸提时间分别取 5、10、20、30、40、50、60 min，进行提取试验。研究不同超声浸提时间与绿原酸提取得率的相互变化关系与趋势。
1.2.4.5 料液比的影响
溶剂中乙醇浓度恒定取70%，溶剂pH值取4.5，超声浸提时间取20 min，超声浸提温度取40℃，超声浸提次数取1次，料液比分别取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL），进行提取试验。研究不同料液比与绿原酸提取得率的相互变化关系与趋势。
1.2.4.6 超声浸提次数的影响
溶剂中乙醇浓度恒定取70%，溶剂pH值取4.5，料液比取1∶30（g/mL），超声浸提温度取40℃，超声浸提时间取 20 min，超声浸提次数取1、2、3、4、5分别进行试验。研究不同超声浸提次数与绿原酸提取得率的相互变化关系与趋势。
1.2.5 杜仲叶绿原酸超声波辅助提取的正交试验
通过对单因素试验结果的分析，得知超声浸提次数和超声料液比对提取物得率的影响较小，故选择影响因素较大的溶剂pH值、超声浸提温度、溶剂中乙醇浓度和超声浸提时间进行正交试验。设计的因素水平表见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 A溶剂pH值D提取时间/min 1 4 35 60 20 B提取温度/℃C乙醇浓度/%2 4.5 40 65 25 3 5 45 70 30
2.1.1 溶剂pH值的影响
溶剂pH值与杜仲叶绿原酸得率的变化关系见图2。
图2 溶剂pH值与杜仲叶绿原酸得率的变化关系
Fig.2 Effect of pH on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves
根据图2可得到，在设定的溶剂pH值范围内，得率呈现出先增大后降低的趋势，且当pH值为4.5时，得率最大。因为绿原酸是有机酸，容易在相对碱性的环境下发生水解，所以在酸性介质中较稳定，对绿原酸的提取在微酸性溶剂中更好[13]；但是酸性过大，其他杂质有机盐就会被酸化而溶出，从而影响绿原酸的提取得率。由试验结果选择溶剂pH值为4.5左右。
2.1.2 超声浸提温度的影响
超声浸提温度与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系见图3。
图3 超声浸提温度与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系
Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves
由图3可知，在设定的超声浸提温度范围内，得率先上升，当温度高于40℃后得率呈现出下降的趋势。这是因为绿原酸为热敏性物质，温度过高可能造成绿原酸分解，同时也会使得溶剂中的乙醇挥发变多，从而降低了得率[14]。故选择超声浸提温度40℃左右。
2.1.3 溶剂中乙醇浓度的影响
溶剂中乙醇浓度与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系见图4。
图4 溶剂中乙醇浓度与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系
Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves
由图4可知，随着溶剂中乙醇浓度的增加，得率先升高，在乙醇浓度达到70%时开始下降。这可能是因为高于此浓度时，杜仲叶中某些脂溶性物质溶出增加，造成提取溶剂的选择性降低[15]，对绿原酸的提取造成影响，同时浓度较大时，溶剂中乙醇挥发较快，也会造成绿原酸的提取得率降低。故选取溶剂中乙醇浓度为70%左右。
2.1.4 超声浸提时间的影响
超声浸提时间与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系见图5。
图5 超声浸提时间与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系
Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves
由图5可知，按照设定的超声浸提时间范围，提取物得率迅速升高，在达到20 min以后基本保持稳定。这可能是在超声波作用下，绿原酸在溶剂中达到了溶解平衡。同时，随着时间的延长，溶剂的逸失也会增加。故选择超声浸提时间20 min左右。
2.1.5 料液比的影响
料液比与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系见图6。
图6 料液比与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系
Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves
由图6可知，在设定的料液比范围内，绿原酸得率随着溶剂量的增加而逐渐增大，当料液比达到1∶30（g/mL）后，继续增加溶剂，绿原酸得率趋于稳定并略有下降。增加溶剂，化合物分子传质到溶液中的总量增多，当杜仲叶中的绿原酸全被溶出后，继续增加溶剂，绿原酸的量不会再继续上升，继续增加溶剂量反而使醇溶性蛋白质、黏液、树脂、鞣质、色素、油脂等杂质析出量逐渐增加[16]。同时，料液比太大，会增加生产成本，给后处理工序增加困难，所以在保证提取效果的同时，尽量减少溶剂用量[13]。故选择料液比为1 ∶30（g/mL）左右。
2.1.6 超声浸提次数的影响
浸提次数与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系见图7。
图7 浸提次数与杜仲叶绿原酸提取得率的变化关系
Fig.7 Effect of extraction times on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves
由图7可知，当浸提次数为2时，绿原酸的得率明显升高，但当浸提次数继续增加后，得率基本趋于稳定。浸提次数太多，其他杂质的溶出相应增加；同时，会使生产周期延长，导致能耗升高，成本增加。故选择浸提次数为2。
根据因素水平表，并按照试验中提取的操作步骤进行正交试验分析结果如表2所示。
表2 正交结果
Table 2 Results of orthogonal test
试验号 因素 绿原酸提取率/%A B C D 1 1 1 1 1 2.75 2 1 2 2 2 3.71 3 1 3 3 3 3.78 4 2 1 2 3 3.69 5 2 2 3 1 3.91 6 2 3 1 2 3.11 7 3 1 3 2 3.32 8 3 2 1 3 2.62 9 3 3 2 1 3.29 k1 3.413 3.253 2.827 3.317 C＞A＞B＞D A2B2C3D2 k2 3.57 3.413 3.563 3.38 k3 3.077 3.393 3.67 3.363 R 0.493 0.16 0.843 0.063
方差分析结果见表3。
表3 方差分析
Table 3 Variance Analysis of orthogonal test method
注：F0.01（2，2）=19.00；*表示差异极显著，（P<0.01）。
方差来源 因素平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A 0.381 2 63.5 19 *B 0.046 2 7.667 19 C 1.265 2 210.833 19 *D 0.006 2 1 19
根据表2和表3的结果，可以得出：对杜仲叶中提取物绿原酸得率影响，在各个因素条件中，溶剂pH值和溶剂中乙醇浓度具有显著性，且溶剂中乙醇浓度的显著性较大；各因素条件的影响大小依次为：溶剂中乙醇浓度＞溶剂pH值＞超声浸提温度＞超声浸提时间。说明溶剂中乙醇浓度在超声辅助提取杜仲叶绿原酸的过程中起着首要作用。正交优化后的最优提取条件组合为A2B2C3D2，即溶剂中溶剂pH值为4.5，乙醇浓度取70%，超声浸提温度取40℃，超声浸提时间取25 min，为验证正交设计试验的结果，在最优条件下，5次平行验证试验提取物绿原酸的得率平均值达到4.06%。
首先设计单因素试验，研究了各个因素条件与提取物绿原酸得率的相互变化关系与趋势；并在此基础上，通过正交设计优化试验得到最优工艺为溶剂中溶剂pH值为4.5，乙醇浓度取70%，超声浸提温度取40℃，超声浸提时间取25 min，在此条件下，绿原酸的得率平均值达到4.06%。结果表明采用超声波辅助技术对杜仲叶中绿原酸进行提取是可行的，得率较高，这为绿原酸的提取纯化工艺提供了参考，也为绿原酸相关产品的开发和利用提供了理论依据。
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