硒是人体必需的微量元素之一，是组成谷胱甘肽过氧化酶的重要成分，具有延缓衰老、抗癌防癌、提高免疫力、拮抗重金属毒性、清除人体内有害自由基等功能[1-5]。同时硒是典型的双功能元素之一，其生理需求量范围比较窄，日摄入量过低，会导致硒缺乏症；日摄入量过高又会导致硒中毒[6-9]。硒的生物有效性以及毒性不仅取决于硒的总量，而且与硒的化学形态密切相关[10-11]，例如亚硒酸盐的毒性大于硒酸盐，硒化氢的毒性最大，而硒代氨基酸等有机硒的生物利用率较高[12]。
小麦是我国主要粮食作物之一，建立简单快速准确的测定方法，了解富硒小麦中硒的形态具有重要意义。微波萃取具有萃取速度快、萃取效率高及操作简便等优点[13]。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）联用具有准确、快速、灵敏度高、接口相对简单等优点，在元素形态分析中得到广泛应用[14-15]。微波萃取结合HPLCICP-MS对富硒食品中硒形态分析报道尚少，采用微波辅助酶萃取的方式对富硒小麦进行萃取，并采用HPLC-ICP-MS联用技术测定萃取液中亚硒酸盐（SeIV）、硒酸盐（SeVI）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代胱氨酸（SeCys2）4种常见硒形态，分析结果令人满意。
7700型电感耦合等离子体质谱仪、1200型高效液相色谱仪：美国Agilent公司；PRP X-100分析柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）、PRP X-100保护柱（20 mm×2.1 mm，10 μm）：瑞士 Hamilton公司；MARS微波消解系统：美国CEM公司。
硒酸根标准溶液（GBW10033）、亚硒酸根标准溶液（GBW10032）：中国计量科学研究院；硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸（纯度98%）、蛋白酶K、蛋白酶XIV：百灵威公司；富硒小麦：京津冀地区。
仪器工作条件见表1。
表1 HPLC及ICP-MS的主要工作参数
Table 1 Main operation parameters for the HPLC and ICP-MS
HPLC工作参数 ICP-MS工作参数色谱柱 PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 μm）射频功率1 350 W保护柱 PRP-X100（20 mm×2.1 mm，10 μm）等离子体气流速15 L/min流动相6 mmol/L柠檬酸（pH=5.0） 辅助气流速1.0 L/min流速1.5 mL/min 积分模式峰面积进样体积100 μL 监控元素77Se，82Se
富硒小麦样品采集自京津冀地区，洗净冻干后粉碎，过100目筛，将样品置于4℃冰箱中避光保存。
1.3.1 微波萃取测定硒形态
称取0.500 0 g上述样品于消解罐中，加入15 mg蛋白酶XIV和10 mL超纯水进行微波萃取。采用如下萃取程序：200 W，10 min升温到37℃，控温37℃萃取 30 min。萃取液经离心（6 000 r/min，5 min）后，过0.45 μm水性滤膜，进行硒形态分析。同样方法做试剂空白试验。
1.3.2 微波消解测定总硒
称取0.200 0 g上述样品于消解罐中，加入5 mL HNO3和3 mL H2O2进行微波消解。采用如下萃取程序：800 W，10 min升温到190℃，控温190℃消解30 min。消解结束后，冷却，打开消解罐，样品溶液转移至25 mL容量瓶中，用超纯水洗涤3次，合并洗涤液，再用超纯水定容，摇匀。直接用ICP-MS测定硒总量。同样方法做试剂空白试验。
在硒的形态分析中，彭岚等[16]用5 mmol/L四丁基硫酸氢铵-2.5 mmol/L磷酸二氢铵-5%甲醇作为流动相分离测定了底泥中的4种硒形态。Hsieh等[13]用2 mmol/L 1-戊磺酸钠-5 mmol/L柠檬酸-3%甲醇和5 mmol/L磷酸二氢钠-5 mmol/L柠檬酸-3%甲醇作为流动相分离测定了大米中5种硒形态。经试验研究，使用柠檬酸作为流动相，成分单一、无毒、配制简单，在9 min内可完全分离4种不同硒形态，因此本试验选用柠檬酸作为流动相。
在柠檬酸浓度为2 mmol/L～10 mmol/L范围内，用20%的氨水调节流动相的pH=5.0，考察了柠檬酸浓度对4种硒形态保留时间的影响，结果如图1所示。
图1 柠檬酸浓度对4种硒形态保留时间的影响
Fig.1 Effect of concentration of citric acid on the retention time of four selenium species
随着流动相浓度升高，SeVI的保留时间迅速减少，当浓度达到10 mmol/L，SeMet和SeVI的保留时间接近，分离效果较差。当流动相浓度为6 mmol/L时，各硒形态可在9 min内实现较好的分离，因此本试验选择流动相浓度为6 mmol/L。
在不同的酸度条件下，硒的不同形态会以阳离子、阴离子或者两性离子的形式存在[17]，因此流动相pH变化对各硒形态的分离效果和保留时间影响很大。流动相浓度为6 mmol/L时，分别用20%的氨水调节柠檬酸溶液的pH，在pH为4.0～6.0范围内，考察了柠檬酸酸度对4种硒形态保留时间的影响，结果如图2所示。
图2 流动相酸度对4种硒形态保留时间的影响
Fig.2 Effect of the pH of citric acid on the retention time of four selenium species
随着pH增大，SeVI的保留时间急剧减少，当pH=5.0时，4种硒形态分离效果令人满意，本试验选择流动相的pH为5.0。
使用本文建立的方法进行检测，SeIV和SeVI的线性范围为 0.5 μg/L～500 μg/L，SeMet和 SeCys2的线性范围为 1.0 μg/L～600 μg/L，线性相关系数（r2）均大于0.999，以 3 倍信噪比计算检出限，SeCys2、SeIV、SeMet、SeVI的检出限分别为 0.23、0.15、0.30、0.16 μg/L。4 种硒形态的线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表2，4种硒形态标准溶液色谱图见图3。
表2 4种硒形态的线性范围、线性方程、相关系数和检出限
Table 2 Linearranges，linearequations，correlationcoefficients（r2）and limits of detection（LOD）for the four selenium species
硒形态 线性范围/（μg/L） 线性方程 相关系数r2检出限/（μg/L）SeCys2 1.0～600 y=797.6x-1 761.9 0.999 6 0.23 SeIV 0.5～500 y=2 324.3x+1 636.2 0.999 3 0.15 SeMet 1.0～600 y=593.5x-569.1 0.999 8 0.30 SeVI 0.5～500 y=2 188.6x+592.5 0.999 6 0.16
以SeMet和SeCys2阳性小麦样品探讨了超纯水提取、稀酸提取、酶水解提取的效果，试验结果如表3所示。
图3 4种硒形态标准溶液色谱图
Fig.3 Chromatogram of a standard solution of the four selenium species
表3 使用不同提取剂得到的富硒小麦中硒形态分析结果
Table 3 Analytical results of selenium species using different agents in selenium-enriched wheat
注：ND表示低于检出限。
SeVI/（mg/kg）超纯水 ND ND ND ND盐酸 ND ND ND ND蛋白酶K 0.022 ND 0.266 ND蛋白酶XIV 0.042 ND 0.336 ND提取剂 SeCys2/（mg/kg）SeIV/（mg/kg）SeMet/（mg/kg）
超纯水和0.1 mol/L HCl溶液都无法将SeMet和SeCys2从富硒小麦中有效提取出来，蛋白酶K和蛋白酶XIV都可水解提取SeMet和SeCys2，其中蛋白酶XIV水解效果更好。因此，本试验选择使用蛋白酶XIV水解提取作为富硒小麦中硒形态的提取方法。
以小麦为例考察蛋白酶XIV的加入量及酶水解时间对SeMet和SeCys2提取效率的影响，结果发现称样量为0.500 0 g时，提取液中SeMet和SeCys2含量随酶加入量增大而提高，酶加入量为15 mg时，SeMet和SeCys2含量达到最大值；蛋白酶XIV在37℃（蛋白酶XIV的最佳水解温度）提取30 min后SeMet和SeCys2含量达到最大值。因此，选择使用15 mg蛋白酶XIV在37℃提取30 min作为酶水解提取的最佳条件。
利用微波辅助酶萃取需时30 min，而文献报道恒温水浴摇床上振荡提取硒形态的时间为7 h[4]，超声波辅助酶提取硒形态的时间为1.5 h[18]，因此本方法大大缩短了提取时间。
采用本方法测定富硒小麦中硒形态，色谱图见图4。
对样品中4种硒形态进行6次加标回收试验，分析结果如表4所示。
图4 富硒小麦色谱图
Fig.4 Chromatogram of a selenium-enriched wheat
表4 4种硒形态的加标回收率和精密度（n=6）
Table 4 Spiked recoveries and precisions for four selenium species（n=6）
注：ND表示低于检出限；-表示此处没有数值。
硒形态 标准加入量/（mg/kg）测定值/（mg/kg） 回收率/% RSD/%SeCys2 0 0.042 - -0.050 0.094 103.5 3.1 0.100 0.137 94.6 4.5 SeIV 0 ND - -0.02 0.019 96.3 5.7 0.05 0.051 101.2 4.2 SeMet 0 0.336 - -0.250 0.570 93.7 3.6 0.500 0.862 105.2 2.2 SeVI 0 ND - -0.020 0.019 95.4 6.6 0.050 0.049 98.1 3.2
得到回收率在93.7%～105.2%之间，回收率相对标准偏差RSD在2.2%～6.6%之间，说明本方法具有良好的准确度和精密度。
将本文建立方法用于测定5个富硒小麦中硒形态，同时利用微波消解测定总硒含量，分析结果汇总如表5所示。
表5 富硒小麦分析结果
Table 5 Analytical results of selenium-enriched wheat
注：ND表示低于检出限。
样品 SeCys2SeIV SeMetSeVI 硒形态总量/（mg/kg）提取率/%1 0.068 ND 0.196 ND 0.264 0.271 97.42 2 0.033 ND 0.170 ND 0.203 0.214 94.86 3 0.093 ND 0.281 ND 0.374 0.386 96.89 4 0.062 ND 0.197 ND 0.259 0.269 96.28 5 0.042 ND 0.336 ND 0.378 0.396 95.45总硒/（mg/kg）
富硒小麦中主要含有SeMet和SeCys22种硒形态，说明富硒小麦中的硒大多以硒代蛋白的形式存在。4种硒形态总量在0.203 mg/kg～0.378 mg/kg之间，富硒小麦中总硒量在0.214 mg/kg～0.396 mg/kg之间，提取率在94.86%～97.42%之间，说明样品中硒形态基本提取完全。
利用微波辅助酶萃取进行样品前处理，建立了HPLC-ICP-MS联用技术测定富硒小麦中SeIV、SeVI、SeMet和SeCys24种常见硒形态的分析方法。该方法萃取时间短、操作简单、精密度和准确度良好，为富硒小麦中硒形态分析提供了切实可行的方法，在富硒食品中硒形态分析领域具有较好的应用前景。
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