乌骨鸡（Gallus gallus domesticus Brisson）是一种对气虚、血虚、脾虚、肾虚、心虚等各类虚症均有较好疗效的药用鸡种，体内蛋白质和氨基酸含量丰富，营养价值极高[1-2]。研究表明，酶解乌骨鸡肌肉获得的蛋白酶解液（即为乌鸡肽），多数为相对分子质量小于3 000 Da的小分子多肽类。这些小分子多肽的吸收机制优于游离氨基酸，并具有氨基酸不可比拟的生理功能和改善食品感官的效应[3-6]。主要表现为小分子多肽不需进行消化，可直接被人体吸收，其吸收具有主动性、完整性、载体功能等特点，并且具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力、降血压等一系列有助于人体健康的功效。
由于复合酶解法在制备多肽中应用普遍、酶解效果优越，且活性炭具有吸附脱色的作用，故本研究采用复合酶解法结合活性炭的吸附脱色作用制备乌鸡肽[7-9]。乌鸡肽制备完成后，本研究采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测乌鸡肽的总氨基酸、游离氨基酸含量及相对分子质量分布区间，并应用纳升级液相色谱串联质谱（Nano liquid chromatography tandem mass spectrometry，Nano LCMS/MS）技术对其组成成分及功能进行分析。该解析流程准确、可靠，不仅全面的解析了酶解活性炭吸附法制备乌鸡肽的营养成分、制备效果及其潜在应用价值，同时也为其它小分子多肽的有效利用提供重要的分析技术参考。
食品级木瓜蛋白酶（0.09 Au%）、风味蛋白酶（120 LAPu%）：中国广州裕立宝科技有限公司；食品级活性炭：上海活性炭厂有限公司；乙腈（色谱级）、三氟乙酸（色谱级）、标准品（甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶）：美国sigma公司。
胶体磨：中国南通澳德精密机械公司；超滤膜（UEOS503，6 kDa）：中国天津膜天膜工程技术有限公司；岛津LC20 AD高效液相色谱仪 [并配置日本岛津凝胶色谱柱（TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，5 μm）]：日本岛津公司；液相色谱质谱联用仪 [液相色谱仪（EASY-nLC 1000）、台式高分辨质谱仪（LTQ Orbitrap Elite）]：美国Thermo Finnigan公司；液相色谱质谱联用仪色谱柱（ReproSil Pur C18）：德国迈克公司。
选取江西省泰和乌骨鸡，体重1.5 kg左右，雌雄各半，复合酶解法制备乌骨鸡活性肽[10-11]。乌骨鸡肌肉蒸煮后，绞碎再加入胶体磨进一步磨碎，加入木瓜蛋白酶（0.09 Au%）和风味蛋白酶（120 LAPu%）进行水解，pH值为5.5，酶解温度为55℃，酶解时间3.5 h。沸水高温保持20 min进行灭酶，4 000 r/min离心15 min，分去上层油脂和下层沉淀物取中层液，活性炭粉末对中层溶液进行脱色处理，并使用相对分子质量为6 000 Da的滤膜进行超滤。
氨基酸组成分析采用2，4-二硝基氟苯柱前衍生法，操作步骤参照Liu等[3]的方法。总氨基酸检测时，需要先将乌鸡肽溶液中加入盐酸溶液，110℃水解24 h处理；游离氨基酸检测时，不需要进行盐酸水解；其它参数参照文献[3]的类似方法，570 nm波长处测定吸光度。
外标法分析多肽相对分子质量分布[12]。首先，应用高效液相色谱二极管阵列检测器法（high performance liquid chromatography coupled pulsedamperometric de tection，HPLC-PAD）法分离乌鸡肽溶液或标准品水溶液得到HPLC色谱图。流动相采用0.1%三氟乙酸/乙腈/水体系，其中乙腈含量从15%至65%均匀上升梯度洗脱30 min，乌鸡肽的进样量10 μL，流速0.5 mL/min、柱温30℃、进样室温度4℃、波长220 nm。其次，根据标准品测试结果绘制标准曲线，采用甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶4个标准品的保留时间（tR）对标准品相对分子质量的对数（lgMr）作图。
液相色谱-质谱联用仪（Nano LC-MS/MS），其中液相为纳升级、液相色谱柱为C18柱[13]。流动相为2%甲睛/0.1%甲酸/水体系，流动相梯度洗脱程序为：以0.1%甲酸含量变化为例，5%～15%、15 min，15%～90%、55 min，90%等梯度 20 min，流速为 0.1 mL/min，进样量为10 μL。质谱条件为：EASY-Spray纳流电喷雾离子源，毛细管电压1.8 kV，毛细管温度200℃。根据MS/MS图谱中产生的正离子模式的碎片离子峰，用Proteome Discoverer软件分析并通过UniProt全物种序列库进行搜索。
总氨基酸及游离氨基酸组成见表1。
乌骨鸡复合酶解肽中，共发现17种氨基酸（表1）。总氨基酸含量为326.51 mg/g，游离氨基酸总含量为5.69 mg/g，游离氨基酸占总氨基酸的比例为1.74%。上述结果表明：乌鸡肽的游离氨基酸含量偏低，多数组分应为肽类或蛋白质。总氨基酸含量较高者为Leu（57.01 mg/g）、Ala （55.83 mg/g）、His（54.85 mg/g）、Pro（48.05 mg/g）、Met（36.05 mg/g）和Phe（15.7 mg/g），游离氨基酸含量较高者为 Glu（1.09 mg/g）、Pro（0.64 mg/g）、Asp（0.64 mg/g）、Arg（0.60 mg/g）、Gly（0.55 mg/g）和 Ala（0.42 mg/g）。已有研究表明，Pro（48.05 mg/g）与多肽的抗氧化能力有关[10，14]，且 Leu、Met和 Phe（108.76 mg/g）均为必需氨基酸，这说明该乌鸡肽营养成分丰富。
表1 总氨基酸及游离氨基酸组成
Table 1 Total and free amino acid composition
Thr 0.36 0.21 Val 9.59 0.23 Met 36.05 0.11 Ile 21.15 0.18 Leu 57.01 0.33 Phe 15.7 0.10 Lys 1.17 0.02总含量 141.03 1.18非必需氨基酸（NEAA）游离氨基酸/（mg/g）必需氨基酸（EAA）分类 氨基酸种类 总氨基酸/（mg/g）Asp 2.83 0.64 Cys 1.5 0.03 Arg 10.33 0.60 Gly 2.1 0.55 Pro 48.05 0.64 His 54.85 0.27 Ala 55.83 0.42 Tyr 0.66 0.08 Ser 1.13 0.19 Glu 8.2 1.09总含量 185.48 4.51
相对分子质量分布区间见图1。
标准曲线采用甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶等4个标准品的保留时间（tR）对标准品的相对分子质量对数（lgMr）作图，线性方程为：y=-0.294 7x+8.338，R2=0.994 9。复合酶解活性炭吸附后乌鸡肽的相对分子质量分布范围为 0～6 918 Da，其中 6 918 Da～1 084 Da占 11.09%，1 084Da～279Da占 33.02%，279Da～124Da占27.90%，124Da～72Da占 8.56%（图 1），主要集中在 0～1084Da，比例达到88.91%。上述结果说明：该乌鸡肽含有较多利于人体吸收的小分子活性肽成分，且该复合酶解法对乌骨鸡肌肉酶解充分、能用于乌骨鸡小分子肽的制备。
乌鸡肽的蛋白质来源见表2。
图1 相对分子质量分布区间
Fig.1 Molecular weight distribution range
表2 乌鸡肽的蛋白质来源
Table 2 Protein source of black-bone silky fowl peptide
蛋白登录号 蛋白得分 相对分子质量/Da 二级谱数 肽段数 蛋白描述MYSS 592 223 976 512 288 肌球蛋白重链MYH1B 507 223 648 492 264 肌球蛋白-1B MYSC 203 128 216 160 120 肌球蛋白重链SDK2 82 239 916 289 196 蛋白侧链-2 TNNI2 55 21 335 41 34 肌钙蛋白I
续表2 乌鸡肽的蛋白质来源
Continue table 2 Protein source of black-bone silky fowl peptide
蛋白登录号 蛋白得分 相对分子质量/Da 二级谱数 肽段数 蛋白描述DESM 52 53 304 61 47 连接蛋白TPM1 51 32 803 71 54 原肌球蛋白α-1链TPM2 41 32 871 54 44 原肌球蛋白β链MLE3 51 16 756 42 22 肌球蛋白轻链3 LAMB1 45 35 775 27 20 层粘连蛋白β-1亚基ACTS 45 42 366 66 52 肌动蛋白ACT5 44 42 151 70 53 肌动蛋白TNNT3 44 31 123 29 19 肌钙蛋白T COT2 43 46 310 45 36 COUP转录因子2 TNNC2 40 18 421 29 22 肌钙蛋白C SSPO 39 593 477 353 273 SCO-脊椎蛋白MARF1 38 196 396 206 153 减数分裂调节器和mRNA稳定性因子1 KCRM 38 43 529 70 55 肌酸激酶M-型SETD3 37 67 496 101 6 组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶setd3 BAX1B 37 27 067 52 32 类BarH-1b同源蛋白VAC14 36 88 794 129 86 VAC14同源蛋白VINC 36 125 052 210 163 纽蛋白DDB1 35 128 186 158 112 DNA损伤-结合蛋白1 RM37 35 49 572 68 54 39S核糖体蛋白L37 TBA1 34 46 385 32 27 微管蛋白α-1链AT1A1 34 113 528 181 127 钠/钾ATP酶转运亚基α-1 T22D1 33 105 980 206 157 TSC22家族域蛋白1 TBPL1 33 20 862 34 11 TATA盒结合样蛋白1 RS27A 31 18 310 37 19 泛素-40S核糖体蛋白S27a TBX3 31 46 678 162 102 T-盒转录因子TAOK3 31 105 906 138 104 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3 HPSE 30 58 635 85 50 肝素酶PHAX 30 45 536 58 46 磷酸化配体RNA输出蛋白DDX6 30 54 782 118 70 可能的ATP-依赖性RNA解螺旋酶FBLN1 30 82 248 39 34 腓骨蛋白-1 MK09 30 44 493 38 31 丝裂原活化蛋白激酶9 EF1A 30 50 467 99 70 延伸因子-α1 SEM3A 30 89 895 123 70 脑信号蛋白-3A TM230 30 13 166 15 12 跨膜蛋白230
Nano LC-MS/MS共鉴定出源于2 287种肽段序列的107种蛋白质，其中种类最为丰富的蛋白为参与骨骼肌修复的蛋白及酶类。针对鉴定出来的蛋白得分大于30的前39种（表2）蛋白进行分析表明，该乌鸡肽含有骨骼肌修复相关蛋白15种（比例为38.46%），这说明该乌鸡肽很可能具有突出的强筋健骨功能。除此之外，在蛋白得分大于30的前39种蛋白中，还发现很多种类的其它功能蛋白，比如：参与组蛋白甲基化的组蛋白赖氨酸 N-甲基转移酶 setd3（SETD3）[15]，在翻译过程中不可或缺、参与损伤RNA降解的泛素-40S核糖体蛋白S27a（RS27A）[16]，促进癌细胞凋亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 TAO3（TAOK3）[17]，参与细胞损伤、可能成为神经防护药物作用靶点的纽蛋白（VINC）[18]。但是，胶原蛋白的发现是在得分14至30之间，推测可能是由于活性炭的吸附作用，造成了一些蛋白水解肽段的丢失，这也说明了以胶原蛋白肽为目的的研究开发，尽量避免使用活性炭进行脱色处理[9]。另外，Nano LC-MS/MS分析提供的鉴定蛋白的水解肽段信息也可以作为食品深度开发的参考。
乌鸡多肽，是对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，其吸收机制优于游离氨基酸，且具有氨基酸不可比拟的生理功能和改善食品感官效应[2-5]。本研究对乌鸡多肽的氨基酸组成进行分析后，采用外标HPLC法对其相对分子质量分布范围进行分析，并且结合Nano LC-MS/MS技术进一步分析其成分特征。该研究全面的分析了酶解活性炭吸附法制备乌鸡肽的成分，以此指导产品质量优化。
在复合酶解活性炭吸附法制备的乌鸡肽中，游离氨基酸占总氨基酸的比例为1.74%，总氨基酸含量较高者为 Leu、Ala、His、Pro、Met和 Phe，游离氨基酸含量较高者为 Glu、Pro、Asp、Arg、Gly和 Ala。相对分子质量分布范围为0至6 918 Da，其中1 084 Da以下的比例达到88.91%。Nano LC-MS/MS共鉴定出源于2 287种肽段序列的107种蛋白质，其中种类最为丰富的蛋白为参与骨骼肌修复的蛋白及酶类。其中，得分大于30的前39种蛋白中与骨骼肌修复相关蛋白占38.46%，同时还发现参与组蛋白甲基化的组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶setd3，在翻译过程中不可或缺、参与损伤RNA降解的泛素-40S核糖体蛋白S27a，促进癌细胞凋亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TAO3，参与细胞损伤、可能成为神经防护药物作用靶点的纽蛋白等功能蛋白[28-30]。总体来看，活性炭吸附乌鸡肽中，这些小分子多肽主要参与机体骨骼肌损伤修复，同时还具有抗癌及细胞修复的多重作用。
值得注意，本研究中胶原蛋白的发现是在得分14至30之间，推测可能是由于活性炭的吸附作用，造成了一些蛋白水解肽段的丢失，这也说明了以胶原蛋白肽为目的的研究开发，尽量避免使用活性炭进行脱色处理。结合Nano LC-MS/MS分析技术提供的鉴定蛋白对应的水解肽段信息、有目的的经过多肽的分离和活性鉴定，可得到易于被人体吸收利用并具有特定生理活性的多肽，将能广泛应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。
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