糖醛酸[1]又名透明质酸，它作为多糖分子中6位的羟甲基氧化成羧基的产物，是一种酸性的黏多糖。其中，某些多糖本身或具有糖醛酸结构的多糖常表现出十分重要的生物活性，例如，免疫调节活性、抗病毒活性[2-3]，而这类具有特殊生理活性的多糖中糖醛酸含量一般较高。由于含有糖醛酸结构的多糖一般存在于植物中，因此，对于从天然植物中提取的多糖，确定其分子结构中是否含有糖醛酸残基具有极其重要的意义，所以有必要对糖醛酸含量测定方法进行研究。
因为糖类物质大都没有紫外吸收，须将其衍生化后方可进行测定。但在实际工作中，特别是在测定天然多糖产物中糖醛酸含量时，发现测得的结果往往与实际情况有偏差，这是由于糖醛酸和中性单糖并不是独立存在，它们可能存在于同一个糖链中，无法将它们分离。例如，很多多糖以酸性杂多糖的形式存在，这在测定糖醛酸含量时可能存在相互干扰的情况[4]。因此探索准确测定天然多糖化合物中糖醛酸含量的方法是十分有必要的。目前多糖中糖醛酸含量测定的方法有光谱法和色谱法。本文对目前的国内外糖醛酸的含量测定方法进行了综述，以期为糖醛酸的质量控制提供参考。
1 糖醛酸含量的检测方法
1.1 光谱法
1.1.1 咔唑-硫酸法
咔唑-硫酸法[5]是测定糖醛酸含量的方法之一，糖醛酸在浓硫酸的作用下水解成带有-COOH的糠醛或糠醛衍生物，与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其呈色强度与糖醛酸含量成正比，可比色定量。采用咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量见如表1所示。
表1 咔唑-硫酸法对不同原材料中糖醛酸含量的测定
Table 1 Determination of uronic acid content in different raw materials by carbazole sulphuric acid method
线性范围/（mg/mL）方格星虫[6] 6 20 100 0.2 120 525 23.88 2.75～27.5麻黄[7] 6 5 100 0.2 10 530 45.89 0.025～0.4香菇[8] 6 5 100 0.2 10 528 3.025 0.261 5～0.784 5野木瓜[9] 5 20 100 0.2 120 523 25.24 0.001 7～0.016 7玉米须[10] 6 5 100 0.2 10 528 5.00 0.020～1.464枸杞[11] 6 20 85 0.2 120 530 3.40 0～0.32海藻酸钠[12] 3 20 100 0.1 10 524 81.1 0.025～0.2原材料 硫酸硼砂用量/mL 水浴时间/min 水浴温度/℃ 咔唑溶液用量/mL 放置时间/min 测定波长/nm 糖醛酸含量/%
如表1所示，测定不同原材料所用硫酸硼砂和咔唑溶液的量差别不大，测定波长范围在523 nm～530 nm，但沸水浴和显色放置时间相差较大，水浴时间和温度决定着多糖的水解程度，不同的多糖的单糖组成不同，水解时间和温度也会不一样。足够的显色放置时间是为了让水解产物与咔唑试剂充分地络合显色。咔唑-硫酸法操作简单，但是中性糖的水解产物也会与咔唑试剂反应，继而产生在糖醛酸的测定波长处有吸收的有色物质，且随着中性糖浓度的增加，其吸光度也随之增大，使测量值偏高，且不能测出单个糖醛酸的含量。为减少咔唑-硫酸法的测量误差，林颖等[10]提出了改进方法，为排除中性糖的干扰或对其测定结果进行校正，采用样品的吸光度与中性糖吸光度之差，测定结果与不含中性糖的糖醛酸实际测得吸光度基本一致，为准确地提高糖醛酸含量测定方法提供了试验依据。杨钊等[11]采用咔唑-硫酸法测定海藻酸钠多糖中糖醛酸的含量，利用圆二色谱法测得甘露糖醛酸和古罗糖醛酸含量之比（M/G值），根据M/G值和糖醛酸的表观吸收系数计算得出每一种糖醛酸的含量，即海藻酸钠中甘露糖醛酸及古罗糖醛酸的含量，圆二色谱法既能对海藻酸钠多糖中糖醛酸的测定结果进行校正，又可测定单个糖醛酸的含量。先采用咔唑-硫酸法测定总糖醛酸的含量，再通过圆二色谱法校正才能测出单个糖醛酸的含量，此方法虽然能够测出不同种类糖醛酸的含量，但过程比较繁琐，操作复杂。
1.1.2 间羟基联苯法
糖醛酸与硫酸硼砂溶液在沸水浴中水解，水解产物将进一步和间羟基联苯反应，产生粉红色衍生物，且具有紫外吸收，在一定范围内，该衍生物的紫外吸收与糖醛酸含量呈线性关系，可采用比色法测定糖醛酸的含量。采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量见表2。
如表2可知，不同种类的多糖沸水浴时间、间羟基联苯的用量及显色时间差别较大，但每种多糖糖醛酸的含量差别也较大，变化范围为1.19%～67.09%。此方法虽然简单，但中性糖对测定结果同样有所干扰。许会生等[20]改良了间羟基联苯法，通过制作葡萄糖标准曲线、葡萄糖醛酸标准曲线、葡萄糖醛酸的苯酚-硫酸法标准曲线（糖醛酸对中性糖的干扰曲线）、葡萄糖的间羟基联苯法标准曲线（中性单糖对糖醛酸的干扰曲线），将4条曲线联立，消除中性糖和糖醛酸的相互干扰，避免了误差，测定结果比较准确。任珍芸等[21]添加少量氨基磺酸盐可消除中性糖水解时产生的咖啡色或者茶色现象即消除生成非特异的显色物质的干扰，可以明显使糖醛酸检测结果更接近于真实值。另外一个重要的干扰因素是葡萄糖及半乳糖的存在对测量结果影响较大，但是甘露糖、鼠李糖及岩藻糖对糖醛酸含量的测定结果无明显的影响。
表2 间羟基联苯法对不同原材料中糖醛酸含量的测定
Table 2 Determination of uronic acid content in different raw materials by hydroxy biphenyl method
线性范围/（mg/mL）多聚己糖醛酸[13] 5 5 100 5 524 67.09 0.01～0.06阿里红[14] 5 5 100 0 520 17.07 0.01～0.05林下参片[15] 6 6 80 30 520 1.19 0.006～0.056人参[16] 6.0 12 80 40 525 29.34 0～1.060 3桑叶[17] 6 10 100 40 525 50.56 0.0134～0.047 7琐琐葡萄[18] 5.5 5 100 5 525 38.17 0.005～0.030新疆赤芍[19] 5 5 80 10 525 24.49 0.005～0.030葡萄糖和葡萄糖醛酸混合物[20] 4.5 10 50 20 525 39.90 0.01～0.06肺炎球菌荚膜[21] 5 15 80 30 525 16.52 0.004～0.04原材料 硫酸硼砂用量/mL沸水浴时间/min间羟基联苯用量/μL 显色时间/min 测定波长/nm 糖醛酸含量/%
与咔唑-硫酸法相比，中性糖对间羟基联苯法的测定结果影响较小[22]，但改良后的间羟基联苯能够明显消除中性糖的干扰。此法简单易行，对糖醛酸的特异性比较强，很多天然产物中糖醛酸的质量控制采用此分析方法，但该方法只能测定总糖醛酸的含量。
1.1.3 3，5-二甲基苯酚法
3，5-二甲苯酚法是糖醛酸在硫酸中产生的中间产物5-甲酰基-2-呋喃甲酸能够和3，5-二甲苯酚显色，在450 nm处有最大吸光度，可采用分光光度法测定[23]。
刘侠等[24]采用此法测定的市售蜂蜜中果胶的含量，用半乳糖醛酸作为标准品，分别加入浓硫酸、NaCl溶液、3，5-二甲苯酚显色，但中性单糖对此方法测定结果存在一定的干扰。Vineet Kumar等[25]和马云翔等[26]利用400 nm和450 nm双波长吸光度计算法消除中性糖对测定糖醛酸的干扰。在测定过程中，中性糖虽然在450 nm也有一定的吸收干扰，但其最大吸收波长为400 nm，因此采用450 nm和400 nm的吸光度差，可消除的背景干扰。3，5-二甲苯酚法测定糖醛酸含量时，改良后的方法能够减少中性糖的干扰，灵敏度高，显色稳定，精密度较好，线性关系良好。
1.2 色谱法
1.2.1 气相色谱法
气相色谱（gas chromatography，GC）以其较强的分辨率、快速的分析效率以及可用于定性及定量分析等优点，成为多糖结构分析中最重要的手段之一。气相色谱能够测定不同多糖中的单糖含量，测定结构准确度高[27]，但是对于糖醛酸等糖类的分析仍然存在一定难度，因为中性多糖和糖醛酸相邻单位的糖苷键很难被酸水解，而且糖醛酸一旦被释放出来，容易发生内酯化，且内酯化程度难以重复[28]。所以气相色谱法对多糖样品的要求很高，需要将多糖水解成单糖，并进行衍生化，将样品最大程度地转变成具有强挥发性的物质。常用的衍生化方法有硅烷化和乙酰化，总结如表3，所用的检测器为氢离子火焰检测器、毛细管柱。
表3 气相色谱法测定不同原材料中糖醛酸含量的条件对比
Table 3 Comparison of conditions for determination of uronic acid content in different raw materials by gas chromatography
原材料 色谱柱 水解试剂 衍生化方法豆腐渣、鸡腿菇[29]EC-1甘露醇用乙酸酐将多糖醇解产物乙酰化，然后硅烷化试剂[（吡啶）∶V（六甲基二硅氨烷）∶V（三甲基氯硅烷）=5∶1∶1，体积比]将乙酰化产物硅烷化苹果果渣[30] DB-17 三氟乙酸 用Na2CO3溶液将水解时形成的内脂转化为尿酸钠，再用NaBH4将醛基还原，除去杂质，将醛糖酸完全转化为醛糖酸内酯。然后正丙胺和乙酸酐进行衍生反应新型细菌[31] DB-1701 三氟乙酸 用乙硫醇-三氟乙酸和醋酐-吡啶体系先后对酸水解物进行衍生化甜菜干粕[32] DB-1701 三氟乙酸 将糖醛酸和醛糖分别转变为糖酰胺和糖醇，后将糖酰胺及糖醇全乙酰化
由表3可以看出，将多糖转变成单糖的方式有酸水解和醇解，与其它3个GC的测定方法相比，豆腐渣和鸡腿菇多糖[29]采用的是甘露醇进行甲醇解，硅烷化的方式进行衍生化。与酸水解相比，甲醇解能够非常有效地切断糖苷键，并且对单糖的破坏很小，还能够将糖醛酸的羧基转化为相应的甲酯，因而大大地提高了挥发性，有利于样品的检测。苹果果渣多糖[30]与另外两个原材料的酸水解相比，在水解之后用Na2CO3溶液将内酯转化为尿酸钠，能够在短时间内将内酯完全水解，既能缩短时间，又能使多糖完全水解，此法避免了多糖水解之后，部分糖醛酸以内脂形式存在而不能被衍生化造成的误差。新型细菌多糖[31]的糖醛酸衍生化方法避免使用对水分十分敏感的硅醚化试剂，衍生化非常有效，得到的测定结果准确。甜菜干粕多糖[32]采用全乙酰化法进行衍生化，相比于硅烷化，乙酰化既可以避免硅烷化时异构体的产生，又能够避免乙酰化时只能测定中性糖不能测定糖醛酸的缺点，并且可以同时测定其相对含量。
气相色谱法测定糖醛酸的含量，不同的样品水解和衍生化的条件不尽相同，需要优化。对衍生化后的糖类具有良好的选择性，样品用量少，灵敏度较高，分析速度快，能同时测定多种糖醛酸的含量，具有很好的应用前景。
1.2.2 液相色谱法
1.2.2.1 分子体积排阻液相色谱法
分子体积排阻液相色谱法是根据待测组分的分子体积大小来分离的，先将多糖水解，然后用葡聚糖凝胶色谱柱将糖醛酸分离出来并测定。糖醛酸是组成多糖的单糖之一，可以通过此法将糖醛酸与中性单糖分离。
Hirotaka Kakita等[33]采用正相分配色谱探究了微量分析糖醛酸的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术，色谱柱TSKgel Amide-80，将乙腈和磷酸二氢钾盐溶液流动相和柱后荧光衍生化结合起来，用紫外检测器测定糖醛酸含量。在无盐的有机流动相（例如乙腈和水）中，由于糖醛酸中的带负电的羧基与二氧化硅基质上的硅烷醇基之间的排斥，未被TSK凝胶Amide-80柱与无盐有机流动相吸附，但添加盐水增加了糖醛酸保留时间，但此方法中荧光衍生化时间较短，会使测定结果产生误差。且糖类物质没有紫外吸收，所以需将水解之后的多糖进行衍生化才能用紫外检测器检测。申明月等[34]采用高效液相色谱法测定茶叶多糖中糖醛酸的含量，色谱柱为Sugar-PakⅠ，流动相为乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的水溶液，检测器为示差检测器。示差检测器不需要衍生化，水解之后就能测定，操作简单，且稳定性、重现性良好，对糖类有良好的选择性，适合于多糖中糖醛酸含量的测定。但分子体积排阻液相色谱法也有一定的缺点，有的单糖是异构体，分子量相似，会导致其分离度不好，分离时间较长。
1.2.2.2 高效阴离子液相色谱法
高效阴离子色谱法能够使单糖和寡糖在高pH值（pH＞12）的洗脱液中被解离成阴离子，并在阴离子柱上进行交换分配，从而达到快速、高效地分离，是分析多糖及低聚糖中单糖组成的有效手段，见表4。
由表4可知，3种多糖中糖醛酸的含量所用的流动相的配比和流速有所不同，目的是将糖醛酸更好地分离出来。此方法是利用单糖所带的电荷数的差异，从而达到将其分离的目的，因此糖醛酸的峰远离中性单糖的峰（中性单糖tR＜12 min），能有效的将糖醛酸与中性糖分离，大大提高糖醛酸含量测定结果的准确性，并且样品不需要衍生化处理，操作简单。采用脉冲-安培检测器（pulse-ampere detector，PAD），能够使其分辨率、选择性和灵敏度大大提高，因此与其它方法相比更具优越性，是测定糖醛酸含量的有效方法。
表4 高效阴离子色谱法测定不同原材料中糖醛酸含量的条件对比
Table 4 Comparison of conditions for determination of uronic acid content in different raw materials by high performance anion liquid chromatography
原材料色谱柱流动相流速/（mL/min）检测器电极进样体积/μL糖醛酸含量/%当归[35] CarboPac PA1 0.15 mol/L NaOH-NaOAc 0.7 PAD Au 50 53.62木材[36] CarboPac PA20 NaOH-NaOAc（50 mmol/L～200 mmol/L） 0.5 PAD Au 20 1.97/2.53蔗渣[37] CarboPacPA1 0.001 mol/L NaOH-0.05 mol/L NaAc 0.65 PAD Au 10 1.20
2 结论
硫酸-咔唑法的咔唑试剂与中性糖反应，使测定结果存在误差；中性糖对间羟基联苯法的干扰较小，但不能确定糖醛酸的种类；3，5-二甲基苯酚法操作简单，双波长计算法能够排除中性糖的干扰，但3种光谱法只能测定总糖醛酸的含量。气相色谱法样品用量少，特别是对于单糖组成比较复杂的多糖和寡糖样品，但需要衍生化。分子体积排阻液相色谱的分离时间较长，而阴离子液相色谱能够很好的将中性单糖和糖醛酸分离，提高测定结果的准确性，且分离速度快，不需要衍生化，所以与其他方法相比，更具有优越性。色谱法操作方便，分辨度高，选择性好，灵敏度大，可同时测定多个组分，对仪器的要求较高。综上所述，几种糖醛酸含量测定方法各有优缺点，但随着检测条件和仪器精密度的提高，糖醛酸的种类和含量都会很容易的检测出来，不同的糖醛酸之间或者是和其它中性糖能够很好分离开，排除中性糖的干扰，糖醛酸的质量控制也会随之提升。
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