面条起源于我国汉代，至今已有4 000 多年的制作和食用历史[1]。河北发酵宫面，始于唐，兴于清，需要经过20 h 自然发酵，16 道工艺加工而成，发酵后的面条易于消化吸收，散发酵面香气，为河北传统非遗食品。宫面发酵过程中，面团内自然产生的一些有益菌，形成特殊风味和组织结构，因而比普通挂面更受欢迎。
面团的微生物菌群结构是影响面条品质的一个重要因素之一，同时也是发酵宫面特征形成的主要影响因素。目前国内已有研究对发酵馒头、面包等面团微生物进行了部分分析，但是对发酵宫面的研究还较少，本文利用16S rDNA V4 区和18S rDNA V4 区对宫面面团进行分析，对传统自然发酵面团中微生物菌群组成进行快速、深入的探索，同时对乳酸菌和酵母菌进行菌落分离鉴定，以期为实现发酵宫面的工业化生产提供支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
发酵宫面面团样品：河北省石家庄市玉桥食品厂；MRS 培养基：青岛高科技园海博生物技术有限公司；脱脂乳培养基及YPD 固体培养基：天津科技大学食品营养与安全重点实验室配制。
1.2 仪器与设备
FA2004N 电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；DY04-13-44-00 高压蒸汽灭菌锅：（山海东亚压力容器制造有限公司；SW-CJ-1FD 无菌操作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；YQX-Ⅱ厌氧培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；DM750 电子显微镜：Leica。
1.3 方法
1.3.1 宫面面团宏基因组测序
以细菌基因组DNA 作为模板，采用16S rDNA 扩增子测序技术以16S rDNA V4 区分析宫面样品中的细菌组成。以真菌基因组DNA 作为模板，采用18S rDNA扩增子测序技术以18S rDNA V4 区分析样品中的真菌组成。测序工作由诺禾致源公司完成。
1.3.2 宫面面团微生物的培养与分离
准确称取面团10.0 g，于90.0 mL 无菌生理盐水中振荡，并对菌悬液进行梯度稀释。分别吸取各稀释度菌液100 μL 于MRS 固体培养基和YPD 固体培养基进行平板涂布；MRS 固体培养基置于37℃厌氧培养箱中恒温培养48 h，YPD 固体培养基置于28℃恒温培养72 h，观察菌落生长情况。将上述培养的乳酸菌进行平板划线分离，分离出单菌落，进行革兰氏染色，并显微镜观察形态。
2 结果与分析
2.1 发酵面团中细菌分析
16S rDNA 扩增子测序，16S rDNA 扩增子测序技术已成为研究环境样品中微生物群落组成结构的重要手段通常是选择某个或某几个变异区域，利用设计的引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定[2-4]，门水平上微生物物种的相对丰度见图1。
图1 门水平上微生物物种的相对丰度
Fig.1 Relative abundance of microbial species at phylum level
发酵面团样品经宏基因组16S rDNA V4 区分析，宫面面团中的微生物主要是变形菌门（Proteobacteria）和蓝细菌门（Cyanobacteria），而厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）则占很小的比例。蓝细菌门含有叶绿素β-胡萝卜素等，普遍分布在土壤和淡水中。其他四大菌门与肠道微生物群相似，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）占微生物群的90 %以上，其次是放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）[5]。
16S rDNA 测序得到属于厚壁菌门（Firmicutes）乳杆菌目的乳酸菌种类见表1。
表1 乳酸菌种类
Table 1 Types of lactic acid bacteria
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum链球菌科Streptococcaceae科属种乳杆菌科Lactobacillaceae乳酸菌属Lactobacillus草绿色气球菌Aerococcus viridans肉杆菌科Carnobacteriaceae乳球菌属Lactococcus嗜热链球菌Streptococcus thermophilus气球菌科Aerococcaceae乳酸乳球菌Lactococcus lactis棉棉子糖乳球菌Lactococcus raffinolactis链球菌属Streptococcus气球菌属Aerococcus Marinilactibacillus 草绿色气球菌Aerococcus viridans明串珠菌科Leuconostocaceae魏氏菌属Weissella 魏氏菌Weissella
由表1可知，5个不同科分别是：乳杆菌科（Lactobacillaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、肉杆菌科（Carnobacteriaceae）和气球菌科（Aerococcaceae）。6个不同的属分别是：魏氏菌属（Weissella）、乳酸菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）、气球菌属（Aerococcus）和 Marinilactibacillus。7个不同种，它们分别是魏氏菌（Weissella）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、草绿色气球菌（Aerococcus viridans）、Marinilactibacillus psychrotolerans，其中优势菌属是发酵乳杆菌和魏氏菌，占乳酸菌的88.5%。另外，检测到放线菌门（Actinobactteria）下双歧杆菌目的双歧杆菌属（Bifidobacterium）1 株。综合已有文献，发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）是3 株典型的益生菌。
在我国，不同地区的发酵面团细菌组成差别很大[6]：华中地区（如河南省）、华北地区（如山西省）和西北地区（如甘肃省）优势菌为乳杆菌（Lactobacillus），次优势菌为明串珠菌属（Leuconostoc）；华东地区（如安徽省）：优势菌为明串珠菌属（Leuconostoc），次优势菌为乳球菌（Lactococcus）；东北地区（如黑龙江省）优势菌为乳杆菌（Lactobacillus），次优势菌为魏斯氏菌（Weissella）。在发酵面团中含有的有益菌多数为酵母菌和乳酸菌。目前，从酸面团分离出的乳酸菌大多数属于乳杆菌（Lactobacillus），还包括明串株菌（Leuconostoc）、魏斯氏菌（Weissella）、片球菌（Pediococois）、乳球菌（Lactococcus）和链球菌（Streptococcus）属的乳酸菌[7]。吴斯日古冷[8]应用16S rDNA 技术测定了内蒙古西部地区的28 份酸面团样品中的乳酸菌组成，鉴定出37 株植物乳杆菌（L.plantarum）、7 株融合魏斯氏菌（W.confusa）、3 株乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）和1 株发酵乳杆菌（L.fermentum）等。赵烜影等[9]通过应用16S rDNA V3 区测序分析了自然发酵黏豆包面团微生物菌群结构，鉴定出面团样品中细菌组成主要为：食窦魏斯氏（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、肠系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和罗氏乳杆（Lactobacillus reuteri）等。张楚楚[10]对自然发酵面团中的细菌群落进行研究，通过16S 测序、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术（polymerase chain reac tion-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）和传统分离鉴定手段，发现面团中的细菌主要为乳杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属，并测得在种水平上的发酵乳杆菌占总乳杆菌目的14%。
2.2 发酵面团中酵母菌分析
传统的真菌分类鉴定主要是按照真菌的形态、生长以及生理生化等特征对真菌进行分类。采用传统的方法对真菌进行正确的分类存在较大的困难。随着分子生物学技术的发展，核酸序列分析已被广泛的应用于真菌分类鉴定中，目前常用的技术为18S rDNA 测序[11-13]。发酵面团样品经宏基因组18S rDNA V4 区测定发现属于真菌界酵母菌纲下的毕赤酵母科（Pichiaceae）、梅奇酵母科（Metschnikowiaceae）和 2个未分类的酵母科。检测到3种水平的酵母，即异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）。检测结果显示异常威克汉姆酵母是真菌中的优势菌。具体菌群物种分类见图2。
图2 酵母菌菌种分类
Fig.2 Classification of yeast strains
目前从面团中分理出来的酵母菌种类很少，主要是酵母菌属和假丝酵母属[14-15]，另外少孢酵母（Saccharomyces exiguus），东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis），毕赤酵母（Pichia anomaia）和霍氏假丝酵母（Candida holmii）等。目前研究发现，酸面团中大约含有20种酵母菌，其中包括最广泛的酿酒酵母（S.cerevisiae），以及S.exiquus、小假丝酵母（C.humilis）和东方伊萨酵母（I.orientalis）[16]。宫面面团经测序检测到含有伊萨酵母属（Issatchenki）、Wickerhamomycess 和假丝酵母属（Candida）。吴斯日古冷[8]采用26S rDNA 序列分析法从酸面团样品中分离出：酿酒酵母（S.cerevisiae）、小假丝酵母（C.humilis）、异常毕赤酵母（P.anomala）、海洋酵母（K.exigua）、毕赤酵母（P.kudriavzevii）和近平滑假丝酵母（C.parapsilosis）等。
Sofia 等[17]在坦桑尼亚一种名为togwa 的玉米粥中发现了东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、毕赤酵母（Pichia anomaia）和假丝酵母（Candida glabrata）等，研究发现，这几种酵母对togwa 粥的感官品质有一定贡献。Martin 等[18]对乌干达的一种粥中的微生物进行分离，研究发现有多种优势菌发挥作用，该微生物体系中包括东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis），此酵母分别对该粥的发酵及成熟起到重要作用。刘婷婷[19]在白云边酒的发酵堆积料和出池酒醅中分离鉴定出东方伊萨酵母，检测出有 4 株，分别为 Z1、Z2、Z3、FJ5。同时，在西班牙的红葡萄中分离鉴定出具有产酯能力的东方伊萨酵母，此菌株对葡萄酒发酵起到一定的作用[20]。
异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）又称异常毕赤酵母（Pichia anomala）或异常汉逊酵母（Hansenula anomala），Daniel 等研究发现，该种酵母在比利时的手工烘培食品中最常见[21]。刘建利等采用高通量测序技术对我国不同地区的面引子样品进行检测，结果显示酿酒酵母和异常威克汉姆酵母为面引子中的优势菌群[22]。马榕灿等研究了酿酒酵母与异常威克汉姆酵母对面团发酵特性的影响，结果显示，异常威克汉姆酵母发酵面团产气缓慢同时持续时间长，且发酵面团中存在较多的还原糖，更有利于面团发酵[23]。
在发酵宫面面团中，本研究检测到东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），推测其对宫面面团的发酵品质特性有一定的贡献。
2.3 乳酸菌分离及鉴定
乳酸菌经选择性培养基培养，分离得单菌落。经革兰氏染色分析，在40 倍显微镜下观察染色结果为紫色，证明面团中的乳酸菌为革兰氏阳性菌，同时观察到平板上分别有杆菌和球菌。乳酸菌平板划线分离和革兰氏染色结果见图3。
图3 乳酸菌平板划线分离和革兰氏染色
Fig.3 Lactobacillus planar lineation separation and gram staining
采用一代测序技术鉴定平板划线分离得到的单菌，经检测确定为为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。
2.4 酵母菌分离及鉴定
酵母菌经YPD 培养基，分离得到单菌落。酵母菌培养和平板划线分离结果见图4。
图4 酵母菌培养和平板划线分离
Fig.4 Yeast culture and plate separation
经26S rDNA 测序，并进行基因序列比较证明，酵母菌为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）。
3 结论
本研究对河北玉桥发酵宫面面团微生物菌群组成进行探究，发现该面团中的优势菌群与华北地区面团中的优势菌群很相似。宫面面团中细菌菌群比酵母菌群种类更多，所占微生物体系的比例更大，其中乳酸菌属Lactobacillus 和魏氏菌属Weissella 是细菌菌群的优势菌属；酵母菌群中异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为优势菌群。在以后的生产中，可以通过纯培养从发酵宫面面团中获得相关有益菌株，以寻找发酵宫面的功能菌，为宫面品质的改善提供支持。
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