随着人们生活品质的提升，食品安全问题已成为现今社会的热点议题，其中食品微生物危害是食品卫生中的重要部分，而随着食品种类、样式的不断丰富和发展，尤其是各式各样零食及冷饮食品的出现[1]，使得相关产品对抑菌的要求也越来越高。目前，在食品安全方面的抑菌材料也非常多，比如苯甲酸盐类、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸等有机化学防腐剂，此类防腐剂虽然效果不错，但是目前食品安全发展的趋势之一就是向着天然产物的方向发展[2]，比如具有抑菌效果的多肽、多糖等。多肽在食品安全方面已经有广泛的应用，目前食品安全方面研发的多肽材料中，抑菌肽是一类重要的小分子[3-4]。与抗生素相比，抑菌肽具有高效、无残留、不易产生耐药性等优势[3]。抑菌肽根据来源、分子结构或者应用对象的不同，可以分为很多类，其中抑菌肽形成的水凝胶就是一种具有抑制细菌生长能力的自组装结构[5-7]。宋涛等[8]合成一种分子结构为两亲嵌段的共聚物，即聚己内酯-聚谷氨酸，它可以形成囊泡。在囊泡上面沉积纳米银，再把抑菌囊泡与普朗尼克F127 混合形成水凝胶，而形成的水凝胶则用于抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。除了共聚物外，石璐[9]利用半胱氨酸和银纳米簇络合作用形成的水凝胶杀灭砧板上杂菌，杀灭数值为1.25，满足国标中杀灭对数值1.0 的要求。
芴甲氧羰基-苯丙氨酸（N-[（9H-fluoren-9-ylmethoxy）carbonyl]-3-phenylalanine，Fmoc-Phe）是一种氨基酸衍生物的超分子水凝胶因子，研究显示在弱碱性缓冲液中可以形成水凝胶，并与石墨烯[10]、碳纳米管[11]、原位合成纳米银[12]形成杂化水凝胶材料，也可以包覆水杨酸用于抑制金黄色葡萄球菌的生长[13]，包覆并控制释放丁香精油[14]。相较聚合水凝胶而言，它具有小分子容易渗透的优势，而且该分子来源简单，价格便宜，生物相容性很好。
表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是一种目前广泛研究的天然抗氧化剂[15]，它具有很强的抗氧化性，还具有抗炎、抗病毒等方面的作用[16-17]。在食品工业领域，EGCG 被广泛应用于食品保鲜、防腐等方面的基础研究及实际生产，表明EGCG 是一种可应用于食品领域的天然的新型广谱抑菌成分[18-21]。
为了研究构型对抑菌性的影响，本文利用具有对映异构体的D 型Fmoc-苯丙氨酸（Fmoc-DPhe）和L 型Fmoc-苯丙氨酸（Fmoc-LPhe）作为凝胶因子，以pH 7.4的磷酸盐缓冲液制备水凝胶并用于测试其对抑制金黄色葡萄球菌生长的效果，并初步探讨二者的抑菌性性能差异及抑菌机理。此外，为了提高水凝胶的抑菌效果，本文将EGCG 复配到Fmoc-苯丙氨酸制备的水凝胶中，研究含有EGCG 的超分子水凝胶的抑菌效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Fmoc-苯丙氨酸（L/D 型）、苯丙氨酸（L/D 型）、Fmoc-甘氨酸（L 型）、Fmoc-酪氨酸（L 型）：上海吉尔生化有限公司；磷酸氢钠、磷酸二氢钠：分析纯，国药集团；EGCG：杭州普丽美地生物科技有限公司；细菌培养营养琼脂：青岛海博生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
恒温水浴锅（HH420）：金坛市科析仪器有限公司；旋涡混匀器（Vortex3）：艾卡（广州）仪器设备有限公司；电子分析天平（ME414S）：德国 Sartorius；紫外可见分光光度计（LAMBDA 25）、分子荧光光谱仪（LS55）：美国 PerkinElmer；圆二色谱仪（J1500）：日本 JASCO；高分辨场发射扫描电子显微镜（HITACHI SU8000）：日本HITACHI。
1.3 方法
1.3.1 Fmoc-Phe 水凝胶的制备
准确称取12 mg 的Fmoc-Phe，加入1 mL pH 7.4的0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液，旋涡振荡5 min，80 ℃水浴加热15 min，冷却后即可形成澄清透明的凝胶。
1.3.2 紫外可见吸收光谱表征
制备浓度为12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝胶，分别将含Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的溶液加入到石英比色皿中。LAMBDA 25 型紫外可见分光光度计扫描200 nm～700 nm 波长的吸收曲线。
1.3.3 荧光光谱表征
制备浓度为12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝胶，分别将含Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的热溶液加入到石英比色皿中，冷却形成水凝胶。稳态荧光光谱在LS55 型荧光分光光度计上进行，激发光波长265 nm，发射波长325 nm，狭缝宽度5。
1.3.4 圆二色谱表征
制备浓度为12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝胶，分别将含Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的热溶液加入到石英比色皿中，冷却形成水凝胶。采用J1500 型圆二色谱仪（CD）测试250 nm～400 nm 的CD信号。
1.3.5 场发射扫描电子显微镜微观结构观察
将凝胶样品的热溶液滴加少许于先划好的直径低于5 mm 的玻璃片，待凝胶形成后，将玻璃片在液氮中冷冻10 min，将冻干的玻璃片放入冷冻干燥机中冻干。冻干的玻璃片放入日立高分辨场发射扫描电子显微镜中测试其微观结构。
1.3.6 抑菌性评价试验
在超净工作台内，制备细菌营养琼脂平板（1.5%），挑取金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CGMCC1.282），密集划线法或涂布法接种于琼脂平板，而后取内径6 mm 的无菌打孔器，对称的在琼脂上，挖取加样孔，分别注入未冷却（约55 ℃）Fmoc-氨基酸凝胶液或100 μL 无菌磷酸盐缓冲液。待凝胶形成后，将检测平板置于电热培养箱中37 ℃培养24 h 而后量取抑菌圈直径。
为进一步探讨Fmoc-Phe 水凝胶与EGCG 复配的抑菌效果，将Fmoc-DPhe 充分溶解，溶解之后加入EGCG 溶液，确保EGCG 的最终浓度在5 mg/mL。制备金黄色葡萄球菌悬液，并以10 倍梯度稀释选择合适的菌液浓度用于抑菌试验。将制备好Fmoc-DPhe 凝胶、含EGCG 的Fmoc-DPhe 凝胶及EGCG 溶液分别置于菌悬液中作用一段时间，吸取0.5 mL 上述混合均匀的菌悬液接种于无菌平板上，37 ℃培养24 h 后计数。
2 结果与分析
2.1 水凝胶物理化学表征
Fmoc-Phe 是一种高效的凝胶因子，具有很强的自组装能力，它通过苯环间π-π 堆积、范德华力等非共价相互作用自组装形成三维网络结构的聚集体，是一种常见的用于多肽合成的氨基酸衍生物，它具有L型（Fmoc-LPhe）和D型（Fmoc-DPhe）两种镜像对映异构体。为了研究对映异构体分子对抑菌效果的影响，分别制备了两种构象的超分子水凝胶，通过紫外可见光吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱等进行化学表征。
紫外-可见光吸收曲线见图1。
图1 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝胶的紫外吸收光谱曲线
Fig1 The absorption spectrum curve of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel
紫外-可见光吸收曲线（图1）显示，Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 在200 nm～300 nm 区域有紫外吸收，但是二者的吸收曲线没有明显的区别。
分子荧光光谱图见图2。
分子荧光光谱（图2）结果显示，在265 nm 的激发波长下，Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 水凝胶均在325 nm处有最强的荧光信号。
圆二色光谱图见图3。
圆二色光谱图信号显示（图3），两种对映异构体形成的水凝胶，其信号的强度一致，但是方向是相反的，因此该水凝胶是具有对映异构体的镜像对称性质。
图2 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝胶的荧光光谱曲线。
Fig.2 The fluorescence spectra of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel
图3 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝胶的圆二色光谱图
Fig.3 The circular dichromatic spectrum of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel
Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 自组装形成的水凝胶外观上都是澄清透明。场发射扫描电镜的微观结构见图4。
图4 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝胶的场发射扫描电镜图像
Fig.4 Field emission scanning electron microscopy images of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel，respectively
场发射扫描电镜的微观结构（图4A 和图4B）显示，虽然两种水凝胶的CD 信号方向对称相反，但是超分子水凝胶自组装结构的微观结构并没有明显的区别。
2.2 Fmoc-Phe水凝胶抑菌效果观察
水凝胶抑菌效果见图5。
如图5所示，浓度为12 mg/mL 的两种不同构象的Fmoc-Phe 水凝胶均对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，且D 型的Fmoc-Phe 水凝胶抑菌性要强于L 型（P＜0.01）。
图5 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑作用
Fig.5 Inhibition of Staphylococcus aureus by Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel
2.3 Fmoc-DPhe与EGCG复配水凝胶抑菌效果研究
EGCG 是近年来广泛研究的植物活性成分，因其较好的抗氧化、抑菌性能，被认为是一种可应用于食品领域的新型抑菌剂。本研究探讨了Fmoc-DPhe 水凝胶与EGCG 复配的抑菌性能。12 mg/mL 的Fmoc-DPhe与5 mg/mL 的EGCG 复配的水凝胶抑菌能力显著高于单独使用其中一种（见图6）。
图6 Fmoc-DPhe水凝胶与EGCG复配对金黄色葡萄球菌的抑制作用
Fig.6 Inhibition of Staphylococcus aureus by Fmoc-DPhe hydrogel in combination with EGCG
2.4 Fmoc-氨基酸水凝胶抑菌机理初探
为探究Fmoc-氨基酸水凝胶抑菌机理，本研究分别测试了光学构象以及Fmoc 基团对抑菌作用的影响，结果见图7。
图7 Fmoc基团及光学构象Fmoc-氨基酸凝胶对金黄色葡萄球菌的抑制作用的影响
Fig.7 Effect of Fmoc group and optical conformation to Fmocamino acid gel on inhibition of Staphylococcus Aureus
发现在浓度、pH 值一致时，无光学异构特征的Fmoc-甘氨酸比两种构型的Fmoc-苯丙氨酸的抑菌性能弱的很多。同时，将两种不同光学构型的苯丙氨酸分子与其对应的Fmoc-苯丙氨酸分子对比，发现苯丙氨酸对映异构体对金黄色葡萄球菌的生长均没有抑制作用。
进一步的，为验证氨基酸中的苯环结构是否与Fmoc 基团协同作用从而产生抑菌性能，将Fmoc-LTyr与Fmoc-DPhe 形成的凝胶作对比，可见两种含苯环的氨基酸经Fmoc 修饰后均可表现出对金黄色葡萄球菌的抑制做用（见图8）。
图8 Fmoc-DPhe凝胶与Fmoc-LTyr凝胶对金黄色葡萄球菌的抑制作用对比
Fig.8 The inhibition effect of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LTyr gel on Staphylococcus Aureus was compared
3 结论
系统对比了经Fmoc 基团修饰后不同光学构象的苯丙氨酸制备的超分子水凝胶的物理特征，发现除光学构象不同外，其他物理性质基本无差异。进一步对两种构象的Fmoc-Phe 的抑菌作用对比发现，非天然的D 型Fmoc-Phe 抑菌作用优于L 型Fmoc-Phe。
通过将天然抑菌分子EGCG 与Fmoc-Phe 凝胶复配，可以发现二者具有协同增效抑菌。这为Fmoc-Phe在食品安全领域的应用提供了新的思路。同时，本研究还进一步的对Fmoc 基团修饰氨基酸产生的抑菌作用机制做了探讨，发现Fmoc 修饰的氨基酸的抑菌能力是由苯环母体经Fmoc 基团修饰后产生的，这为后续其他Fmoc 氨基酸水凝胶的开发提供了方向。
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