明日叶（Angelica keiskei Koidzumi），又名“滨海当归”、“长寿芹”、“神仙草”、“还阳草”、“海峰人参”等[1]，为当归属伞形花科（Umbelliferae），多年生草本植物。原产于日本太平洋沿岸—伊豆、八丈诸岛，据其茎颜色的不同分为红、青与混合茎种3个品种[2]。明日叶当代研究始于20世纪60年代日本[3]，90年代末引入国内，目前在山东、云南、两广、海南、台湾等地区均有种植，市面上明日叶商品已有代茶饮、精力汤粉、面条、查尔酮胶囊等。
明日叶作为一种天然药食兼备植物，含20种矿物质、16种氨基酸[4]、多种维生素以及丰富的叶绿素和微量元素，特别是其含有植物中少见的查尔酮、维生素B12、叶酸与天然有机锗等[5-6]，是难得的天然营养补充剂及保健食品，被誉为“神奇植物”[7]。查尔酮类物质为明日叶的主要活性成分，现已有多达42种查尔酮衍生物从明日叶中成功分离并鉴定[8]。据报道，明日叶查尔酮具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗心血管疾病、抗血栓、保肝、抗溃疡、抗黑色素生成及生发、记忆修复[9-25]等诸多功效。大量研究表明[8]，明日叶查尔酮具有显著的抗氧化、抗衰老活性。随着衰老自由基理论（Free radical theory of aging）研究的深入[26]，明日叶查尔酮所具有的强的自由基清除能力引起了国内外学者的广泛关注。
1 明日叶查尔酮的提取
明日叶查尔酮以其诸多显著的生理活性与高度的安全性[27]已得到各界认可，故采用最简便的方法获取高含量、高纯度的查尔酮，成为明日叶研究的热点。目前明日叶查尔酮的主要提取方法有：溶剂萃取法、索式回流提取法、超声与微波辅助法以及其他新兴的提取方法。
1.1 溶剂萃取法
溶剂萃取法依据查尔酮类物质在水、醇、酯等溶剂中溶解度的不同进行提取，提取工艺简单，成本低，最易实现产业化。
1.1.1 水提法
黄酮类物质含有酚羟基，在常温水中溶解度小，但在沸水中有一定溶解度[28]。郭晓青等[29]以明日叶干粉为原料，对比了水浴加热、煮沸、微波辅助浸提的提取率，得到最佳浸提条件为95℃下浸提10 min，总黄酮提取率为2.52 mg/g。该法的最大优点是绿色环保、无污染，但提取率较低。
1.1.2 有机溶剂提取法
1.1.2.1 乙醇提取法
乙醇的极性比水小，所以醇水体系对查尔酮的提取率比水提法明显提高。Ohnogi等[30]用干燥的明日叶根粉，无水乙醇为溶剂，室温下提取了明日叶中黄当归醇（xanthoangelol，XA）、4-羟基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）等8种查尔酮；郭晓青等将明日叶叶冷冻、干燥、粉碎后，用65%的乙醇[31]、45℃下浸提15 min，提取物中的总黄酮提取率达10.18 mg/g。和水提法相比，醇水法能耗低、效率高、稳定性好。
1.1.2.2 甲醇提取法
甲醇极性比乙醇高、比水低，故常用其调节萃取溶剂的极性。Kim[32]等用明日叶根皮粉为原料，纯甲醇为溶剂，料液比 1∶10（g/mL），室温下提取量为 290 mg/g，提取物含有包括5种查尔酮类化合物等共计16种物质；何月秋等[33]则以冷冻的新鲜明日叶茎叶为原料，93%甲醇为溶剂，料液比 1∶25（g/mL），提取 28 min，总黄酮提取率为17.28 mg/g。
1.1.2.3 乙酸乙酯提取法
乙酸乙酯是比乙醇极性更小的有机溶剂，也常用于黄酮类物质的提取。该方法主要为醇类粗提后，乙酸乙酯作二步萃取，旨在得到相对较纯的查尔酮类物质。Masaharu等[18]以明日叶根粉为原料，50%乙醇回流萃取3次，每次3 h，提取率为97.6 mg/g。提取物用1∶8的乙酸乙酯/水体系萃取，酯溶物占26.9%。酯溶物再经硅胶柱色谱多次分离得到查尔酮，占酯溶物的百分含量为11.5%，占原料的0.29%。Ogawa等[34]与Zhang等[35]也采用了类似方法提取查尔酮。
1.1.2.4 多溶剂混合提取法
另外国外也有研究为简化实验步骤、节约试剂，选用包括甲醇在内的两相溶剂系统为溶剂，如Akihisa等[36]选择明日叶茎粉渗出物冻干粉为原料，正己烷∶甲醇∶水=95∶95∶10 的体系提取，得率为 92.3%，用 1∶1 的乙酸乙酯/水体系萃取，得率为18.9%；最后用中、高效液相色谱（medium and high performance liquid chromatography，MPLC+HPLC）分离得5种查尔酮，得率5.0%，其中XA得率2.6%，4-HD得率1.4%。
1.2 索式回流提取法
索式回流提取法是指借助索式提取器提取的方法。陈欣华等[37]以明日叶干粉为原料，60%乙醇为溶剂，料液比 1∶50（g/mL）进行索氏提取 3 h，总查尔酮提取率为6.19 mg/g。
1.3 超声辅助提取法
超声辅助法利用超声对植物细胞结构的破坏，加速溶剂渗入细胞，且超声震动带来的能量可加速植物中有效成分的溶解，从而缩短提取时间，提高提取率。宁鸿珍等[38]利用超声提取法，选择功率300 W，乙醇浓度为 70%，1∶50（g/mL）的料液比，50℃下提取 20min，重复两次。与索式提取法相比，该方法提取率由6.19mg/g提高到7.53 mg/g，时间由3 h缩短到40 min，温度由100℃降低至50℃。
1.4 微波辅助提取法
微波辅助法利用了电磁波穿透力强、选择性好、热效率高等优点来提取分离，是新兴的“绿色萃取技术”[39]。邹毓兰等[40]以明日叶干粉为原料，85%、40%乙醇为溶剂，各提取3次，微波功率为600、700 W时，采用AlCl3与Al（NO3）3显色法，分别确定样品中总黄酮的得量分别为1.48 mg/g与1.67 mg/g；尹慧丹等[41]以明日叶干粉为原料，70%乙醇，料液比 1∶40（g/mL），提取2 min，反复提取3次，微波功率320 W，查尔酮得率为1.039 mg/g。
1.5 其他新兴提取方法
酶解法是通过一种或多种酶的水解作用来破坏天然产物的细胞壁结构，提高细胞的通透性，从而提高黄酮类物质提取率的方法。如王敏等[42]利用纤维素酶处理苦荞茎叶粉，黄酮得率为未经酶处理的3.08倍；另外超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SFE）与半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）等新兴提取方法[43-45]，提取效果均优于传统提取法，但明日叶查尔酮的提取目前还未出现类似新兴提取方法的研究。
2 明日叶查尔酮的分离与纯化
2.1 大孔树脂吸附法
大孔树脂吸附利用树脂与吸附质之间的范德华力作用进行吸附，且大孔树脂具有孔径结构复杂，比表面积大等优点，故可用于明日叶查尔酮的纯化。朱芳等[46]从12种大孔树脂中筛选出纯化效果最好的HPD-600，确定上样浓度 2mg/mL～3mg/mL，流速 3BV/h，上样量2.7 BV，洗脱条件为：用蒸馏水冲至无色后，改用4 BV，50%乙醇进行洗脱，总黄酮的纯度由14.46%提升至46.96%；王亦敏等[47]则采用AB-8大孔树脂分离明日叶总黄酮，条件为：蒸馏水为洗脱剂，大孔树脂粒径为30目，洗脱流速为15 mL/min，4-HD含量最高为29.08%。但大孔树脂洗脱只能优化总黄酮的提取纯度，并不能将各查尔酮类物质逐一分开。
2.2 柱层析法
2.2.1 常压柱层析法
常压柱层析法是天然产物分离最普遍的方法之一，根据其填料的不同分为硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱（Sephadex LH-20）等。分离、纯化各查尔酮衍生物，多选择几种层析法结合使用的方法。Matsuura等[48]将明日叶的粗提物用乙酸乙酯、氯仿-甲醇等不同展开剂，硅胶柱色谱梯度洗脱，得到5种查尔酮，占原料的0.29%。Akihisa等[14]则将硅胶柱色谱结合反式柱色谱与高效液相色谱，得到的9种查尔酮的纯度均高于95%，且XA含量最高为0.43 mg/g。
2.2.2 中、高效液相色谱法
中、高效液相色谱法（MPLC/HPLC）为柱色谱法的重要分支，通过对输液系统施加一定压力，加速各组分进入色谱柱，再经检测器进行检测。经HPLC后基本可获得高度纯化的查尔酮，比经典柱层析法有高速、高效、高灵敏度以及分析范围广等优点。李亚丽等[49]选择Hola C18柱，0.1%甲酸溶液-甲醇经HPLC梯度洗脱，于370 nm下检测，确定了XA与4-HD在各部位（干粉）的分布：茎 75、149 μg/g，根 144、122 μg/g，叶1.2、1.2 μg/g。Akihisa等[14]将明日叶的乙酸乙酯提取物采用MPLC反向色谱柱，甲醇为洗脱剂，流速3.0 mL/min得三大类查尔酮物质；进一步经HPLC反向制备柱，甲醇、水与乙酸体积比为 65∶35∶1，2.0 mL/min，成功分离出5种查尔酮，总提取率为112 mg/g渗出液。
2.2.3 高速逆流色谱法
高速逆流色谱法（high speed counter current chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液液分离色谱技术，适合天然生物活性成分的分离。Kil等[50]采用sephadex LH20结合HSCCC，选择体积比为：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=9∶5∶9∶4为洗脱剂，转速800 r/min，流速1.5 mL/min，成功分离了明日叶中两种主要查尔酮XA（0.359 mg/g干粉）与4-HD（0.044 mg/g干粉），纯度分别达到了99.9%与98.7%，是目前所得明日叶查尔酮纯度最高的分离方法。
3 明日叶查尔酮的抗衰老作用
3.1 衰老与抗衰老机理模型
衰老是由身体、心理以及一系列的外界环境，如辐射、环境污染、精神压力、过度劳累等共同作用引起的一种复杂的生命现象，如图1[52-53]所示。其发生机理说法不一。其中，英国学者Harman于1956年提出的氧化自由基学说是目前最具有说服力的学说之一[26]。该学说认为体内自由基可攻击DNA、生物膜脂质、蛋白质等生物大分子，造成机体衰老；而体内自由基清除系统或体外清除自由基物质（如查尔酮）的引入，可以通过抗氧化作用来减小或避免自由基对生物大分子的破坏，达到抗衰老的目的。生物体内常见自由基[51]有超氧自由基（O2-·）、羟自由基（HO·）、过氧自由基（ROO-）和过氧化氮自由基（ONOO-）等。
图1 衰老与抗衰老的自由基作用机理图
Fig.1 Scheme of aging and anti-aging mechanism of free radicals
美国衰老研究学者Sohal教授[54]指出了该学说的缺陷，并提出了氧化应激（redoxstress response，ROS）[55]的概念，即生物体因遭受各种有害刺激或随年龄的增长，氧化程度超出氧化物的清除速率，氧化系统和抗氧化系统失衡，体内高活性分子产生过多，进一步参与到包括细胞信号转导、细胞增殖、分化和凋亡等各种病理过程，从而导致组织损伤，以致衰老[56]。抗氧化过度表达不会延长小鼠的寿命，但轻度的氧化应激增加可延长寿命[57-58]。Manuel[59]通过回顾9个衰老标志后发现，基因组不稳定和线粒体功能障碍与ROS直接相关，其他表现为间接关系。故细胞氧化还原调节依然是抗衰老研究的重点。
明日叶查尔酮由于其特殊活性的结构决定了其在体内、外抗氧化，防衰老等方面发挥着独特功效。现阶段对明日叶抗氧化的研究主要为体外清除自由基与体内酶活性抑制阶段。
3.2 明日叶查尔酮抗衰老作用研究进展
3.2.1 体外研究
体外研究是利用抗氧化剂清除自由基能力来判断抗氧化作用的大小的研究方法。一般采用光谱分析法测定作用前后的吸光度来作出判断。
3.2.1.1 总抗氧化作用
氧化自由基清除能力即抗氧化能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），主要依据自由基破坏β-藻红蛋白的荧光性[60]，使荧光强度产生变化的原理，最早采用抗氧化剂作用下与荧光自然衰退下，衰退曲线面积的差，作为衡量抗氧化剂的抗氧化能力指标，选择维生素E水溶性类似物Trolox为定量标准[61]，现多使用荧光微孔板分析仪进行分析。如Kwon等[62]最早通过该方法，证明明日叶粗提物HO·的清除能力。
3.2.1.2 HO·清除
HO·作为体内最活泼的活性氧，可引发多种疾病，故对HO·的研究具有深远意义[63]。郭晓青等[64]于510nm下测定明日叶总黄酮清除费顿反应产生HO·能力，发现其对HO·有强清除作用，且总黄酮浓度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范围内，清除率与浓度呈正相关，最高为61.9%。
3.2.1.3 超氧阴离子自由基的清除
超氧阴离子自由基（O2-·）是人体内产生的一种可引发体内脂质过氧化反应，加快机体衰老的活性氧自由基之一，故日本Aoki等[65]利用次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系在体外产生O2-·的方法，将XA、抗坏血酸等与明日叶根提取的4种查尔酮xanthokeismins A、B、C、黄当归醇B作对比，利用超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒分别测定对O2-·的抑制活性，使用酶标仪于450 nm下测定，发现4种查尔酮均表现出强有效的O2-·抑制活性，半抑制率IC50约为0.51 μmol/L～1.1 μmol/L，抗坏血酸与 XA 的 IC50均大于40 μmol/L基本无抑制活性，即4种查尔酮可以通过某些程序抑制酶的活性间接抑制活性氧自由基的产生，首次从分子机制阐述了查尔酮的抗衰老活性。
3.2.1.4 ABTS+自由基清除
ABTS+自由基（2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐），是一种人工合成的显色剂，在适当的氧化剂作用下会被氧化成绿色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在时ABTS+自由基的产生会被抑制，可通过在734 nm或405 nm测定吸光度并计算出抗氧化剂的总抗氧化能力。如2010年，Aoki等[66]发现明日叶种子在萌芽过程中，种皮中存在大量查尔酮ashitabaol A，该查尔酮具有强的ABTS+自由基清除活性，半清除率SC50=13.8 μmol/L，可有效地缓解种子萌芽过程中产生的的自由基氧化损伤。
3.2.1.5 DPPH自由基清除
DPPH （1，1-二 苯 基-2-三 硝 基 苦 肼 ，2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基为人工合成的稳定自由基，其在517 nm处有强吸收，醇溶液呈紫色，当抗氧化剂存在时，抗氧化剂对DPPH自由基有一定清除作用，致使其单电子配对而造成吸收降低，故可采取分光光度法进行快速定量分析。如2016年，何月秋等[33]对比明日叶甲醇、乙醇提取物总黄酮的DPPH自由基清除效率，发现当甲醇提取物总黄酮质量浓度为129.87 μg/mL时，清除率在74%以上，继续升高后，清除率最大达75.7%，之后趋于平缓，IC50为5.06 μg/mL，而乙醇提取物总黄酮IC50仅为58.37 μg/mL。
3.2.2 体内研究
明日叶查尔酮体内抗氧化作用的评价主要通过查尔酮作用于细胞后，通过测定细胞中各酶含量的变化情况来判断。
候芳霖等[67]通过单核细胞直接细胞毒性测定法（mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay，MTT）考察明日叶查尔酮对荷H22肝癌小鼠抗氧化能力，通过检测各组小鼠瘤组织血清总SOD、脂质过氧化物（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Pχ）水平等，发现血清总 SOD活力与GSH-Pχ的含量均随明日叶查尔酮剂量的增加而呈现上升趋势，MDA呈相反趋势，充分证明高浓度查尔酮优异的体内抗氧化性；Luo等[68]采用液质联用（liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS） 的方法，以谷胱甘肽（glutataione，GSH）为底物，发现明日叶中异补骨脂查尔酮（Isobavachalcone）、XA、4-HD等可以与GSH迅速结合导致醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase 1，NQO1）诱导活动，因NQO1可将醌类如甲萘醌催化成氢醌，可提供防止醌介导的氧化损伤的保护[69]；Kim等[70]则将明日叶发酵汁、叶子、粉碎物等喂食肥胖大鼠，测定查尔酮对其影响，发现明日叶及其加工制品的摄入可通过增加高脂肪动物中抗氧化酶（过氧化氢酶和GSH-Pχ）的表达，消除肝脏中的活性氧，达到延缓衰老的目的。
4 结语
1）目前对明日叶查尔酮的提取、分离、纯化工艺虽已研究较多，但明日叶不同生长阶段、不同部位的查尔酮种类及含量会有所不同，研究极其复杂，获得一种绿色且高效的天然查尔酮纯品制备技术尚需更进一步研究；
2）目前明日叶查尔酮的抗衰老作用研究成果较少，特别是动物实验及临床实验研究数据还十分缺乏，另其作用机理仍未完全阐明，尚需研究工作者更深入的研究，为明日叶医药应用的开发提供理论坚实的理论和试验依据。
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