氧化应激（oxidative stress，OS）指机体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过多，导致氧化和抗氧化系统失衡，引起细胞或组织氧化损伤的一种病理状态[1]。ROS造成DNA、蛋白质和脂质等氧化损伤，破坏细胞结构和功能的完整性，引起细胞凋亡或坏死，与多种疾病发生相关[2-4]。
国内外研究氧化应激的模型大体分为动物模型和体外细胞培养模型两种，其中应用最广泛的体外细胞培养模型是H2O2氧化损伤模型[2]。H2O2作为活性氧类物质之一，不仅极易透过细胞膜，与细胞内铁离子反应生成高活性自由基，而且易于获得，性质稳定，已成为国内外研究各类细胞氧化损伤的重要工具[1，5-6]。
郑延松等利用100 μmol/L H2O2成功建立了心肌细胞氧化损伤模型[7]。Maheshwari等通过H2O2诱导睾丸精细胞凋亡模型研究其作用途径[8]。杨艳等利用250μmol/LH2O2诱导胰岛RIN-m5F细胞18h构建氧化应激模型[6]。常小洁等建立人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo氧化应激模型的条件为250 μmol/L H2O2诱导4 h[1]。齐晓龙等发现4 mmol/L H2O2处理肝细胞2 h可构建产蛋鸡原代肝细胞氧化应激模型[9]。熊普熹等利用H2O2介导人瓣膜间质细胞建立氧化应激细胞模型的条件为 800 μmol/L H2O2诱导 24 h[10]。
氧化应激体外细胞培养模型的研究对象不仅可以是正常细胞，而且可以是癌细胞。杜威等利用100μmol/L H2O2处理Caco-2细胞24 h诱导细胞氧化应激[11]。宋柬等发现环氧丙酰胺处理人乳癌细胞MDA-MB-231可诱导细胞氧化应激，表现在降低细胞存活率和细胞内GSH含量，提高细胞内ROS和MDA生成量[12]。王莉梅等研究表明，200 μmol/L α-亚麻酸作用 HepG2 细胞24 h，细胞形态发生明显改变，细胞大量生成ROS，SOD活性下降，MDA含量升高[13]。程晓晖等建立L-谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞氧化应激模型，最佳作用浓度为12mol/L，最佳作用时间为24h，其作用机制可能通过调控ERK、Caspase等信号通路来实现[14]。李媛等建立HepG2细胞氧化应激模型的条件为150 mmol/L D-半乳糖诱导48 h[15]。尹斌等利用200 μmol/L过氧化氢刺激人胃腺癌细胞株AGS 6 h建立应激性溃疡细胞模型[16]。
建立成功可靠的氧化应激模型，对于筛选抗氧化活性物质以及揭示其作用机制有重要意义。以人肝癌细胞HepG2为研究对象，利用不同浓度H2O2诱导不同时间，通过检测细胞内ROS水平和MDA含量，以及SOD、CAT和GSH-Px活性等指标，建立体外氧化应激细胞模型，为筛选抗氧化活性物质以及揭示其作用机制提供细胞学模型。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人肝癌细胞HepG2：南开大学；活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；DCFH-DA、胰蛋白酶、H2O2：美国Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清：美国Gibco公司；MTT检测试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）：美国Amresco公司；细胞板、培养瓶：美国Corning公司。
1.2 仪器与设备
5810R型高速冷冻式离心机：德国Eppendorf公司；MCO-20AIC型CO2培养箱：日本三洋公司；BSC-1300IIA2型生物安全柜：浙江苏净净化设备有限公司；Multiskan FC型酶标仪：美国Thermo Scientific公司；IX71型倒置荧光显微镜：日本Olympus公司；Countess型细胞计数仪：美国Invitrogen公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
将HepG2细胞按5×105个/mL接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。每2 d更换1次培养基，3 d后传代，细胞经0.25%胰酶消化，以1∶3的比例进行传代培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.3.2 细胞存活率检测
采用 MTT 法[5，17]。取对数生长期细胞，按 1×105个/孔接种于96孔板，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h，去除培养液，分为6组，每组3个重复，分别加入200μL含不同浓度H2O2的培养液，使H2O2终浓度分别为50、100、200、400、800 μmol/L，以未加 H2O2为对照。继续培养 2、4、6、8、10、12、14 h，去除培养液，PBS 洗涤 2 次，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，继续培养4 h，去除培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震荡10 min，570 nm波长下酶标仪测定各孔吸光值。
1.3.3 活性氧（ROS）检测
采用 DCFH-DA 法[6，18]。将各处理组细胞按 1×105个/mL接种于96孔板，每孔加入200μL细胞悬液，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，去除培养液，PBS洗涤2次，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA工作液200 μL，37℃培养30 min，去除培养液，PBS洗涤2次，每孔加入1 mL培养液，酶标仪测定荧光强度，其中激发波长488 nm，发射波长525 nm。
1.3.4 MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性检测
取各处理组细胞，PBS洗涤2次，加入0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，PBS洗涤1次，加入细胞裂解液（150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1%Triton X-100，pH 7.4）使细胞裂解，12 000 r/min离心 10 min，收集上清液，参照试剂盒说明书，测定细胞内MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性。
1.3.5 数据分析
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，数据以平均数±标准差（Mean±SD）表示，P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 H2O2对细胞存活率的影响
不同浓度（50、100、200、400、800 μmol/L）H2O2处理 HepG2 细胞不同时间（2、4、6、8、10、12、14 h），对细胞存活率的影响见图1。
图1 H2O2对HepG2细胞存活率的影响
Fig.1 Effect of H2O2on cell viability of HepG2 cells
由图1可知，各处理组HepG2细胞存活率随H2O2作用时间延长而逐渐降低。低浓度H2O2（50 μmol/L）的抑制细胞增殖作用不明显，细胞存活率在85%以上，高浓度H2O2（400 μmol/L和800 μmol/L）对细胞杀伤性较大，细胞存活率显著降低（P＜0.05）。100 μmol/L和200 μmol/L H2O2处理2 h，细胞存活率无显著变化，200 μmol/L H2O2处理4 h，细胞存活率降低为71.1%（P＜0.05），而 100 μmol/L H2O2处理 10 h，细胞存活率显著降低（P＜0.05），为 69.3%。
建立氧化应激模型时，细胞存活率通常在50%～70%范围内[9，19]。细胞存活率过高，无法造成明显的氧化损伤，而细胞存活率过低，则引起不可逆损伤，均不利于构建氧化应激模型。因此，以100 μmol/L和200 μmol/L作为H2O2氧化应激模型处理浓度。
2.2 H2O2对细胞内ROS水平的影响
不同浓度（100、200 μmol/L）H2O2处理 HepG2 细胞不同时间（2、4、6、8、10、12、14 h），对细胞内 ROS 水平的影响见图2。
由图2可知，H2O2对细胞内ROS含量的影响表现为明显的时间依赖性。各处理组ROS含量呈逐渐升高趋势，但作用时间较短（4 h），ROS含量变化无统计学差异。100 μmol/L H2O2处理 12 h，ROS含量显著升高（P<0.05），可达 123.7%，而 200 μmol/L H2O2处理 6 h，ROS含量即升高为127.1%（P<0.05），相同处理条件下，细胞存活率也显著降低（图1），分别为65.1%和63.1%，表明细胞已处于氧化应激状态。
图2H2O2对HepG2细胞ROS水平的影响
Fig.2 Effect of H2O2on ROS level of HepG2 cells
氧化应激模型的理想状态是细胞DNA损伤，细胞内脂质、蛋白质被破坏，这种损伤可能会导致细胞凋亡，但在适宜的抗氧化活性物质的作用下，却又有可能被修复[5-6]。因此，100 μmol/L 和 200 μmol/L 均可作为H2O2氧化应激的处理浓度，此浓度下作用一定时间可较好地诱导HepG2细胞损伤，却又避免了浓度过高导致的细胞不可逆损伤。
2.3 H2O2对细胞内MDA含量的影响
不同浓度（100、200 μmol/L）H2O2处理 HepG2 细胞不同时间（2、4、6、8、10、12、14 h），对细胞内 MDA 含量的影响见图3。
图3H2O2对HepG2细胞MDA含量的影响
Fig.3 Effect of H2O2on MDA content of HepG2 cells
如图3所示，对照组在不同时间点的MDA含量无显著差异，与对照组相比，各处理组MDA含量呈逐渐升高趋势。100 μmol/L H2O2处理 10 h，MDA 含量显著升高（P<0.05），可达 1.33 nmol/mg，而 200 μmol/L H2O2处理 6 h，MDA 含量升高为 1.31 nmol/mg（P<0.05），为对照组的135.1%。H2O2随时间延长表现出明显的细胞损伤效应，先是细胞功能的改变，损伤积累到一定程度即触发了细胞的器质性损害和不可逆损伤。
2.4 H2O2对细胞内 SOD、GSH-Px、CAT 活性的影响
不同浓度（100、200 μmol/L）H2O2处理 HepG2 细胞不同时间（2、4、6、8、10、12、14 h），对细胞内 SOD、GSH-Px、CAT活性的影响见表1。
表1 H2O2对细胞SOD、GSH-Px、CAT活性的影响
Table 1 Effect of H2O2on SOD、GSH-Px and CAT activities of HepG2 cells
注：a与对照组比较，P<0.05。
由表1可知，对照组在不同时间点的SOD、GSHPx和CAT活性均无显著差异。与对照组相比，各处理组的SOD、GSH-Px和CAT活性随作用时间延长而逐渐降低。200 μmol/L H2O2处理 6 h 后 SOD、GSH-Px和CAT活性显著降低（P<0.05），分别为对照组的77.28%、78.56%和77.41%。100 μmol/L H2O2处理10 h，SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.05），分别为对照组的78.49%和77.91%，处理12 h后CAT活性显著降低（P<0.05），为对照组的74.53%。
3 结论
利用H2O2诱导已成功构建多种细胞氧化应激模型[1，5-11，16]，其选择 H2O2诱导浓度各异，且诱导时间也不同，这可能是与所诱导的细胞、培养条件、实验环境等因素有关。利用200 μmol/L H2O2处理6 h或100 μmol/L H2O2处理12 h，HepG2细胞存活率显著降低，而且细胞内ROS水平和MDA含量均显著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性均显著降低，表明HepG2细胞的脂质和酶系均发生了显著变化，细胞已处于氧化应激状态，但是不会导致细胞不可逆损伤，在适宜的抗氧化活性物质的作用下，却又有可能被修复。鉴于100 μmol/L H2O2诱导细胞氧化应激所需时间较长，因此，选择200 μmol/L作为H2O2作用浓度，作用时间6 h，可以成功构建以H2O2为氧化应激诱导剂的HepG2细胞体外氧化应激模型，该模型的建立为揭示氧化应激机制提供细胞学模型，对于筛选抗氧化活性物质和功能性食品及研究其作用机制具有重要意义。
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