发芽是一种有效增加种子营养价值的方法。在种子发芽过程中，由于水解酶的合成和生物合成潜能的生成，营养成分结构得到修饰和一些新的化合物得以生成[1]，使得各种营养物质的利用率得到提高，并形成了很多对人类有益的物质和降低了抗营养因子的含量。通过种子发芽而形成的芽苗菜在《中国农业百科全书蔬菜卷》被列为按农业生物学分类的15类蔬菜之一。芽苗菜生长周期短，大部分7 d～12 d就可上市，可实现蔬菜的应急供应；芽苗菜产品营养价值高，栽培管理过程中不使用化肥和农药，较易达到绿色有机食品的要求，受到了城乡居民的青睐。而市场上常见的芽苗菜有黄豆芽、绿豆芽、萝卜苗、香椿苗、豌豆苗和荞麦苗等，产品种类较少，因此，芽苗菜产品种类的开发为芽苗菜研究的一个重要课题。
香菜，学名芫荽，为伞形科芫荽属一年或二年生草本植物，原产于地中海沿岸等地，现我国各地均有栽培[2]。香菜中富含钙、磷、铁、钾、胡萝卜素、维生素C等营养成分，还含有丰富的雌二醇、雌三醇和黄酮等[3]。香菜具有抗高血压降血糖、抗癌、护肾等活性，且其主要的有效成分为黄酮类物质[4]。黄酮类物质属于酚类化合物，是一类天然的抗氧化剂，具有较强抗氧化能力。本文以香菜为研究对象，研究香菜发芽过程中酚类物质和抗氧化活性的变化，以期为香菜芽苗菜的开发和科学食用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菜种子：北京绿山谷芽菜有限责任公司；没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚：Sigma公司；芦丁：国药集团化学试剂有限公司；福林酚、铁氰化钾、碳酸钠、水杨酸、氯化铝、三氯乙酸等化学试剂：分析纯。
1.2 仪器与设备
Scientz-12ND冷冻干燥机：宁波新芝生物科技有限公司；FA/JA电子分析天平：上海佑科仪器仪表有限公司；Multiskan Spectrum全波长酶标仪、Thermo-ultimate 3000高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RE52－86A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KQ-500DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苗菜培育
香菜种子经过筛选、除杂后，于体积分数1%的次氯酸钠溶液中浸泡30 min，用去离子水冲洗数次，用去离子水浸泡8 h后进行发芽生长，每隔12小时用去离子水清洗种子数次。每隔48小时取样，共取4次样品。样品经过液氮冷冻，冷冻干燥，液氮研磨粉粹过60目筛后，储存于-40℃冰箱中。
1.3.2 总酚、总黄酮及抗氧化性的测定
酚类物质的提取按照Xu[5]、Vale等[6]方法进行。取0.09 g冷冻干燥样品加入9 mL丙酮/水/乙酸（70∶29.5 ∶0.5，体积比）提取液，超声提取 20 min，10 000 r/min离心10 min。上清液用于总酚、总黄酮、FRAP、ABTS、还原力的测定。
总酚的测定利用福林试剂法，按照Müller等[7]的方法，稍作修改。在96孔微孔板中，取50 μL样品提取液加入50 μL福林试剂后，加入50 μL Na2CO3（7.5%），混匀后，黑暗条件下放置30 min，然后再750 nm条件下测定吸光度。以蒸馏水取代样品提取液作为对照，蒸馏水加入样品提取液以去除样品颜色的干扰。以没食子酸为标准建立标准曲线，结果用以每克干燥样品中没食子酸的质量（mg/g DW）表示。
总黄酮利用氯化铝按照Vale等[6]的方法来测定。在96孔微孔板中，取50 μL样品提取液加入20 μL NaNO2（5%），在25℃条件下静置5 min，然后加入20 μL AlCl3（10%）静置5 min。加入130 μL NaOH后，在510 nm条件下测定吸光度。以蒸馏水取代样品提取液作为对照，以芦丁为标准建立标准曲线，结果以每克干燥样品中的芦丁的质量（mg/g DW）表示。
FRAP分析按照Müller等[7]的方法进行。FRAP工作液由醋酸盐缓冲液（300 mmol/L，pH3.6，10 mmol/L），TPTZ（2，4，6-三吡啶基-S-三嗪，溶于 40 mmol/LHCl），20 mmol/L FeCl3以10∶1∶1的体积比混合而成。现配现用，用之前在37℃水浴中预热。在96孔微孔板中，去 10 μL样品提取液加入290 μL FRAP试剂，混匀，在37℃条件下孵化5 min，在593 nm条件下测定吸光度。用FeSO4做标准曲线，结果以每克干燥样品相当mmol/L Fe2+的毫摩尔（mmol/L Fe2+/g DW）表示。
ABTS自由基清除能力分析按照Wang等[8]的方法进行。ABTS工作液由ABTS溶液（7.7 mmol/L）和过硫酸铁溶液（2.45 mmol/L）混合配制而成，使用之前室温黑暗条件下存放12 h～16 h。在反应之前，用磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释，使之在734 nm条件下的吸光值为0.75～0.80。在96孔微孔板中，取10 μL样品提取液加入190 μL ABTS试剂，充分混匀。在黑暗条件下静置10 min后，在734nm下测定吸光度。用Trolox水溶性维生素E做标准曲线，结果以与每克干燥样品相当的水溶性维生素E微摩尔（μmol/L VE/g DW）表示。ABTS+自由基清除率按照如下公式：
式中：As为样液与反应液吸光度值；Ac为水与反应液吸光度值。
还原力的测定按照Zhang等[9]的方法进行。100 μL的样品提取液加入100 μL的铁氰化钾溶液（1%，溶于0.2 mol/L，pH 6.6磷酸缓冲液中）50℃孵化20 min，然后加入100 μL三氯乙酸（10%），3 000 r/min离心10 min。取 90 μL 上清液加入 50 μL 蒸馏水和 10 μL FeCl3混匀，静置30 min后700 nm下测吸光度值。以水代替样品液为对照，用Trolox水溶性维生素E做标准曲线，结果以每克干燥样品相当的水溶性维生素E微摩尔（μmol/L VEg DW）表示。还原力按照如下公式：
式中：As为样液与反应液吸光度值，Ac为水与反应液吸光度值。
1.3.3 酚类化合物含量的测定
取2.0 g冷冻干燥的样品，加入20 mL的甲醇/水/甲酸（80∶19∶1，体积比）溶液，完全混匀，超声提取20min，每10 min利用涡旋振荡器震荡1 min，然后3 800 r/min离心10 min。此过程重复2次，收集上清液。此上清液，40℃条件下利用真空旋转蒸发仪进行浓缩。然后将浓缩液进行冷冻干燥，冷冻干燥用1 mL甲醇/水（1∶1，体积比）溶液溶解，溶液过0.22 μm微孔滤膜过滤，用于高效液相色谱分析。利用配备有二极管阵列检测器（Diode array detector，DAD）的高效液相色谱仪进行测定。色谱柱为 Innoval Deo XD C18（250 mm×4.6 mm），流动相由AB两相组成，A相为0.1%的乙酸水溶液，B相为乙腈。流动相梯度条件为：0～5 min，15%B；5 min～15 min，25%B；15 min～28 min，35%B；28 min～32 min，40%B；32 min～40 min，95%B；40 min～47 min，15%B。柱温35℃，流速1.0 mL/min，进样量 20 μL，检测波长为280 nm。
1.4 数据分析
试验设3次重复，以平均值±标准差的形式表示，采用SPSS 20.0进行LSD差异显著性检验。两个变量之间的相关性用皮尔逊相关系数表示。
2 结果与分析
2.1 发芽对香菜总酚和总黄酮含量的影响
发芽时间对香菜总酚和总黄酮含量的影响见图1。
图1 发芽时间对香菜总酚和总黄酮含量的影响
Fig.1 Influence of germination time on total phenolics and total flavonoids of coriander
酚类物质是植物中的一种次级代谢产物，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌和抗炎等生物活性[10]。以往研究表明，发芽显著增加了总酚和总黄酮含量。Cevallos-Casals和Cisneros-Zevallos[11]研究表明发芽显著增加了绿豆、苜蓿、蚕豆、胡芦巴豆、芥末、小麦、花椰菜、向日葵、大豆、萝卜、甘蓝、扁豆和洋葱13个可食用种子酚类物质含量。Kumari等[12]研究发现，黑豆和黄豆发芽后总酚含量分别增加了17%和10%，总黄酮含量分别增加了21%和11%。Liu等[13]研究表明发芽显著提高了芝麻总酚含量的提高，芝麻种子中总酚含量为0.51mgGAE/g而发芽5天后，总酚含量达到了13.42mg GAE/g。在本研究中，由图1可知，在香菜发芽过程中，总酚含量呈现先增长后降低的局势。香菜发芽到4 d时，总酚含量达到最大值，为2.82 mg/g DW，是香菜种子总酚含量的2.15倍。随着香菜发芽时间的延长，香菜芽苗菜中总黄酮含量逐渐增加。香菜发芽到第8天时，总黄酮含量达到93.24 mg/g DW，是香菜种子总黄酮含量的2.63倍。因此，发芽显著增加了香菜总酚和总黄酮的含量。
2.2 发芽对香菜抗氧化性的影响
发芽时间对香菜抗氧化性的影响见图2。
由图2可知，发芽显著增加了香菜的抗氧化性，ABTS、FRAP和还原力表现出相似的增加趋势。香菜ABTS持续增加至第6天，而香菜ABTS在第6天和第8天时，无显著性差异。香菜发芽到6 d时，ABTS达到最大值，为48.97μmol/L VE/g DW，是香菜种子ABTS的2.04倍。香菜FRAP和还原力持续增加至第4天，在以后发芽过程中，香菜FRAP和还原力无显著性差异。香菜发芽到8d时，FRAP值为最大，是84.53mmol/L VE/g DW，是香菜种子FRAP的2.55倍。香菜发芽到8 d时，还原力值为最大，是35.89 μmol/L VE/g DW，是香菜种子还原力的1.73倍。
图2 发芽时间对香菜抗氧化性的影响
Fig.2 Influence of germination time on antioxidant activities of coriander
2.3 发芽对香菜酚类化合物的影响
发芽对香菜酚类化合物的影响见表1。
表1 发芽对香菜酚类化合物的影响
Table 1 Influence of germination time on phenolic compounds of coriander μg/g DW
注：ND表示未检出；同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。
以往研究表明，发芽可以对单体酚类物质产生不同程度的影响。Ti等[14]研究发现，发芽显著增加了糙米阿魏酸、香豆酸、丁香酸和咖啡酸的含量；Yang等[15]研究发现，发芽显著增加了小麦芽苗菜阿魏酸和香草酸含量。在本研究中，如表1所示，9种酚类化合物（没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚）在香菜中被检出。其中在香菜芽苗菜中含量最高的一种酚类化合物是绿原酸，但在香菜种子中未检出。此外，发芽显著增加了香菜绿原酸、没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸和柚皮素的含量，而显著降低了咖啡酸、槲皮素和山柰酚的含量。表明绿原酸、没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸和柚皮素等物质是香菜芽苗菜中抗氧化性的主要贡献者。
2.4 发芽过程中香菜总酚、总黄酮含量与抗氧化性之间的相关性
发芽过程中香菜总酚、总黄酮含量与抗氧化性之间的相关性见表2。
表2 发芽过程中香菜总酚、总黄酮含量与抗氧化性之间的相关性
Table 2 The correlations between total phenolics，total flavonoids and antioxidant activities
注：*表示在α=0.05水平（双侧）上显著相关（p<0.05）；**表示在α=0.01水平（双侧）上显著相关（p<0.01）。
总酚与ABTS、还原力间存在显著的相关性，总黄酮与ABTS、FRAP间存在显著的相关性，各项抗氧化性间均存在极显著的相关性。由于酚类化合物可作为氢或电子供体参与反应[16]，同时具有螯合金属离子的能力[17]，被认为很理想的抗氧化物。在本研究中，总酚、总黄酮与抗氧化性呈极显著正相关，说明酚类化合物是抗氧化性的主要贡献者。
3 结论
发芽显著增加了香菜总酚和总黄酮的含量，提高了香菜的抗氧化性。总酚、总黄酮与个抗氧化性指标间存在显著的相关性，说明酚类化合物是抗氧化性的主要贡献者。在本研究发现香菜芽苗菜中含量较高的一种酚类化合物是绿原酸，发芽显著增加了香菜绿原酸、没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸和柚皮素的含量，而显著降低了咖啡酸、槲皮素和山柰酚的含量。总之，发芽是一种可以有效提高香菜中酚类物质含量以及抗氧化性的处理方式。
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