藏红花素（crocin），又称为西红花苷、西红花素，是 以藏红花素I（crocin I）为主的一类水溶性类胡萝卜素，是中药材西红花中的一类主要药用成分[1-2]，也是药典中西红花的质量评价指标[3]，有着广泛而良好的药理作用。近年来国内外对其药理作用均有着深入广泛地研究，尤其是在抗癌[4-7]、抗氧化[8-11]、抗心血管疾病[12-14]等领域。此外，藏红花素I在抗炎、利肝、保护神经系统等方面均有良好的药理作用[15-19]，且其毒性较小，一般治疗剂量在临床和试验研究中都没有明显毒性[20-21]，安全性良好，可以作为一种潜力巨大的新兴药物成分进行广泛地开发与应用。
但由于西红花是一味产量稀少、价格昂贵的名贵中药材，从西红花中提取藏红花素I在实际的生产中面临着提取成本过于高昂的问题。而栀子黄色素（gardenia yellow pigment）是一种提取自中药材栀子（Fructus Gardeniae）的天然黄色素，是栀子的主要开发产品之一，广泛应用于食品、化妆品、保健品等领域，其主要成分是藏红花素I、还有少量的栀子苷、绿原酸及黄酮等[22-25]。作为一种同样富含藏红花素I且其成本相对低廉的替代提取物，栀子黄色素则成为了获取藏红花素I的重要资源，值得对其进行广泛地研究与开发。
本研究建立了一个从栀子黄色素中分离制备高纯度藏红花素I的工艺方法，进而对所得产物进行了初步的抗氧化性研究，并针对藏红花素I稳定性进行了研究，为后续藏红花素I的研究开发奠定了基础。
UNICO 2802型紫外-可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-III型循环水式多用真空泵；上海知信实验仪器技术有限公司；CP214型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；CHYSQ-II型超声波清洗器：诚洋生物科技（北京）有限公司；GG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；LGJ-10E型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；DK-98-II A型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。
栀子黄色素（540色价）：南阳泰瑞生物科技股份有限公司提供，规格E540；藏红花素I标准品（生产批号H2490050）：北京北纳创联生物技术研究院；柱层析硅胶（60目～100目，200目～300目）、薄层层析硅胶板（GF254）：青岛海洋化工厂分厂；色谱乙腈：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）[2，2`-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗坏血酸为分析纯：西陇化工股份有限公司；乙酸乙酯、甲醇、乙酸等均为分析纯：北京化工厂。
2.1.1 洗脱剂体系的筛选
综合查阅《中国药典》（2015版）中对于西红花中藏红花素I的薄层检测方法以及相关文献资料等[3，26-28]，发现在栀子黄色素相关试验中所使用的洗脱剂体系主要有氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇-水等，因而选取此两种体系进行薄层层析法的筛选考察。
2.1.2 薄层层析法考察洗脱剂体系
取硅胶薄层板于105℃的烘箱中活化30 min，取出冷却干燥，在距薄层板一端1 cm处用铅笔轻画一条水平线，备用。按比例配制展开剂，并向其中按每10 mL加入40 μL的比例加入乙酸以削弱其拖尾的程度。称取0.1 g栀子黄色素样品加入100 mL水，超声溶解，得到浓度为1 mg/mL的栀子黄色素样品溶液。称取5 mg藏红花素I标准品加入10 mL水，超声溶解，得到浓度为0.5 mg/mL的藏红花素I标准品溶液。取0.3 mm内径的毛细管分别点样，待样品点溶剂完全挥干后重复点样至2个毛细管体积，干燥后放入展开槽中进行预饱和，30分钟后进行展开。待展开剂前沿升至距薄层板顶端约1 cm处取出挥干展开剂，于紫外灯下观察或喷洒20%的硫酸乙醇溶液后观察现象。
2.2.1 硅胶柱层析法分离藏红花素I
称取柱层析硅胶（200目～300目）放置于105℃的烘箱中活化30 min，取出冷却干燥，与洗脱剂混合搅拌至均匀无气泡，快速匀速倒入层析柱中进行湿法装柱，静置沉降，备用。称取适量栀子黄色素样品用甲醇溶解，与等质量的柱层析硅胶（60目～100目）混匀、于40℃低温挥干溶剂后进行干法上样，洗脱，根据其色带收集各流分。将收集好的各流分于40℃旋蒸迅速挥干有机溶剂，加适量纯水稀释后，经0.22 μm滤膜过滤，用高效液相色谱进行含量测定。将测定出含有高纯度藏红花素I的水溶液放入冰箱中冷冻后，放入冻干机中除去溶剂，得到深红色的粉末即为藏红花素I单体。
2.2.2 上样量比例考察范围的筛选
首先进行预试验，选取柱层析硅胶∶栀子黄色素（质量比）为150∶1的比例进行上样洗脱，发现色带不清晰且洗脱效果较差；其次选用柱层析硅胶∶栀子黄色素（质量比）为300∶1的比例进行上样洗脱，发现出现了多个层次分明的清晰色带且洗脱效果良好。最终决定选取柱层析硅胶∶栀子黄色素（质量比）为150∶1、200∶1、250∶1、300∶1、350∶1、400∶1这 6种比例进行上样量因素的考察。
对6组不同吸附剂与上样量比值的层析柱进行洗脱，收集各流分。将收集好的各流分于40℃旋蒸迅速挥干有机溶剂，加适量纯水稀释后，采用HPLC法检测其中藏红花素I的纯度，并计算藏红花素I的得率和回收率。
藏红花素I得率R得的计算公式为：
藏红花素I回收率R收的计算公式为：
式中：m0为冻干后所得藏红花素I粉末的质量，mg；m1为上样时所用的栀子黄色素样品的质量，mg；m2为上样时所用的栀子黄色素样品中所含藏红花素I的质量，mg。
2.3.1 色谱条件
高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）条件参考 GB5009.149-2016《食品安全国家标准食品中栀子黄的测定》中的标准。
色谱柱为Waters XTerra MS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙酸-乙酸铵缓冲溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，80%A ～40%A；8 min ～8.1 min，40%A～30%A；8.1 min～13 min，30%A～2%A；13 min～20 min，2%A～80%A），柱温为 30℃，进样量为10 μL，流速为 1.0 mL/min，检测波长为 440 nm。
2.3.2 标准曲线的绘制
将藏红花素I系列标准工作液注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线的回归方程：y=83.79x+62.781，R2=0.999 6（y 为色谱峰面积，x为藏红花素I标准工作液浓度）。
2.4.1 相关工作液的配制
精确称量10 mg制得的藏红花素I粉末（栀子黄色素、抗坏血酸）至10 mL容量瓶中，加纯水定容，得到浓度为1 mg/mL的藏红花素I储备液。临用前将储备液加纯水稀释，得到不同浓度的藏红花素I工作液。
2.4.2 清除DPPH自由基试验
参考文献[29-32]的试验方法并结合实际进行调整设计。精确称取2mg DPPH试剂粉末至50 mL容量瓶中，用无水乙醇超声溶解、定容，得到浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，转移至100 mL三角瓶中。每组取1 mL DPPH乙醇溶液与等体积的不同浓度的样品工作液（藏红花素I、栀子黄色素）混匀，在室温下于暗处放置30 min。在波长为517 nm处测定其吸光度，每组平行测定3次，取平均值。选用抗坏血酸工作液作为阳性对照。观察记录结果，计算半数抑制浓度IC50。
DPPH自由基清除率RDPPH用如下公式计算：
式中：Ai为DPPH乙醇溶液与样品工作液反应后测得的吸光度；Aj为以水代替DPPH乙醇溶液时测得的吸光度；A0为以水代替样品工作液作为空白对照时测得的吸光度。
2.4.3 清除ABTS自由基试验
参考文献[33-35]的试验方法并结合实际来调整试验设计。精确称取0.192g ABTS试剂粉末至50 mL容量瓶中，用纯水超声溶解、定容，得到浓度为7 mmol/L的ABTS溶液，转移至100 mL三角瓶中。精确称取0.378 g过硫酸钾粉末加入至10 mL容量瓶中，用纯水定容，于40℃水浴超声溶解，得到浓度为140 mmol/L的过硫酸钾溶液。准确量取0.88 mL过硫酸钾溶液与50 mL ABTS溶液混合，于室温下在暗处反应24 h形成ABTS自由基储备液。使用前用纯水稀释80倍（至测样时的空白对照在波长为734 nm处的吸光度为0.7±0.02），得到ABTS工作液。每组取1 mL不同浓度的样品工作液（藏红花素I、栀子黄色素）与4 mL ABTS工作液混合，振荡30 s，于室温下在暗处反应6 min。在波长为734 nm处测定其吸光度，每组平行测定3次，取平均值。选用抗坏血酸工作液作为阳性对照。观察记录结果，计算半数抑制浓度IC50。
ABTS自由基清除率RABTS用如下公式计算：
式中：Ai为ABTS工作液与样品工作液反应后测得的吸光度；Aj为以水代替ABTS工作液时测得的吸光度；A0为以水代替样品工作液作为空白对照时测得的吸光度。
2.5.1 藏红花素I工作液的配制
精确称量5 mg制得的藏红花素I粉末，于50 mL容量瓶中，加纯水定容，得到浓度为0.1 mg/mL的藏红花素I储备液。临用前将储备液加纯水稀释10倍（至溶液在440 nm处的吸光度为0.8±0.2）得到藏红花素I工作液。
2.5.2 温度对藏红花素I稳定性的影响
量取一定量的藏红花素I工作液于试管中，密封，分别避光放置于6种不同的温度条件下（4℃冰箱、室温25℃、40℃水浴、60℃水浴、80℃水浴、100℃水浴）。每2小时测定一次吸光度（测量前将待测溶液恢复至室温），每组平行测量3次，取平均值。观察记录变化。
藏红花素I损失率R损用如下公式计算：
式中：A0为样品溶液放置前测得的吸光度；Ai为样品溶液放置后测得的吸光度。
2.5.3 光照对藏红花素I稳定性的影响
量取一定量的藏红花素I工作液于试管中，密封，在室温下分别放置于3种不同的光照条件下（黑暗避光处、室内日光灯下、阳光直射下）。每2小时测定一次吸光度，每组平行测量3次，取平均值。观察记录变化。藏红花素I损失率R损的计算公式同2.5.2。
2.5.4 pH值对藏红花素I稳定性的影响
量取一定量的藏红花素I工作液于试管中，用稀HCl和稀NaOH溶液调配出7种不同pH值梯度（2、4、6、7、8、10、12）的样品溶液，密封，在室温下放置于黑暗避光处。每2小时测定一次吸光度，每组平行测量3次，取平均值。藏红花素I损失率R损的计算公式同2.5.2。
2.5.5 常用食品添加剂对藏红花素I稳定性的影响
参考GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》及相关文献[36-38]，选取试验所用的食品添加剂种类及浓度。量取一定量的藏红花素I工作液于试管中，分别加入1%、5%蔗糖，0.05%、0.1%山梨酸钾，0.1%、0.5%抗坏血酸，超声溶解，密封，在室温下放置于黑暗避光处。每2小时测定一次吸光度。每组平行测量3次，取平均值，观察记录变化。藏红花素I损失率R损的计算公式同2.5.2。
洗脱剂体系的考察结果如表1所示。
表1 不同的展开剂体系的薄层层析（thin layer chromatography，TLC）结果
Table 1 TLC results of different expansion agent systems
展开剂种类 展开剂配比（体积比） 展开情况氯仿∶甲醇10∶1 未出现明显样品点5∶1 未出现明显样品点乙酸乙酯∶甲醇∶水100∶16.5∶13.5 出现了多个较为明显的样品点，但各点间的分离效果较差10∶3∶1 出现了多个较为明显的样品点，但样品点的分离效果较差10∶2∶1 出现了多个较为明显的样品点，但各点间的分离效果一般，而其中藏红花素I的Rf值偏小，为0.21 100∶20∶15 出现了多个较为明显的样品点，且各点间的分离效果较好，但其中藏红花素I的Rf值较小，为0.29 100∶25∶15 出现了多个较为明显的样品点，且各点间的分离效果较好，而其中藏红花素I的Rf值适中，为0.36
其中部分薄层结果如图1所示。
图1 TLC结果
Fig.1 TLC results
观察结果可以发现，氯仿-甲醇的展开剂体系分离效果很差，而乙酸乙酯-甲醇-水的体系中部分配比的分离效果较好。乙酸乙酯∶甲醇∶水=100∶16.5∶13.5（体积比）的体系是《药典》中对于西红花中藏红花素I的TLC检测体系，但试验证明其可能不适用于分离栀子黄色素中的藏红花素I成分。之后继续尝试加大展开剂的极性以增强分离效果，发现乙酸乙酯∶甲醇∶水=100∶20∶15（体积比）的比例对各组分的分离效果较好，但藏红花素I样品点的Rf值较低。而乙酸乙酯∶甲醇∶水=100∶25∶15（体积比）的比例中藏红花素I的Rf值较适宜，但其上端样品的Rf值较高。所以计划首先选择乙酸乙酯∶甲醇∶水=100∶20∶15（体积比）的比例洗脱掉前段其他组分后（洗脱剂用量达到1 400 mL左右时），加大其中甲醇的比例至乙酸乙酯∶甲醇∶水=100∶25∶15（体积比）来增强对藏红花素I组分的洗脱效果。
上样量因素的考察结果如表2所示。
表2 吸附剂与上样量之比与藏红花素I纯度关系
Table 2 The relationship between the ratio of adsorbent and sample loading and the purity of crocin I
吸附剂与上样量的质量比 藏红花素I纯度/%150∶1 93.46 200∶1 95.56 250∶1 97.72 300∶1 98.15 350∶1 98.39 400∶1 98.30
分析结果发现，可以确定本方法中最佳的吸附剂与上样量之比为350∶1，在此比例下可得到藏红花素I的纯度经HPLC检测最高为98.39%，其得率为15.58%，回收率为50.42%。
栀子黄色素原样品的HPLC图谱如图2所示。分离制备所得产品的HPLC图谱如图3所示。
图2 栀子黄色素原样品HPLC图谱
Fig.2 HPLC chromatogram of gardenia yellow pigment
图3 分离制备所得产品HPLC图谱
Fig.3 HPLC chromatogram of the isolated product
3.3.1 清除DPPH自由基试验
产品对DPPH自由基的清除能力如表3及图4所示。
表3 产品对DPPH自由基清除能力（IC50）
Table 3 DPPH free radical scavenging ability of product（IC50）
样品种类IC50/（μg/mL）藏红花素I 39.62栀子黄色素 54.35抗坏血酸 7.93
图4 产品对DPPH自由基清除能力
Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of product
由表3与图4可知，在藏红花素I和栀子黄色素工作液的浓度分别达到39.62 μg/mL与54.35 μg/mL时，可以半数清除浓度为0.1 mmol/L的DPPH自由基；在0～200 μg/mL的浓度范围内，各样品工作液清除DPPH自由基的效果随着样品浓度的上升而增强；而在浓度相同的情况下，藏红花素I清除DPPH自由基的效果较其分离纯化前的原料产品栀子黄色素略有上升。试验结果表明，藏红花素I和栀子黄色素均有一定的抗氧化活性，且经栀子黄色素分离纯化后所得到的藏红花素I的抗氧化能力略有所加强。
3.3.2 清除ABTS自由基试验
产品对ABTS自由基的清除能力如表4及图5所示。
表4 产品对ABTS自由基的半数清除浓度IC50
Table 4 ABTS free radical scavenging ability of product（IC50）
样品种类IC50/（μg/mL）藏红花素I 40.97栀子黄色素 60.17抗坏血酸 8.19
图5 产品对ABTS自由基的清除效果
Fig.5 ABTS free radical scavenging ability of product
由表4与图5可知，在藏红花素I和栀子黄色素工作液的浓度分别达到40.97 μg/mL与60.17 μg/mL时，可以半数清除浓度为0.1 mmol/L的ABTS自由基；在0～200 μg/mL的浓度范围内，各样品工作液清除ABTS自由基的效果随着样品浓度的上升而增强；而在浓度相同的情况下，藏红花素I清除ABTS自由基的效果较其分离纯化前的原料产品栀子黄色素略有上升。试验结果表明，藏红花素I和栀子黄色素均有一定的抗氧化活性，且经栀子黄色素分离纯化后所得到的藏红花素I的抗氧化能力略有所加强。
3.4.1 温度对藏红花素I稳定性的影响
温度对藏红花素I稳定性的影响如图6所示。
图6 温度对藏红花素I稳定性的影响
Fig.6 Effects of temperature on stability of crocin I
由图6可以发现，藏红花素I在4℃和25℃的环境下整体损失率较低，并且趋势较稳定，在放置12小时之后损失率只有2.59%和5.23%；在40℃和60℃的环境下损失率略有上升，放置12小时后分别达到了12.13%和19.26%；在80℃和100℃的环境下藏红花素I的整体损失率大幅上升，并且其损失速率也大幅升高，在放置12小时后达到了44.29%和72.98%。由此可见，温度因素对藏红花素I的稳定性影响较大，高温环境对其的破坏性较高。说明含有藏红花素I成分的产品在储存时应保持在40℃以下，并且应避免接触60℃以上的环境。
3.4.2 光照对藏红花素I稳定性的影响
光照对藏红花素I稳定性的影响如图7所示。
图7 光照对藏红花素I稳定性的影响
Fig.7 Effects of light on stability of crocin I
由图7观察试验结果可以发现，藏红花素I在黑暗避光处较为稳定，放置12小时后其损失率只有4.88%；在室内日光灯下的损失率略有上升，放置12小时后达到了18.84%；在阳光直射下的损失率大幅上升，放置12小时后达到了73.84%。由此可见光照因素对藏红花素I稳定性的影响较大，强光对其的破坏性较高。说明含有藏红花素I成分的产品在储存时应避光保存，并且避免强光直射。
3.4.3 pH值对藏红花素I稳定性的影响
pH值对藏红花素I稳定性的影响如图8所示。
图8 pH值对藏红花素I稳定性的影响
Fig.8 Effects of pH on stability of crocin I
由图8可以发现，藏红花素I在pH值为6的环境下较为稳定，放置12小时后损失率只达到了5.59%；在pH值=7、8的环境下的损失率略有上升，放置12小时后损失率分别达到了14.13%和23.35%；在pH值=2、4的强酸环境和10、12的强碱环境下损失率都大幅上升，放置12小时后分别达到了59.97%、55.27%和57.32%、66.17%。由此可见，pH值因素对藏红花素I稳定性的影响较大，强酸和强碱环境对其破坏性均较高，而藏红花素I工作液的初始pH值为6.2左右，其在pH值为6的环境下较为稳定。说明含有藏红花素I成分的产品应储存在pH值为6左右的环境中，并且避免接触强酸性和强碱性的环境。
3.4.4 常用添加剂对藏红花素I稳定性的影响
常用添加剂对对藏红花素I稳定性的影响如图9所示。
图9 常用食品添加剂对藏红花素I稳定性的影响
Fig.9 Effects of some common food additives on stability of crocin I
由图9可以发现，藏红花素I在0.05%山梨酸钾的环境中较为稳定，而在0.1%山梨酸钾的环境中损失率略有上升，放置12小时后其损失率分别为4.99%和7.37%；在1%和5%蔗糖的环境中损失率有一定的上升，放置12小时后分别达到了12.49%和13.63%；在0.1%和0.5%抗坏血酸的环境中的损失率较一般略有下降，放置12小时后其损失率只有4.04%和3.92%。由此可见，山梨酸钾对藏红花素I稳定性的影响不大；蔗糖对藏红花素I稳定性略有影响，并且在1%和5%蔗糖的浓度梯度下差异不大；而抗坏血酸则对藏红花素I有一定的保护作用，并且在0.1%和0.5%抗坏血酸的浓度梯度下差异不大。试验结果表明，藏红花素I可以与1%、5%蔗糖和0.05%、0.1%山梨酸钾和0.1%、0.5%抗坏血酸进行联用，并且其与0.1%、0.5%抗坏血酸联用还可提高其稳定性。
本研究采用硅胶柱层析法从栀子黄色素中分离制备出了高纯度的藏红花素I产品，经HPLC检测，纯度达98.39%，得率为15.58%，回收率为50.42%。体外抗氧化试验结果表明，藏红花素I具有较强的抗氧化活性，并且可以推测出藏红花素I为栀子黄色素中主要的抗氧化活性成分之一。稳定性试验结果表明，藏红花素I受高温、强光照射、强酸强碱环境影响均会产生一定量的损失。含有藏红花素I成分的产品应贮存于低温、避光、pH值为6的环境中，并且可以与适量的抗坏血酸联用以提高其稳定性。
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Study on Separation and Preparation of Crocin I with Its Antioxidation and Stability
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