图1 野生党参芦头和参尾外观图
Fig.1 Appearance of rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis
李瑞燕，来丽娜 * ，杨雪，王军霖
（长治医学院药学系，山西长治046000）
摘 要： 研究野生党参芦头和参尾的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）特征图谱，并对其含有的多种活性成分的含量进行比较，为指导党参芦头和参尾的合理利用提供依据。采用HPLC法对党参炔苷、苍术內酯Ⅲ及5-羟甲基糠醛的含量进行同时测定，采用苯酚-硫酸法测定党参多糖的含量，采用指纹图谱相似度评价系统（2008版）软件对野生党参芦头和参尾特征图谱进行分析。结果表明，野生党参芦头和参尾HPLC特征图谱的相似度达0.90以上，二者中主要成分均是多糖，参尾中的多糖、苍术內酯Ⅲ及5-羟甲基糠醛的含量远高于芦头，党参炔苷在芦头和参尾中的含量却相差不大。党参芦头和参尾的主要化学特征相似，芦头中含有的党参炔苷及主成分多糖具有很好的药用价值，仍然可以加以开发利用。
关键词： 党参芦头；参尾；高效液相色谱特征图谱；含量测定；相似度
党参是桔梗科植物党参的根，入药时，洗净泥沙后润透去芦、切片或切段 [1] 。古代以山西上党地区出产的党参为上品，具有补中益气、健脾益肺的功能，可用于治疗脾肺气虚、食少倦怠、咳嗽虚喘、气血不足、面色萎黄、心悸气短、津伤口渴，内热消渴 [2] 。芦身擅长补气血，而芦头则补气之力稍小，有涌吐风痰的作用，因此“自古参芦不入药”，恐系古人误以为参芦有催吐作用 [3] 。而国内学者对人参芦头的研究发现涌吐、耗气的记载缺乏理论依据，化学成分与主根相似，临床也有与主根相同的补益作用 [4] 。党参，作为特大宗药食两用品种，长期以来人们也是遵从药典将党参去芦头使用。而前期研究报道甘肃产党参芦头中参炔苷含量不低于参体中的含量，和参尾中的含量也并无太大差异 [5] 。秦蕾 [6] 也报道党参根和芦头所含化学成分相似，含量有所差异，证明了党参芦头具有保健及营养价值，阐明了将党参去芦头使用会造成党参资源的极大浪费。
因此，本试验拟首次通过研究潞城产多年野生党参芦头与参尾的特征图谱，同时对其中所含的多种活性成分的含量进行分析比较，旨在全面综合评价党参芦头和参尾的质量，为指导党参芦头和参尾合理有效的利用提供科学依据。
多年野生党参药材采自山西省潞城市北庄村。洗净晒干，切下芦头和参尾，采用3点法取样，随机分成3批。党参药材均由长治医学院生药教研室史琳婧老师鉴定，野生党参芦头和参尾外观见图1。
图1 野生党参芦头和参尾外观图
Fig.1 Appearance of rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis
党参炔苷对照品（HPLC≥98%，批号：111732-201607）、5-羟甲基糠醛对照品（HPLC≥98%，批号：111626-201610）、苍术內酯Ⅲ（批号：111978-201501）：中国食品药品检定研究院；D-无水葡萄糖：上海源叶生物科技有限公司；试验用水为双蒸水：由长治医学院药学系综合实验室自制；乙腈、甲醇：色谱纯；其他试剂均为市售分析纯。
Agilent 1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统（配备 Agilent G1311四元液相泵、手动进样器、柱温箱、DAD检测器）：美国安捷伦公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；BSA124S电子天平、FW80型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AS-20500A超声波清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；精密移液器：上海荣泰生化工程有限公司。
1.2.1 色谱条件
色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C 18 柱（4.6mm×250 mm，5 μm），检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10 min～40 min，10%～30%A；40 min～60 min，30%～50%A；60 min～70 min，50%～90%A；70 min～80 min，90%A）；进样量：20 μL。
1.2.2 对照品溶液的制备
精密称定党参炔苷对照品12.3 mg，加甲醇溶解，转移并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，制成质量浓度为1.23 mg/mL的党参炔苷对照品储备液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
1.2.3 供试品溶液的制备
取过80目筛的野生党参芦头和参尾粉末各约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声辅助（40 kHz，500 W）提取 30 min，放冷过滤，药渣重复提取1次，过滤，用甲醇少量多次润洗锥形瓶，合并滤液，旋蒸浓缩，浸膏再用甲醇超声溶解，定容至5 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。
1.2.4 方法学验证
1.2.4.1 空白溶剂的考察
取甲醇溶剂，在“1.2.1”项下色谱条件进样，结果表明空白溶剂无干扰。
1.2.4.2 精密度试验
取“1.2.3”项下制备的党参参尾供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件连续进样6次，以党参炔苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于 0.95%，相对峰面积的RSD小于2.32%，表明仪器的精密度良好。
1.2.4.3 重复性试验
取过80目筛的野生党参参尾粉末适量，按“1.2.3”项下方法平行制备党参参尾供试品溶液6份，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，以党参炔苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间RSD小于0.61%，相对峰面积的RSD小于1.78%，表明该方法重复性良好。
1.2.4.4 稳定性试验
按“1.2.3”项下方法制备党参参尾供试品溶液，分别在室温下放置 0、2、4、8、12、24 h 后按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，以党参炔苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间RSD小于1.24%，相对峰面积的RSD小于2.95%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
1.2.5 多糖含量的测定
1.2.5.1 葡萄糖对照品溶液的制备
取事先在105℃下干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加适量水溶解，转移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得476 μg/mL的溶液。
1.2.5.2 供试品溶液的制备
取党参芦头和参尾粉末（过80目筛）各约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加80%乙醇50 mL，超声（40 kHz，500 W）提取 30 min，抽滤，弃去滤液，残渣及滤纸挥干乙醇后加蒸馏水80mL，超声辅助提取30min，滤过，再加蒸馏水80 mL重复超声辅助提取1次，过滤，残渣及滤纸用水洗涤，洗液并入2次滤液定容至200 mL的容量瓶中，摇匀备用。
1.2.5.3 线性关系考察
精密吸取葡萄糖对照品溶液（476 μg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，分别加水稀释定容至 2.0 mL，然后分别精密加入5%苯酚1.0 mL，摇匀，再垂直快速精密加入浓硫酸5.0 mL，混匀，置沸水浴中加热15 min，然后冷却至室温。在490 nm处测定吸光度值 [7] 。以一系列不同浓度（μg/mL）的葡萄糖对照品溶液为横坐标X，以吸光度值为纵坐标Y，绘制标准曲线。
1.2.5.4 方法学验证
参照本文作者已发表文献 [7] 的方法进行试验，精密度、稳定性、重复性RSD值均小于3%，加样回收率试验测得加样回收率平均值为99.96%，RSD值为0.85%，均符合试验要求。
1.2.6 党参炔苷、苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛的含量同时测定
1.2.6.1 混合对照品溶液的制备
分别精密称定党参炔苷对照品12.3 mg，5-羟甲基糠醛对照品12.4 mg，苍术內酯Ⅲ对照品26.9 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，摇匀，分别制成质量浓度为1.23 mg/mL的党参炔苷对照品储备液、1.24 mg/mL的5-羟甲基糠醛对照品和2.69 mg/mL苍术內酯Ⅲ对照品储备液。用移液枪分别取3种对照品储备液800、800、200 μL置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。
1.2.6.2 供试品溶液的制备同“1.2.3”项下方法
1.2.6.3 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液0.2、0.6、0.8、1.5 mL分别加甲醇定容至5 mL容量瓶中备用。平行取“1.2.6.1”项下原混合对照品溶液，5份溶液分别用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“1.2.1”项下色谱条件，测定党参炔苷、苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛峰面积的积分值。以一系列不同浓度（μg/mL）的混合对照品溶液为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y进行线性回归，即得三者回归方程、线性关系（r）及线性范围，结果见表2。
1.2.6.4 仪器精密度试验
取混合对照品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，结果党参炔苷、苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛峰面积RSD分别为0.68%、1.21%、1.04%（n=6），表明仪器精密度良好。
1.2.6.5 重复性试验
取党参参尾粉末（过80目筛）适量，按“1.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，计算供试品中3种活性成分的含量，结果党参炔苷、苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛RSD分别为1.80%、1.46%、1.75%（n=6）。表明本方法重复性良好。
1.2.6.6 稳定性试验
取“1.2.3”项下制备的一份党参参尾供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24h 按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，结果党参炔苷、苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛峰面积RSD分别为1.30%、0.95%、1.12%（n=5），表明供试品在24 h内稳定。
1.2.6.7 加样回收率试验
取已知含量的野生党参参尾粉末各约1.0 g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入相当于样品含量100%的3种对照品，按“1.2.3”项下方法用甲醇25 mL超声辅助提取2次，滤液浓缩得浸膏，然后用甲醇定容至10 mL得供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液按“1.2.1”项下色谱条件测定，计算各成分的加样回收率。
取过80目筛的野生党参芦头和参尾粉末各适量，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，得HPLC特征图谱，比较各样品HPLC图谱中共有峰的数目，结果见图2。采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2008版）”软件，用中位数法多点校正，分别计算野生党参芦头和参尾与生成的对照图谱的相似度，结果见表1。
由图2可以看出，党参芦头和参尾的HPLC特征图谱主要特征峰相同，通过对样品各个峰进行比对分析，发现了10个共有峰；经与混合对照品图谱比对，其中1号峰为5-羟甲基糠醛，8号峰为党参炔苷，10号峰为苍术內酯Ⅲ。由表1相似度评价结果可知，党参芦头和参尾特征图谱相似度为0.904，说明党参芦头和参尾的主要化学成分差异不大。
图2 混合对照、党参芦头及参尾的HPLC特征图谱
Fig.2 HPLC specific chromatograms of mixed contrast、rhizomes and sterns of Radix Codonopsis
1.5-羟甲基糠醛；8.党参炔苷；10.苍术內酯Ⅲ；S1.党参芦头特征图谱；S2.党参参尾特征图谱。
表1 党参芦头和参尾HPLC特征图谱相似度评价结果
Table 1 Similarities evaluation of rhizomes and sterns of Radix Codonopsis by HPLC specific chromatograms
党参芦头和参尾中各成分的回归方程、线性关系（r）及线性范围，结果见表2。
表2 各成分的线性回归方程
Table 2 Equation of linear regression of four components
3种成分的加样回收率试验结果见表3。
表3 3种成分的加样回收率试验结果（n=6）
Table 3 The results of recovery test of three components（n=6）
续表3 3种成分的加样回收率试验结果（n=6）
Continue table 3 The results of recovery test of three components（n=6）
取党参芦头和参尾粉末（过80目筛）各适量，分别按照“1.2.3”和“1.2.5.2”项下方法制备供试品溶液，测定并计算党参芦头和参尾中各成分的含量，结果见表4。
表4 党参芦头和参尾各成分的含量
Table 4 Contents determination of four components in rhizomes and sterns of Radix Codonopsis mg/g
注：*芦头和参尾相应成分含量比较具有显著性差异（P＜0.05）。
本研究前期比较了不同提取溶剂（甲醇和乙醇）、提取方法（超声和回流），结果发现超声辅助提取和回流提取无明显差异，考虑到超声辅助提取操作简便且耗时短，所以选用超声操作；选用甲醇作为提取溶剂时，能尽可能完全地提取出药材中所含的有效成分；选用甲醇作为溶剂进行超声辅助提取获得的供试品溶液采用HPLC法进行测定，发现色谱峰信息较丰富、峰面积较大。
筛选了流动相体系（乙腈-水 [9-10] 、甲醇-水 [11-12] 、乙腈-0.1%磷酸溶液 [13-14] 、乙腈-0.5%磷酸溶液）采用HPLC进行测定，发现采用乙腈-0.5%磷酸溶液作为流动相时峰个数较多、色谱峰峰分离度较好；不同检测波长（220、256、267 nm）下获取数据，结果发现选用波长256、267 nm处苍术內酯Ⅲ吸收很小，而在220 nm时党参炔苷、苍术內酯Ⅲ及5-羟甲基糠醛三者均有较大吸收，且样品的HPLC图谱峰形较好、不与其他色谱峰发生重叠，多数成分在220 nm处均有较好的响应，故最终确定选用流动相为乙腈-0.5%磷酸溶液、检测波长在220 nm处进行检测。
党参含有多糖类、植物甾醇类、萜类、生物碱类、苯丙素苷类等多种化学成分，其中多糖类所占比例最大 [15] ，是其有效成分之一，也是评价党参质量优劣的主要指标。因此本研究采用经典的苯酚-硫酸法测定党参中多糖的含量，发现潞城产多年党参芦头和参尾中均主要含有多糖类成分，在参尾中多糖的含量是芦头的近100倍。
王峥涛从不同产地党参属19种党参及一个变种素花党参中首次分离得到倍半萜内酯类化合物苍术内酯Ⅲ，其具有很好的抗炎活性，并指出是否含有苍术内酯Ⅲ可作为潞党参的一个重要的鉴别和质量评价手段 [16-17] ；5-羟甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化、增进血红细胞变性等药理活性 [18] ，邹利研究发现米炒党参饮片后5-羟甲基糠含量增加，从而对胃肠平滑肌的兴奋性收缩起到调控的作用，是党参健脾功效增强的物质基础之一 [19] ；此外2015版药典仅将党参炔苷（薄层鉴别）作为党参指标性成分，但是在一些代用品和掺伪品中也能检测到党参炔苷。因此党参炔苷只能作为党参的一般化学标示物，而不能作为特征化学标示物单独用于党参的鉴定 [20] 。综合考虑，反映党参的整体质量需要研究其所含的化学组成分。因此，本研究对以上3种活性成分（党参炔苷、苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛）的含量进行同时测定以全面综合评价党参的整体水平，研究结果发现在芦头中苍术內酯Ⅲ和5-羟甲基糠醛的含量远低于参尾，具有显著性差异（P＜0.05）；在党参芦头和参尾中党参炔苷的含量较为接近。这与赵晓华 [5] 报道的甘肃产党参不同部位中党参炔苷的含量分析一致。
目前，指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的有效方法。它能有效地检测和控制中药产品的真实性、质量的一致性及稳定性 [21] 。因此，本研究在多指标成分进行含量测定的同时结合中药特征图谱进行全面综合的质量评价，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2008A版）对党参芦头和参尾的特征图谱进行了比较分析，相似度在0.90以上，主要化学特征相似，确定了10个共有峰，但共有峰的高度和峰形等细节存在些许差异。
党参的销量是逐年增加的，现在每年的销量在30 000 t以上。芦头重量占主根重量的8%～15%，如果按每100克党参去芦头8 g计算，那一年至少弃去党参芦头2 400 t。有研究报道党参炔苷可以保护乙醇造成的胃黏膜损伤 [22] ，本研究发现党参芦头中党参炔苷的含量和参尾中基本接近，推测芦头在胃黏膜保护的功效方面可能不亚于参尾，未来可以将芦头运用到酿酒工业中制作营养类保健酒。另外，芦头中含有的主要成分多糖具有增强机体免疫 [23] 、抑制肿瘤 [24] 、延缓衰老 [25] 等功效，也可以运用到保健品、化妆品等领域。因此，党参带芦头入药既能极大地提高资源利用率，又能保证经济价值最大化。
综上所述，本研究运用特征图谱结合多种活性成分定量对潞城产野生党参芦头和参尾进行了全面分析，结果发现党参芦头和参尾具有相似的化学特征，其中质量标志性成分（党参炔苷）含量相差不大，其余3种活性成分的含量有所差异，党参芦头和参尾中均主要含有多糖成分。后续除了从化学成分的角度来考察二者的异同外，还会结合药理药效作用对党参芦头与参尾进一步进行药效学比较研究，以全面评价芦头与参尾一同入药的必要性。
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Quality Evaluation of Rhizomes and Sterns of Wild Radix Codonopsis
LI Rui-yan，LAI Li-na * ，YANG Xue，WANG Jun-lin
（Department of Pharmacology，Changzhi Medical College，Changzhi 046000，Shanxi，China）
Abstract： The aim is to establish the high performance liquid chromatography（HPLC）specific chromatograms for content determination of multiple components having bioactivities in rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis，which provided basis for rational utilization of the rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis.The HPLC was adopted to simultaneously quantify lobetyolin，atractylenoideⅢ and 5-hydroxymethyl furfural.The content of polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method.The HPLC specific chromatograms were analyzed by similarity evaluation system for chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine（TCM）（version 2008）.The study showed the similarity in HPLC specific chromatograms between rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis was more than 0.90，and the main ingredient was polysaccharides，the contents of polysaccharides，atractylenoideⅢ and 5-hydroxymethyl furfural were more abundant in sterns than in rhizomes，but the contents of lobetyolin were almost the same in rhizomes and sterns.The main chemical feature was similar in rhizomes and sterns of Radix Codonopsis，both the lobetyolin and the principal polysaccharides had good medicinal values.In the future，rhizomes of Radix Codonopsis could be exploited as a high-quality resource.
Key words： rhizomes of Radix Codonopsis；sterns；high performance liquid chromatography （HPLC）specific chromatograms；content determination；similarity
LIRuiyan，LAILina，YANGXue，et al.QualityEvaluationof Rhizomes and Sterns of Wild Radix Codonopsis[J].Food Research and Development，2018，39（19）：141-146
李瑞燕，来丽娜，杨雪，等.野生党参芦头与参尾的质量评价研究[J].食品研究与开发，2018，39（19）：141-146
引文格式：
*通信作者： 来丽娜（1974—），女，教授，硕士，主要研究方向：中药药理学。
作者简介： 李瑞燕（1981—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：中药有效成分的提取与质量控制。
基金项目： 山西省重点研发计划（山西省中药现代化关键技术研究振东专项基金）（2016ZD0103）
DOI： 10.3969/j.issn.1005-6521.2018.19.025
收稿日期： 2018-04-17