植物中花青素含量测定及种类分布研究

摘要：选取黑枸杞、紫薯、蓝莓、沙棘、玫瑰王、山楂、樱桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、红提、巨峰葡萄、金银花、贡菊、菊花、胎菊和野菊花等17种不同植物含花青素高的部位，包括根、茎、花，采用酸性乙醇溶液提取其中花青素含量，通过高效液相色谱法分析得到不同样品中花青素的分布，以花青素为变量对不同样品中花青素聚类分析，结果表明：矢车菊色素在植物中分布最广，天竺葵色素分布最少，自然界中花青素样品可分为4大类。研究有利于对可能含花青素样品的了解，为企业选料，原料溯源等提供技术支持。

花青素（anthocyanidin）属黄酮类化合物，又称花色素，是广泛存在于植物中的水溶性天然色素。据统计27个科，73个属的500多种植物含有花青素[1]，以葡萄皮、蓝莓、黑枸杞等含量最为丰富[2-11]。花青素因其资源丰富和安全无毒，同时拥有一定的营养和药用价值，在食品，医药、化妆品等方面拥有较大的发展市场。自然界中现已知的花青素有20多种，主要有天竺葵、矢车菊素、飞燕草素、甲基花青素、牵牛花色素和锦葵色素6种。自然界中花青素少以游离态的形式出现，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖等通过糖苷键形成花色苷，已被发现天然存在的花色苷有250多种，可从不同植物中提取获得。花青素营养价值高，研究者们试图寻找花青素含量丰富的植物原料，从中提取花青素并投入到商业生产，开拓花青素应用市场。已投入商业生产的有葡萄皮色素，浆果类（草莓、杨梅、枸杞、蓝莓），紫薯等。

为实现花青素质量控制，需要采用合适的方法对其进行检测。花青素常用检测方法有紫外分光光度法，高效液相色谱法和高效液相色谱法/质谱联用法。紫外分光光度法常用于花青素总量的检测，往往受pH值、温度等外在条件影响，同时也会受原花青素、花白素等物质的干扰，分析结果往往偏高，灵敏度低。高效液相色谱法适用于分析样品中不同种类花青素的含量，相对高效液相色谱联用质谱成本低，需要标物才能定性样品。高效液相色谱联用质谱法常用于样品中花青素种类的全分析，获取信息更全[12-14]。花青素的检测根据检测目标物不同，可以分为检测花色苷和检测花青素母核。自然界中花色苷存在形式繁多。例如，黑枸杞[15]中花青素存在有飞燕草素-3-O-葡萄糖苷，矮牵牛素-5-O-葡萄糖苷，矮牵牛素-3-O-6-O-对香豆酰）芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷，锦葵色素-3-O-6-O-对香豆酰-3-O-乙酰）-5-O-二葡萄糖苷，飞燕草-3-O-6-O-乙酰）葡萄糖苷，锦葵色素-3-O-6-O-对香豆酰）葡萄糖苷和锦葵色素-3-5-二葡萄糖苷等；巨峰葡萄中含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，锦葵色素-3-O-葡萄糖苷，锦葵色素香豆素葡萄糖苷，矢车菊素乙酰葡萄糖苷，甲基矢车菊素乙酰葡萄糖苷，锦葵色素乙酰葡萄糖苷，甲基矢车菊素香豆素葡萄糖苷，甲基矢车菊素葡萄糖苷等形式花色苷。不同样品中花色苷形式不同，加之标准物质昂贵，有些甚至根本没有标准物质，因此检测花色苷存在一定困难；由于自然界中花青素的母核主要有6种，选取合适试验试剂，采用适当的方法将样品中花色苷水解成花青素单体后，便能实现不同种样品中花青素的统一检测，解决了因花色苷标物购买难而导致花青素检测困难的问题，是一种简单可行的方法。

本文选取黑枸杞、紫薯、蓝莓、沙棘、玫瑰王、山楂、樱桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、红提、巨峰葡萄、金银花、贡菊、菊花、胎菊和野菊花等17种不同植物含花青素高的部位，包括根，茎或花。参照“NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》，用酸性无水乙醇溶液从不同植物中提取花青素，通过高效液相色谱法准确定量其中主要花青素的含量。旨在通过对不同植物中花青素含量的研究，指导企业及相关机构实现花青素的质量控制，为开拓花青素应用市场奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑枸杞、紫薯、蓝莓、沙棘、玫瑰王、山楂、樱桃、黑桑葚、青提、黑葡萄、红提、巨峰葡萄、金银花、贡菊、菊花、胎菊、野菊花：超市。

无水乙醇、甲酸、甲醇（均为色谱纯）：德国默克股份两合公司；盐酸（优级纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；无水乙醇+水+盐酸（2∶1∶1，体积比）。

飞燕草色素（Delphinidin，Dp，94.7%），矢车菊色素（Cyanidin，Cy，95%），矮牵牛色素（Petunidin，Pt，94.1%），天竺葵色素（Pelargonidin，Pg，93%），芍药色素（Peonidin，Pn，97.6%）和锦葵色素（Malvidin，Mv，94.8%），均为盐酸盐形式：Sigma-Aldrich。

1.2 仪器与设备

BSA323S-CW电子天平：赛多利斯公司；Agilent 1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；SK2510LHC超声提取仪：上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

参照NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》样品前处理方法，准确称取0.5 g～2 g样品于50 mL具塞比色管中，加入无水乙醇+水+盐酸（2∶1∶1，体积比）定容至刻度，摇匀，超声提取30 min后，于沸水浴中水解1 h，取出后冷却，用无水乙醇+水+盐酸（2∶1∶1，体积比）定容。静置，取上清液，用0.45 μm水相滤膜过滤，待测。

色谱柱：Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，2.5 μm），流动相：A，1%甲酸水溶液；B，1%甲酸乙腈溶液；流速0.8 mL/min；梯度洗脱，0～2.0 min流动相B从8.0%～12.0%；5 min，18%B；10.0 min，20%B；12 min，25%B；15 min，30%B；18 min，45%B；20 min，80%B；22 min～30 min，8%B；检测波长：530 nm；柱温：35 ℃。

2 结果与分析

2.1 不同植物样品中花青素含量的测定

由于R1、R2取代基团不同，导致6种花青素在色谱柱上保留时间不同而实现分离，6种花青素出峰顺序如图2所示。

采用高效液相色谱配备二极管阵列检测器，在530 nm测得植物中6种花青素紫外吸收，样品中花青素谱图如图3所示。

表1 6种花青素线性方程及相关系数
Table 1 The linear equation and regression coefficient of six different anthocyanins

表2 不同植物中花青素的含量
Table 2 Anthocyanin content in different plants以干基计，mg/kg

注：ND表示未检出。

根据浓度和峰面积做标准曲线（6种花青素线性方程及相关系数如表1所示），求得各样品中花青素的准确含量，结果以干基计，结果见表2。

如表1所示，采用液相色谱分析6种花青素，其相关系数（r）均≥0.999 8。表明液相色谱法可用于样品中6种花青素含量检测。从表2结果发现，6种花青素在不同植物体中的分布不同，其含量差异大。6种花青素在样品中的最高检出分别为：飞燕草色素596 mg/kg；矢车菊色素1 025 mg/kg；矮牵牛素4 671 mg/kg；天竺葵色素21 mg/kg；芍药色素1 005 mg/kg；锦葵色素1 000 mg/kg。其中矢车菊色素在植物中分布最广，这也是现行紫外分光光度法采用矢车菊色素作为标物，来测定样品中花青素含量的主要原因；其次，天竺葵色素分布最少，仅玫瑰王和黑桑葚中有检出。飞燕草色素主要存在于黑枸杞，蓝莓，沙棘和黑葡萄中；除黑枸杞和菊花类物质外，其余样品中均含有矢车菊素，以蓝莓中含量最高；矮牵牛色素在黑枸杞，蓝莓和黑葡萄中均有检出，且黑枸杞中含量最高。天竺葵色素不仅在植物界分布少，且其在植物中含量还很低；芍药色素是仅次于矢车菊色素分布较广的色素，尤以玫瑰王中检出最高；锦葵色素在黑枸杞、蓝莓、黑葡萄、巨峰葡萄中均有检出，其中蓝莓中含量最高。

为了更加清晰地了解不同植物中花青素的分布，不同样品中花青素分布见图4。

图4可以发现，黑枸杞中花青素含量高，蓝莓次之，菊花类产品中均未检出任何种类花青素，有研究表明，菊花中主要含黄酮类、黄酮醇类等物质[17-19]，有较强抗氧化自由基活性以及抗菌及抗病毒活性，是菊花类植物体内重要的抗氧化活性物质。此外，还发现蓝莓和黑葡萄中花青素在所检植物中种类较为齐全，均含有飞燕草色素，矢车菊色素，矮牵牛色素，芍药色素和锦葵色素。结果表明，蓝莓和黑葡萄是花青素摄入的最佳选择。在所检样品中还发现，金银花中含有75 mg/kg矢车菊色素。金银花和菊花皆是植物饮料的主要原料，由此可以推断，金银花可作为植物饮料中花青素的重要来源之一。

2.2 不同植物样品中花青素聚类分析

以花青素含量为指标，采用系统聚类分析法对17种样品进行聚类分析，得到结果如图5所示。

从图5中发现，聚类分析结果与样品中花青素总量分布有相似趋势，除黑枸杞，蓝莓和玫瑰王外，剩下样品可分为一类，共计4类。花青素在植物样品中分布可大致为黑枸杞，蓝莓，玫瑰王及其他。对其分组情况进行判别，得到全部组散点图，如图6所示。

从图6中发现，除黑枸杞，蓝莓和沙棘外，其他样品的质心均较为集中。黑枸杞和沙棘较蓝莓又更为离散，可能是因为黑枸杞中含有高含量矮牵牛色素，而其他样品中矮牵牛色素含量较低，甚至没有；沙棘中花青素主要为飞燕草色素，也是其他样品中含量较少的一种花青素。不同植物样品中花青素的聚类分析，有利于对可能含花青素样品的了解，为企业选料，原料溯源等提供技术支持。

图6 17种样品系统判别函数全部组散点图
Fig.6 All group scatter plot of 17 kinds of samples system discriminant function

3 结论

通过高效液相色谱法分析得到不同样品中花青素的分布；同时，以花青素为变量对不同样品中花青素聚类分析后，结果表明：矢车菊色素在植物中分布最广，天竺葵色素分布最少，蓝莓和黑葡萄是花青素摄入的最佳选择，金银花可作为植物饮料中花青素的重要来源。自然界中花青素样品除黑枸杞，蓝莓，玫瑰王外，其他样品中花青素分布相似，含量并不高。因此，黑枸杞，蓝莓和玫瑰王可作为花青素主要原料来源。

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Study on the Determination of Anthocyanin Content and Its Species Distribution in Plants

PENG Zu-mao，DENG Meng-ya，YAN Yu-yu，ZHU Li，ZHANG Xie-guang*
（Shenzhen Academy of Metrology&Quality Inspection，Shenzhen 518131，Guangdong，China）

Abstract：A total of 17 different plants including black wolfberry，purple sweet potato，blueberry，sea buckthorn，rose，hawthorn，cherry，black mulberry，grapes，honeysuckle，chrysanthemums were chosen to investigate the distribution of anthocyanin.The extracts were obtained by acid ethanol solution，and the method of high performance liquid chromatography （HPLC）was used to determine the contents of anthocyanin in different plants.Clustering analysis was adopted to know the distribution of anthocyanin in different plants.The results showed that the cyaniding was the most widely distributed in plants，and the pelargonidin was the least，the plants with anthocyanins in the natural world could be divided into 4 categories.This study is beneficial to the understanding of the possible anthocyanin samples，and provide technical support for the selection of enterprises and the source tracing of the raw materials.

Key words：anthocyanin；high performance liquid chromatography（HPLC）；clustering analysis

基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2017QK161）；深圳市计量质量检测研究院科技项目（2016-YA21）

作者简介：彭祖茂（1989—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品营养。

*通信作者：张协光（1985—），男（汉），高级工程师，本科，研究方向：食品营养。

彭祖茂，邓梦雅，严虞虞，等.植物中花青素含量测定及种类分布研究[J].食品研究与开发，2018，39（17）：100-104

PENG Zumao，DENG Mengya，YAN Yuyu，et al.Study on the Determination of Anthocyanin Content and Its Species Distribution in Plants[J].Food Research and Development，2018，39（17）：100-104