表1 6种罗汉果甜苷的质谱分析参数
Table 1 Ms parameters for analysis of 6 mogrosides
牟俊飞1，王韶旭2，罗琴1，王鹏程2，黄四新2，苏小建3，陈旭2，梁成钦2，周先丽1，*
（1.桂林医学院生物技术学院，广西桂林541004；2.桂林医学院药学院，广西桂林541004；3.桂林思特新技术公司，广西桂林541004）
摘 要：利用高效液相色谱串联质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS），分析比较不同产地罗汉果中6种罗汉果甜苷（11-氧-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IV、赛门苷I、罗汉果皂苷III E和罗汉果皂苷II E）的含量，同时利用该方法分析罗汉果甜苷提取和大孔树脂D101纯化过程中该6种成分的含量变化情况。样品经甲醇超声提取，色谱分离采用ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），梯度进行洗脱，柱温25℃，流速0.5 mL/min。质谱分析采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI），正离子模式检测。结果表明：6种甜苷在0.75 mg/L～9.00 mg/L范围内呈现良好的线性关系（r＞0.9975），检测限为0.38 mg/kg～1.28 mg/kg，平均加样回收率89.3%～105.6%。经分析测定发现，桂林市永福百寿乡适宜种植高品质罗汉果，利用大孔树脂D101可很好地进行罗汉果甜苷富集和纯化，同时利用的HPLC-MS方法，可为罗汉果种植和生产提供质量分析控制方法。
关键词：罗汉果；高效液相色谱串联质谱；罗汉果甜苷；检测；含量
罗汉果为葫芦科罗汉果属植物罗汉果[Siraitia grosvenorii（Swing le）C.Jeffrey]的果实，主要分布于我国广西桂林地区，属于桂林地区特有的经济和药用植物[1]。罗汉果性凉，味甘，归肺脾经，有提神生津、清热润肺、祛火止咳、滑肠通便等效用，被人们誉为“神仙果”，也是国家首批批准的药食两用材料之一[1-3]。罗汉果主要含有甜苷类化学成分，该成分具有清肺利咽，化痰止咳，润肠通便，调节免疫，抗病毒和抗肿瘤的功效[4-6]。罗汉果甜苷具有低热量、高甜度、无毒和无吸收的特点，作为蔗糖的替代品，目前被国内广泛使用[7]。
由于罗汉果甜苷的重要功用，所以加强罗汉果种植品质及罗汉果甜苷产品的质量控制显得尤为重要。文献调研发现，高山林等[8]采用紫外分光光度法对大、中、小不同重量的罗汉果的总甙含量测定了，发现含量有一定差别。刘金磊等[9]采用紫外分光光度比色法（UV-vis）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对不同品种和桂林几个不同县的罗汉果鲜果进行了总甙、甙V含量测定。由于桂林是喀斯特地区，小范围内的地形和气候差别也较大，所以本文拟采用高效液相色谱串联质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法对罗汉果主要的两个种植大县永福县和临桂县不同乡镇的同一品种罗汉果中的6种罗汉果甜苷进行了含量测定对比，其结果对罗汉果的推广种植和精准扶贫有现实指导意义。
目前罗汉果甜苷一般选择薄层扫描法和HPLC法检测[10-12]。薄层扫描法灵敏度低，重现性不好，而HPLC法如果使用紫外检测器，由于罗汉果甜苷的化学结构决定其一般只在210 nm附近有较弱的紫外吸收，而该波长下背景干扰也较大，会影响检测的灵敏度。另外，HPLC法需要充分把各甜苷峰分开，有时会需要较复杂的分离条件和较长的分析时间。而HPLC-MS法同时结合了色谱与质谱的优点，具有分离度好、选择性高、灵敏度高、分辨率高、分析速度快等优点[13]，因此，可利用此技术测定罗汉果甜苷。经文献调研发现，周凌和朱吟吟两位学者[14]利用HPLC-MS方法考察了真空低温干燥法对罗汉果中10个皂苷含量的影响。其方法是利用美国安捷伦1290高效液相色谱仪、6430串联质谱仪和poroshell 120-SB柱，以乙腈－甲酸水溶液为流动相进行梯度分离，用负离子模式检测。在本论文中，我们尝试了利用周凌和朱吟吟两位学者的方法，从我们自身试验条件出发采用HPLC-20AD高效液相色谱仪、8030串联质谱仪和ZORBAX SB-Aq色谱柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm），对 6种罗汉果甜苷（11-氧-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IV、赛门苷I、罗汉果皂苷III E和罗汉果皂苷II E）进行含量测定，但结果很不理想，发现所测的罗汉果甜苷的目标峰响应灵敏度较低，检测限低，不能满足样品测定要求，因此我们根据我们的条件，经探索并最终选用选择离子监测模式（selected ion monitoring，SIM）进行检测，利用阳离子模式建立6种罗汉果甜苷的检测方法，并用该方法进行比较分析不同产地罗汉果中6种罗汉果甜苷的含量，及罗汉果甜苷提取和大孔树脂D101纯化过程中该6种成分含量的变化情况，可为罗汉果种植和罗汉果甜苷生产方面的质量控制提供支持。
罗汉果样品采摘于广西桂林市永福百寿乡、永福堡里乡、临桂飄里乡和临桂茶垌乡。
LC-MS8030液相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；BT224S电子天平：北京塞多利斯仪器系统有限公司；B2200S-7超声波仪：上海必能信超声有限公司；HB-IIIA循环泵：郑州长城科工贸有限公司。
甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；甲醇：分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司。
6种标准品11-氧-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IV、赛门苷I、罗汉果皂苷III E和罗汉果皂苷II E：均为桂林医学院药学院植物化学实验室自制，纯度均大于98%。
1.3.1 样品前处理
将罗汉果样品用自来水冲洗，再用二次蒸馏水冲洗，置于烘箱中烘干（60℃）后，用粉碎机将其粉碎，保存在干燥器中备用。准确称取1.000 0 g粉末，加入50 mL甲醇，在锥形瓶中超声（120 W，40 kHz）1 h后取出，补重，0.45 μm微孔膜过滤后待测。对照品溶液的制备：精密称取6种罗汉果甜苷各1.0 mg，混合置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。各对照品储备液浓度都为100.00 μg/mL。
1.3.2 液相色谱-质谱分析条件
ZORBAX SB-Aq 色谱柱（4.6 mm×150 mm 5 μm），柱温为25℃，流速0.50 mL/min，进样量为1 μL。流动相：二元梯度模式，A：水；B：色谱甲醇，梯度洗脱程序为（0～8 min 50%B；8 min～10 min 50%～55%B；10 min～34 min 55%B；34 min～37 min 55%～62%B；37 min～51 min 62%B；51 min～55 min 62%～100%B）。
质谱条件：离子源为电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正离子扫描模式，选择离子监控模式（SIM），干燥气温度为400℃；干燥气流速为15 L/min；雾化气压力为230 kPa；毛细管电压为3.5 kV。在分析过程中，以选择离子和保留时间进行定量分析，6种罗汉果甜苷保留时间、选择离子详见表1，标准物质的选择离子总离子流图见图1。
表1 6种罗汉果甜苷的质谱分析参数
Table 1 Ms parameters for analysis of 6 mogrosides
图1 6种罗汉果甜苷混合标准品色谱图
Fig.1 6 mogrosides standard samples chromatogram
出峰顺序：1.11-氧-罗汉果皂苷V；2.罗汉果皂苷V；3.罗汉果皂苷IV；4.赛门苷I；5.罗汉果皂苷III E；6.罗汉果皂苷II E。
分别精确吸取一定体积的混合对照品储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度得到0.75、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg/mL 不同浓度的混合对照品溶液，每个浓度平行3份。按“1.3.2”色谱条件下测定。进样 1 μL，以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），计算其回归方程，检测限按信噪比3∶1计算，结果见表2。结果表明：6种罗汉果甜苷浓度在0.75 mg/L～9.0 mg/L内呈良好线性关系，相关系数均大于0.997 5，检出下限（LOD，S/N=3）为 0.38 mg/kg～1.28 mg/kg，定量下限（LOQ，S/N=10）为 1.14 mg/kg～3.84 mg/kg，能满足罗汉果药材中6种罗汉果甜苷含量的检测要求。6个罗汉果皂苷的线性范围、相关系数、检测线（limit of de tection，LOD）及定量限（limit of quantity，LOQ）见表2。
以浓度为4.5 μg/mL的混合对照品溶液进行重复进样8次，按“1.3.2”项下的色谱条件操作，以峰面积计算，结果11-氧-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IV、赛门苷I、罗汉果皂苷III E和罗汉果皂苷II E的RSD值处于4.21%～8.16%之间，表明仪器精密度良好。
表2 6种罗汉果甜苷回归方程、相关系数、检出下限、定量下限、及相对标准偏差
Table 2 Standard curves，correlation coefficient，detection limits，quantification limit and relative standard deviation of 6 mogrosides
取同一批次来自永福堡里乡的样品粉末约50.0mg，共6份，按“1.3.1”项下制备供试品溶液，在“1.3.2”色谱条件下测定峰面积，并计算含量。结果显示，6份样品中6种罗汉果甜苷的RSD值处于3.51%～9.03%之间，说明方法重复性良好。
在 0、2、4、6、8、10、12 h 和 24 h 时间段对浓度为4.5 μg/mL的混合对照品溶液进行测定，结果表明6种主要罗汉果甜苷在24 h内稳定性良好，能满足含量测定的要求。
准确称取同一样品9份，每份50.0 mg，分3水平加入浓度分别为 15.0、25.0、35.0 μg/mL 混合标准品溶液各1 mL，按“1.3.1”进行处理，定量至5.0 mL；按“1.3.2”项下色谱方法测定分析，计算6种主要罗汉果甜苷的回收率（见表3），6种主要罗汉果甜苷标准品和罗汉果样品色谱图（见图2）。结果表明6种主要罗汉果甜苷加样平均回收率为89.3%～105.6%，相对标准偏差为1.9%～6.5%符合分析要求。
表3 6种罗汉果甜苷加样回收率
Table 3 Recoveries of 6 mogrosides
图2 样品加标色谱图
Fig.2 Chromatogram of sample after adding standard
出峰顺序：1.11-氧-罗汉果皂苷V；2.罗汉果皂苷V；3.罗汉果皂苷IV；4.赛门苷I；5.罗汉果皂苷III E；6.罗汉果皂苷II E。
2.6.1 不同产地罗汉果样品的测定
取来自永福百寿乡、永福堡里乡、临桂飄里乡和临桂茶垌乡的4批罗汉果样品，分别精密称取粉末2.000 0 g，并按“1.3.1”项下操作，制备罗汉果供试品溶液，在“1.3.2”色谱条件下测定，测定结果见表4。
不同产地罗汉果6种罗汉果甜苷含量差异较大，其含量在0.001 0%～0.110 7%之间，其中永福堡里乡和永福百寿乡这两个乡的罗汉果含量较高。
表4 不同产地罗汉果6种甜苷含量
Table 4 Test results of 6 mogrosides from different places
2.6.2 大孔树脂D101纯化罗汉果甜苷所得样品的测定
将收集于永福堡里乡的罗汉果样品干燥粉碎。准确称取100.0 g粉末，加入500 mL甲醇，在锥形瓶中超声（120 W，40 kHz）1 h后取出，过滤并减压回收溶剂。取所得浸膏溶解于100 mL蒸馏水中，过滤去除不溶物后，利用大孔树脂D101进行吸附，并利用酒精水溶液（0%、30%、50%、70%、95%）进行梯度洗脱，洗脱液分别减压浓缩并干燥，得6种不同酒精浓度洗脱组分。分别精密称取粉末5.000 0 mg两份，一份置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制备成浓度为1.00 mg/mL供试品溶液，在“1.3.1”色谱条件下测定，测定结果见表5。
表5 D101吸附后不同浓度酒精洗脱组分的6种甜苷含量
Table 5 Content of 6 mogrosides of alcohol elution components at different concentrations after D101 adsorption
注：N.D.表示未检测出。
D101吸附后不同浓度酒精洗脱组分的6种甜苷含量差异较大，它们主要含量集中在50%～95%酒精洗脱部分，特别是Mogroside-V在70%酒精洗脱部分浓度最大。
本研究建立罗汉果中6种罗汉果甜苷含量的液相色谱-串联质谱检测方法，并对该方法的灵敏度、准确度、精密度作了考察。该方法与其它方法比较更为简便，缩短了分析时间，简化了样品的前处理过程，增加了提取效率。其次，运用该检测方法快速、简便、灵敏度高，符合多种罗汉果甜苷分析检测的要求，适合罗汉果中6种主要罗汉果甜苷的测定。
另外，罗汉果甜苷的相对分子质量较大，我们在方法建立过程中曾尝试优化质谱条件，采用多反应监测（multi reaction monitoring，MRM）模式，正离子扫描，努力找出测定罗汉果甜苷的两个定性定量离子对，并进行方法优化。但结果发现，所测的罗汉果甜苷的目标峰响应灵敏度较低，检测限低，不能满足样品测定要求，因此本方法最终选用选择离子监测模式（SIM）进行检测。
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Determination of Content of 6 Kinds of Mogrosides in Siraitia grosvenorii by Using HPLC-MS/MS
MOU Jun-fei1，WANG Shao-xu2，LUO Qin1，WANG Peng-cheng2，HUANG Si-xin2，SU Xiao-jian3，CHEN Xu2，LIANG Cheng-qin2，ZHOU Xian-li1，*
（1.Biotechnology Institute，Guilin Medical University，Guilin 541004，Guangxi，China；2.College of Pharmacy，Guilin Medical University，Guilin 541004，Guangxi，China；3.Guilin Site New Technology Company，Guilin 541004，Guangxi，China）
Abstract：A method for the determination of six mogrosides（11-oxo-mogroside-V，mogroside-V，mogroside-IV，siamenoside-I，mogroside-IIIE and mogroside-IIE）in Siraitia grosvenorii was established and validated by （high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）.And this method was used to analyze the concentrations of the 6 components of Siraitia grosvenorii of different habitats and the products from the process of the purification of sweet glycosides of Siraitia grosvenorii.The samples were extracted with methanol by using ultrasonic.The extracts were separated by ZORBAX SB-Aq column （4.6 mm×150 mm，5 μm）with gradient elution，and temperature was 25℃，and speed was 0.5 mL/min.The mass spectrometric conditions were electrospray ionization （ESI），positive ion mode.The results showed that this six compounds had good linear relationship （r＞ 0.997 5）.In the range of the detection limits were 0.75 mg/L-9.00 mg/L，the detection limits were 0.38 mg/kg-1.28 mg/kg，the average recoveries were 89.3%-105.6%.The analysis showed that Yongfu county Baishou town is suitable for planting high quality Siraitia grosvenorii，using macroporous resin D101 can easily enrich and purify the sweet glycosides of Siraitia grosvenorii.In additional，using the method of HPLC-MS can provide methodological support for the establishment of the cultivation and production quality standards of Siraitia grosvenorii.
Key words：Siraitia grosvenorii；high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）；mogrosides；detection；content
引文格式：牟俊飞，王韶旭，罗琴，等.HPLC-MS法测定罗汉果中6种罗汉果甜苷含量[J].食品研究与开发，2018，39（15）：139-144
MOU Junfei，WANG Shaoxu，LUO Qin，et al.Determination of Content of 6 Kinds of Mogrosides in Siraitia grosvenorii by Using HPLC-MS/MS[J].Food Research and Development，2018，39（15）：139-144
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.15.027
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科能14123006-21）；桂林医学院大学生创新创业训练计划项目（201610601055）；桂林市科学研究与技术开发计划项目（20160219-2）
作者简介：牟俊飞（1992—），女（汉），硕士研究生，主要从事分子医学研究。
*通信作者：周先丽（1979—），女（汉），副教授，博士，主要从事天然药化和药理学研究。
收稿日期：2018-01-02