SOD 的稳定性及修饰的研究

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609；3.天津市食品安全检测技术研究院，天津300308）

摘要：为了获得活性较高且稳定性强的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），比较牛奶、木瓜、酵母菌3种不同来源的SOD，考察它们在不同pH值、温度、外源性试剂干扰条件下的稳定性。结论为牛奶中SOD的稳定性优于木瓜和酵母菌，牛奶中提取的SOD活性值为116 608 U/g。为使其更好的发挥作用，采用月桂酸对牛奶中SOD酶进行修饰，最终产品的酶活性值为115 127 U/g。

SOD是超氧化物歧化酶（super oxide dismutase）的英文缩写，又名为肝蛋白，是一种源自生命体的活性物质[1]。SOD属于金属酶范畴，按其结合的金属离子来区分可分为三类：第一类含有铜和锌，称为Cu、Zn-SOD，也是最常见的一种，颜色呈蓝绿色，主要存在于真核生物细胞中。第二类含有锰，故称为Mn-SOD，颜色呈粉红色，主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中。第三类含有铁，称为Fe-SOD，颜色呈黄褐色，主要存在于原核生物及某些植物叶绿体中[2]。

由于超氧化物歧化酶广泛存在于各类生物体中，能使生物体内超氧自由基（O2-·）发生歧化反应，成为生物体内O2-·的天然消除剂，可对生物体细胞起到保护作用。因此，SOD在帮助生物体防御O2-·的毒性、抗衰老、消炎甚至预防肿瘤等方面起着重要的生理作用。这使得SOD近年来被广泛应用到日用品，食品，医疗等方面。在我国，关于SOD研究应用的深度和广度已居酶类生化制剂的首位[3-4]。

随着对SOD的深入研究，如今SOD的提取来源也相当丰富，目前比较常见的是从植物中、微生物中、动物源性食品中提取SOD。本研究对木瓜、酵母菌、牛奶中提取到的SOD进行了稳定性考察并对SOD粗提物进行修饰。

1 材料和方法

1.1 材料与主要试剂

新鲜牛奶：天津市海河乳业有限公司；木瓜（湖北常阳产）：市售；酵母菌：天津市啤酒厂；三羟甲基氨基甲烷（Tris）：美国sigma公司；盐酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钾：天津市化学试剂一厂；三氯甲烷、异丙醇、丙酮：天津市北方天医化学试剂厂；月桂酸：天津市永大化学试剂有限公司；氯化亚砜：天津市天新精细化工开发中心；小牛血清蛋白：罗氏制药有限公司；戊二醛：中国医药集团；壳聚糖：南凯博化工产品有限公司；甘氨酸：河北华阳生物科技有限公司；邻苯三酚：天津市津东天正精细化学试剂厂，以上试剂均为分析纯；实验用水为二级实验水。

1.2 设备与主要仪器

GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器厂；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AB265-S型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

新鲜牛奶→加入无水乙醇→一次提取→离心分离→二次提取→离心分离上清液浓缩→冷冻干燥→粗酶液。

称取新鲜木瓜→用粉碎机打碎→加入0.1 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液搅拌均匀浸提2 h→离心→向提取液中加入三氯甲烷-氯仿充分混匀→粗酶液。

向酵母泥加入异丙醇浸泡2 h→抽滤出异丙醇→加入50 mmol/L pH 7.0的磷酸钾缓冲液搅拌后静置2 h→离心后除去菌体→用HCl调节pH值→加入丙酮萃取→粗酶液。

A液的配置：pH8.20的0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含 1 mmol/L EDTA·2Na）。称取1.211 4 g Tris和37.2 mg EDTA·2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100 mL。

B液的配置：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚（A.R）56.7 mg溶于少量10 mmol/L盐酸溶液，并定容至100 mL。

称取0.089 6 g（精确到0.000 1 g）修饰后的SOD提取物，将其用蒸馏水稀释至10 mL，在离心机中于4 000 r/min离心。取离心后的上清液1.0 mL用蒸馏水定容到250 mL，备用。

在紫外-可见分光光度计上于320 nm下测定空白试剂1 min后的吸光变化值，记做△A320（min-1）。空白试剂的△A320（min-1）应为0.060左右。本试验测得空白试剂的A320为0.0894，1分钟后的A320为0.1502，则空白试剂的△A320（min-1）为0.060 8，满足试验要求，可继续测定样品。

为了增强SOD的稳定性，本研究选择3种不同的修饰剂对所提取的3种SOD进行修饰，通过测定修饰后SOD剩余酶活性来确定修饰率，最终选择出3种SOD合适的修饰方法[8]。修饰剂分别为月桂酸、牛血清白蛋白、壳聚糖。

在通风橱内安装回流装置，使月桂酸和氯化亚砜在75℃的水浴锅中反应2 h，后在90℃～95℃水浴中反应2 h。将反应物分馏、减压，除去过量的氯化亚砜，收集146℃～150℃馏分物月桂酰氯。

准确称取SOD冻干粉0.5 g，溶于pH8.0的0.002 mol/L磷酸盐缓冲液中。缓慢加入上述馏分物月桂酰氯，同时，加入0.1 mol/L NaOH溶液维持pH值，立即将水浴升温至42℃搅拌1 h，收集。冷却后加入1倍体积的冷丙酮，离心后收集沉淀物并将其溶于适量蒸馏水中，再次离心，取上清液，透析后冻干，即得月桂酸-SOD。

准确称取SOD冻干粉0.5g，溶于pH8.0、0.005 mol/L的磷酸缓冲溶液中。称取牛血清白蛋白0.5 g与SOD冻干粉混合均匀，置于冰浴中，缓慢加入25%戊二醛，放置1 h，加入甘氨酸20 mg使反应中止。透析冻干即得牛血清白蛋白修饰SOD。

将0.08 g纳米磁性Fe3O4加入100 mL去离子水中超声，再加入10 mL 0.75 mol/mL的NaOH溶液，充分搅拌；将0.16 g壳聚糖加入到质量分数为1%的醋酸溶液使壳聚糖溶解，再将壳聚糖溶液滴加到上述Fe3O4的NaOH溶液中。

称取0.2 g制备后的壳聚糖，用0.1 mol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲液溶胀。将0.1 g的SOD冻干粉和0.2 g溶胀的壳聚糖加入到40 mLpH=7.5磷酸盐缓冲液中，并滴加质量分数为25%的戊二醛0.2 mL，在恒温摇床中于20℃振荡120 min，用磁铁将固定化的SOD沉淀，倾出上清液，即得壳聚糖修饰的SOD[9]。

2 结果与分析

2.1 考察不同原料中提取的SOD的稳定性

对上述3种原料中提取的SOD的稳定性进行了考察，主要考察pH值稳定性、不同温度下的稳定性、外源性试剂稳定性3个方面。

将 SOD 酶分别置于 pH3、4.5、6、7.5、9、10.5、12 不同的pH值下，分别于60 min后测定它们的酶活力。pH值稳定性见图1。

图1 3种不同来源SOD的pH值稳定性
Fig.1 pH stability of three SOD

通过考察，pH7～8之间时3种SOD活力保存良好，3种SOD蛋白的活力残留率都可以保持在88%以上。当pH值偏酸性时，SOD的活力会随着pH值的升高而开始增加；在碱性pH值范围内时，SOD活力随着碱性的增强而降低，在考察中发现牛奶中提取的SOD的整体活力保存最好，酵母中的SOD活性次之，而木瓜中SOD的整体活力保存最差。

将 SOD 酶液分别于 25、37、50、60、80 ℃下保存24 h后，测定它们的酶活力。不同温度下SOD蛋白的稳定性见图2。

图2 三种不同来源SOD蛋白的热稳定性
Fig.2 Heat stability of three SOD proteins

通过考察发现，当温度为25℃时3种不同来源的SOD的酶活力均达到最高，随着温度的升高，3种SOD酶的活力开始下降，当温度达到80℃时，3种SOD酶彻底失活。牛奶中提取的SOD酶在温度低于50℃时均表现出较稳定的状态，当温度高于50℃时其酶活性开始大幅度衰减，温度高达80℃时，其中的酶活性基本为零。3种SOD中，牛奶中SOD酶活力保存较好，木瓜中提取的SOD次之，酵母中SOD的活力保持最差。

SOD酶作为活性物质对于不同试剂的耐受性存在着较大的差异，此次选择SOD提取工艺中常用的67%的甲醇、67%的乙腈提取试剂，以及1 mol/L盐酸胍、3 mol/L尿素和50 mmol/L双氧水等常用缓冲剂作为此次考察的外源试剂。SOD蛋白对外源试剂的耐受性见图3。

图3 三种不同来源SOD的对外源试剂的耐受性
Fig.3 Acitivty rate of three SOD

木瓜中SOD对67%甲醇和67%的乙腈的耐受性表现较好，分别为84%和65%，但其对3 mol/L尿素、1 mol/L盐酸胍和50 mmol/L双氧水3种试剂的耐受性较差；此次考察中酵母菌对5种外源试剂的耐受性均在40%以下；而牛奶中的SOD对外源试剂的耐受性表现较好，其SOD的活力均保持在80%左右。根据测试结果显示，牛奶中SOD对5种外源试剂的耐受性明显优于木瓜和酵母菌中提取的SOD。

通过考察不同来源SOD蛋白在上述条件下的稳定性，得出结论：牛奶中的SOD蛋白在不同pH值、不同温度及对外源性试剂的干扰方面的稳定性较为理想。故选择牛奶作为提取原料进行试验，并对从其中提取的SOD做进一步修饰，提高其稳定性。

2.2 SOD酶活力的测定结果

针对牛奶中提取的SOD我们采用经典邻苯三酚自氧化法测定其SOD活性，SOD酶活力的测定采用邻苯三酚自氧化法规定每分钟反应液中SOD抑制邻苯三酚自氧化速率50%时为一个SOD活力单位[10]。

在紫外-可见分光光度计上采用波长扫描程序，在波长200 nm～600 nm范围内对提取物进行扫描，检测邻苯三酚自氧化产物波长吸收规律。利用紫外-可见分光光度计测得的SOD紫外吸收光谱图，见图4。如图4所示，牛奶中SOD的最大吸收波长出现在319 nm处，这与GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定》[10]中的试验条件320 nm相符，故本试验采用320 nm为试验的测定的波长。

图4 SOD的紫外吸收光谱图
Fig.4 UV absorption spectrum of SOD

取数支10 mL离心管，向离心管中加入A液2.35 mL、B液0.15 mL、一定量的蒸馏水及样液，整个试验过程中A液均应恒温于25℃。试验数据及相应的△A320（min-1）值见表1所示。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定加样表
Table1 Pyrogallot autoxidation rate test volume table

根据上表试验数据显示，当稀释后的酶液加入量为90 μL时，△A320（min-1）的值为0.029 9，近似于50%的自氧化速率空白值，满足试验要求。将酶加入量为90 μL时的相应数值代入公式。根据公式：

式中：A320为邻苯三酚的自氧化速率；A'320为样液抑制邻苯三酚自氧化速率；V1为反应液总体积，本次实验中为4.5 mL；V为加入样液的体积，本次实验中为0.2 mL；D为样液稀释倍数；m为样品质量。

2.3 3种修饰方法的比较

测定上述3种修饰剂后的SOD吸光值，并计算修饰率。向上述3种修饰酶中加入1 mL 4%NaHCO3，1 mL 10%十二烷基硫酸钠，充分溶解20 min；加入1 mL 0.1%三硝基苯磺酸，在40℃的水浴中保温2 h，用0.5 mL，1 mol/L HCl终止反应，利用紫外-可见分光光度计于350 nm处测定吸光值[11]。修饰结果见表2。

表2 修饰后SOD的剩余酶活力
Table2 The left enzyme activity after modification

由表2可以得出，针对牛奶中提取的SOD考察了牛血清白蛋白、月桂酸、壳聚糖对其的修饰作用，月桂酸修饰SOD的得率最高。根据修饰后SOD的剩余活性和修饰率，本研究最终选定利用月桂酸修饰牛奶中提取的SOD。

3 结论

本研究考察了牛奶、木瓜及酵母菌3种不同来源的SOD，通过对它们稳定性的研究，最终确定以新鲜牛奶为原料，用乙醇作为提取试剂，所得SOD的酶活力为116 608 U/g。因SOD具有生物活性，为使其性质稳定，更适合其在各种环境下发挥作用。本研究考察了月桂酸、牛血清白蛋白、壳聚糖3种不同的修饰剂对其的修饰效果，最终确定用月桂酸对牛奶中SOD进行修饰，采用经典的邻苯三酚自氧化法测得修饰后的SOD的酶活力为115 127 U/g。

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CHENG Yang1，2，ZHAN Hu2，PANG Quan3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China；3.Tianjin Food Safety Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China）

Abstract：In order to obtain high active and stable SOD，three different sources of milk，papaya and yeast superoxide dismutase （SOD） were compared，and their stability under different pH，temperature and exogenous interference conditions were investigated.The results showed that the stability of SOD in milk was better than that in papaya and yeasts，and the activity of SOD in milk was 116 608 U/g.In order to make it work better，lauric acid was used to modify SOD in milk.The enzyme activity of the final product was 115 127 U/g.

引文格式：程杨，战虎，庞泉.SOD的稳定性及修饰的研究[J].食品研究与开发，2018，39（14）：15-18

作者简介：程杨（1979—），女（汉），工程师，本科，研究方向：食品检测。

CHENG Yang，ZHAN Hu，PANG Quan.Research on Stability and Modification of SOD[J].Food Research and Development，2018，39（14）：15-18