刘汝萃，曲玲玲，牛祥臣，李顺秀，李成辉，刘军*
（山东禹王生态食业有限公司，山东德州251200）
摘 要：利用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白（soybean protein isolated，SPI），并通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）、快速粘度分析仪（rapid viscosity analyzer，RVA）技术对不同水解度（hydrolyzing degree，DH）下的SPI的结构与粘度进行分析，并对SPI的DH与其粘度、溶解性、持水性关系进行相关性分析。结果表明：随着DH的增大，SPI被逐渐水解形成更多的低分子量多肽，且A亚基和B亚基附近的低分子蛋白条带逐渐减少。随着DH的增大，持水性逐渐降低，由2.85降低至2.2（P＜0.05）；且溶解性显著性增加，由（41.33±1.18）%升高至（61.25±0.96）%（P＜0.05）；RVA 测定的最终粘度值也显著性降低，粘度由 1 945 cp 降低至545 cp；DH与RVA粘度值、持水性之间都呈显著负相关，与溶解度之间呈现正相关关系。
关键词：大豆分离蛋白；水解度；结构；功能性；相关性
近年来，随着大豆蛋白的结构与功能关系的不断研究，以及对其营养功能的深入了解，为满足人们不断提高生活水平的需求，合理开发优质的蛋白质资源，已经成为当今的热点话题。
通过酶法改性使得蛋白质大分子水解成较小分子，改变其功能特性，过程中水解度对其功能特性起着主要影响[1]，且酶法改性具有改性条件温和，副产物少等优点得到广泛利用[2]。蛋白的酶法改性过程中水解度是一个关键性因素，一定程度的酶解能够改变蛋白分子的大小、构象及分子间/内作用力，从而增强其功能性[3-4]。但酶解过度又会造成一些功能性质的丧失，因此蛋白酶解程度的控制对于获得具有良好功能性质的蛋白制品起到至关重要的作用[5]。蛋白质的持水性、粘度等在食品行业的生产过程中发挥着重要的作用，尤其是对奶油，甜食，糕点的生产中有良好的应用[6-8]。
因此本试验研究了不同水解度（hydrolyzing degree，DH）下的大豆分离蛋白（soybean protein isolated，SPI）的结构、粘度、溶解性和持水性变化，同时首次在大豆蛋白的分析中利用快速粘度分析仪（rapid viscosity analyzer，RVA）特征谱进行分析，了解蛋白功能性质和DH间的相关性，且探究不同DH下的SPI的结构与其功能性质间关系，旨在为今后SPI能够更好的应用于食品行业提供理论依据。
大豆分离蛋白：山东禹王生态食业有限公司；碱性蛋白酶（2.4AU，保存于-4℃）：诺维信生物技术有限公司。其它试剂皆为分析纯。
LG10-2.4A高速离心机：北京京立离心机厂；FA25高剪切分散乳化机：FLUKO仪器有限公司；JJ-1增力电动搅拌器、HH-6数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；ML 1502E电子分析天平：梅特勒-托利多有限公司；PHSJ-4F pH计：上海仪电科学仪器；4500 RVA快速粘度测定仪：波通瑞华科学仪器；LPG-5高速离心式喷雾干燥机：江苏先锋有限公司。
1.3.1 pH-stat法测定SPI的DH
参考姚玉静的方法[9]，略有改动。称取一定量SPI，配制成5%的溶液，搅拌至底物均匀分散于水中，水浴温度55℃，pH调到10，按10%的质量比添加碱性蛋白酶，反应过程中及时加入1 mol/L的NaOH，使系统保持在pH为10，酶解400min，按公式（1）计算SPI的DH，并绘制水解度曲线。
式中：B为消耗碱量，mL；N为碱的摩尔浓度，mol/mL；α为氨基的平均解离度；pH为10、温度为55℃时，α=0.44；m 为被酶解蛋白的质量，g；h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，大豆分离蛋白h=8.38（mmol/g蛋白质）。
1.3.2 不同DH的SPI样品制备
将一定量SPI样品，配置5%的底物浓度的蛋白液，搅拌至均匀分散于水中，水浴温度55℃，调节pH为10，按0.1%的比例添加碱性蛋白酶，反应过程中及时加入1 mol/L的NaOH溶液，使体系pH值保持在10，酶解不同的时间，喷雾干燥酶解液即得不同酶解程度的SPI样品。
1.3.3 SDS-PAGE电泳测定方法
SDS-PAGE不连续电泳各部分凝胶的配制见表1。
将配好浓缩胶平稳加入距玻璃板上部边缘5 mm处，快速插进样梳，静置40min，拔出样梳。样品和marker变性经100℃水浴5min，上样。连接电极，调节电压（浓缩胶时电压为80 V，等到溴酚蓝前沿进入分离胶后加压到120 V）。将缓冲液加到电泳槽里，连接好电源，开始电泳，先将电流调到10 mA，然后进入分离胶后调至20 mA，待溴酚蓝距离胶片边缘约5 mm时，关闭电泳仪。电泳结束后，小刀沾水撬开未放梳子端的玻璃板，取出胶片放入固定液中，固定30min后，对固定液进行回收，加入染色液染色12 h左右，再用脱色液脱色，用水平摇床脱色，直到胶片上条带清晰[10]。
表1 SDS-PAGE不连续电泳各部分凝胶的配制
Table 1 Gel formulation of SDS-PAGE electrophoresis
注：－表示该物质没有添加。
1.3.4 持水性测定
称取10 gSPI样品于烧杯中，先加入20 g蒸馏水，混合搅拌直到产品完全溶于水中。然后倾斜/翻倒烧杯，观察溶液的反应是类似膏状还是液体，溶液的反应应该像液体一样，类似薄煎饼的糊状，顺着杯子的一侧滑下来。如果溶液不流动，则需要持续加水并搅拌，直到溶液可以滑动下来。如样品较稠，则需要加蒸馏水（1 g/次）直到溶液可以被倒出来，调整后记录共添加蒸馏水的质量，根据公式（2）计算持水性。
1.3.5 溶解性测定
参照Qi[11]的方法，稍有改动。配制2%的蛋白溶液，之后进行磁力搅拌1 h，再4 500 r/min离心10min，采用凯氏定氮法（N×6.25）[12]测定上清液中的氮含量。根据公式（3）计算蛋白样品的溶解性。
1.3.6 RVA 粘度测定
将制备得到的不同DH的SPI样品进行粘度测定，称取10 g样品，按照1：3（质量比）的比例加入蒸馏水制得蛋白乳状物。混合于RVA样品钵中，搅拌均匀。测定程序如下：样品放入粘度计中速率以160 r/min的转速搅拌，每份样品在50℃下保持1min，然后于8min内线性加热到95℃，并持续4min。然后冷却到50℃，持续3min，整个过程为22min。用RVA配套软件获得RVA曲线并进行分析。
采用Excel 2007软件和SPSS 17.0软件对数据进行处理、绘图，对结果进行统计、分析。除非另有说明，所有试验重复3次，并且结果表示为重复分析的平均值±标准偏差。利用SPSS系统对数据进行方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）和最小显著差异（Least－Significant Difference，LSD）试验。显著性水平设定为P＜0.05。
pH－stat法测定SPI不同酶解时间下的DH情况，结果如图1所示。
图1 不同水解时间下DH曲线图
Fig.1 The graph of hydrolysis under different hydrolysis time
不同字母代表显著不同（P＜0.05）。
由图1得出，采用碱性蛋白酶酶解SPI，在60min内时酶解显著性增加（P＜0.05），在酶解 60min 时 SPI的 DH 为（21.1±0.5）%。在 60min～80min 之后，随着酶解时间的继续延长，SPI的DH的增长速度趋缓，最终DH 达到（22.80±0.6）%。根据水解时间与 DH 的变化曲线，选择0～60min作为制备酶解SPI的酶解时间进行以下试验。碱性蛋白酶酶解 0、10、20、30、40、50、60min，制得 SPI的 DH 分别为0%、5.4%、8.1%、11.0%、14.5%、17.9%、21.1%。
对不同DH的SPI进行SDS－PAGE凝胶电泳，结果如图2所示。
由图2的不同酶解时间下的SDS－PAGE电泳图可以看出，SPI水解后，随着DH的升高（图由左至右），A亚基和B亚基附近的低分子蛋白条带逐渐减少。赵谋明等[13]研究表明，使用碱性蛋白酶酶解时，酶解主要作用在7S和11S的酸性亚基上。图2中DH在21.1%时的条带上看，7S和11S的酸性亚基已经一部分被降解。通常来说，碱性蛋白酶酶解对碱性亚基作用较弱，依然有碱性亚基存在。水解度的升高，使得分子量逐渐减小，进而使溶液粘度下降，从而有利于蛋白的起泡性[14]。而随着酶解时间的延长，7S亚基条带变化并不是特别明显，说明碱性蛋白酶对7S敏感性较低。
图2 不同DH的SPI的SDS-PAGE电泳图
Fig.2 The SDS-PAGE electrophoresis of soy separated protein with different hydrolysis
在食品加工和保藏过程中，蛋白质的持水能力比其结合水的能力更为重要，持水能力是指蛋白质吸水并将水分保留在蛋白质组织中的能力，蛋白质的持水能力与结合水的能力正相关，蛋白质截留水的能力与绞肉制品的多汁性和嫩度有关，也与焙烤食品和其他凝胶类食品的质构相关，适当的选择持水性在食品的加工中起到重要的意义[15]。
对不同DH的SPI的进行持水性分析，结果如图3所示。
图3 不同DH的SPI的持水性图
Fig.3 The Water-holding graph of soy separated protein with different hydrolysis
不同字母代表显著不同（P＜0.05）。
由图3得出，不同DH的SPI的持水性随着水解度的增大而显著性降低（P＜0.05），在 DH 为21.1%时，最终持水性由 2.85降低至 2.2。刘宏芳等[16]认为酶解修饰处理明显地降低了持水性，这可能是由于所用的SPI是商品化产品，在生产过程中通过某些处理使得保水性最大化，因此，酶解修饰处理反而降低它的持水性。从试验结果来看，酶解修饰的分离蛋白产品持水性均显著下降，且水解度增大，持水性明显降低。这是由于DH进一步增大，形成更多的小分子，更加不利于形成蛋白质的网状结构（凝胶），导致蛋白的持水能力降低。同时研究表明：蛋白的持水性强弱能进一步改善产品的溶胀特性，而良好的溶胀特性是良好持水性蛋白质制品的必须具备条件之一。
测定不同DH的SPI的溶解性，结果见图4所示。
图4 不同DH的SPI的溶解性图
Fig.4 The solubility graph of soy separated protein with different hydrolysis
不同字母代表显著不同（P＜0.05）。
由图4可以看出，不同DH的SPI的溶解性随着水解度的增大而显著性增加（P＜0.05），在 DH 为21.1%时，最终溶解性由（41.33±1.18）%升高至（61.25±0.96）%。这是由于随着DH的提高，蛋白质由大分子解离为小分子，蛋白质颗粒变小，表面积增加，相互作用加强，因此溶解性增加。李秀川等[17]研究SPI经水解后断裂成小分子短链物质，使得－NH2和－COOH的数目增多，极性增加，电荷密度增大，分子间相互排斥作用增加，亲水性增强，从而提高了溶解性。这一点在实际生产中制造需要补充蛋白源的酸性饮料来说有着重要意义。
对不同DH的SPI的进行RVA粘度分析，结果如图5所示。
图5 不同DH的SPI的RVA图谱
Fig.5 The graph of RVA of soy separated protein with different hydrolysis
由图5可以看出，随着DH的增加，SPI的最低粘度和最终粘度都呈降低的趋势。RVA的最低粘度由629 cp降低至285 cp，RVA的最终粘度由1 945 cp降低至545 cp。这也许是由于蛋白质天然三级结构较致密，蛋白酶作用于大豆分离蛋白后，随着水解的进行，小分子肽类增多，分子量逐渐减小，与图2电泳结果一致。反应进行中原来的蛋白质网状结构被破坏，膨胀性减小，导致溶液RVA粘度下降。
食品工业生产中粘度是非常重要的指标，通常根据其粘度来设计食品配方、控制结构及适口性。在蛋白饮料或高蛋白果胨加工中，经常会因为大豆蛋白的粘度随浓度增高而急剧升高、流动性差、作业性不好而影响生产应用，适当程度的酶解具有抑制蛋白质形成凝胶的性质，还可以保持溶解状态，更具有开发利用价值。
对不同DH的SPI与其功能性指标的相关性分析结果见表2所示。
表2 SPI的DH与其特征值的相关性
Table 2 The correlation between DH and eigenvalue of SPI
试验结果表明：SPI的DH与RVA粘度值、持水性之间都呈显著负相关，与溶解度之间呈现正相关关系。相关性数值较大，都大于0.9，说明其相关程度较大。蛋白质的其他功能特性如起泡性、乳化性、凝胶形成性、润湿性、水合性和分散性等的发挥都与溶解性密切相关，溶解性对蛋白质的提取、纯化、分离及加工条件的确定也是至关重要的[18-19]。
综上所述，研究60min内酶解SPI的DH与其功能性的关系发现：随着SPI的DH升高，其SPI的SDS-PAGE凝胶电泳显示其分子量降低，小分子的蛋白逐渐增多，因为水解进行时，蛋白质分子中的疏水氨基酸及维持蛋白质稳定结构的氢键、范德华力、离子键等键也受到不同程度的破坏，进而对大豆蛋白功能性质产生影响。随着DH的增大，持水性逐渐降低，溶解性逐渐增加，粘度值也明显降低。其不同DH的SPI与功能性相关性结果都在0.9以上，相关性较高；SPI的DH与RVA粘度值、持水性之间都呈显著负相关，与溶解度之间呈现正相关关系。大豆分离蛋白酶解由于其功能特性发生了显著的变化，因此，在食品加工中的应用也就更为广泛，选择适当的酶解程度可以应用于糕点及乳制品、蛋白饮料等加工过程中。
参考文献：
[1]何希强,肖怀秋,李玉珍.豌豆蛋白酶法水解及产物特性研究[J].粮油食品科技,2012,20(5):8-11
[2]李玉珍,肖怀秋.大豆分离蛋白不同酶解方式水解度与乳化性和起泡性关系[J].食品与发酵科技,2009,45(4):30-32
[3]孔祥珍,周惠明,钱海峰.小麦面筋蛋白酶解物的制备及其功能性质研究[J].中国农业科学,2006,39(3):593-598
[4]张欣,施利利,丁得亮,等.稻米蛋白质相关性状与RVA特征谱及食味品质的关系[J].食品科技,2014(10):188-191
[5]杨柳,江连洲,李杨,等.水酶法提取的大豆蛋白功能特性研究[J].食品与发酵工业,2010(6):80-84
[6]Damodaran S.Protein stabilization of emulsions and foams[J].Journal of Food Science,2005,70(3):54-66
[7]Agyare KK,Addo K,Xiong YL.Emulsifying and foaming properties of transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate as influenced by pH,temperature and salt[J].Food Hydrocolloids,2009,23(1):72-81
[8]Zhong F,Wang Z,Xu S,et al.Functional properties of proteolytic enzyme Modified Soy Protein Isolate[J].Food chemistry,2007,100(3):1371-1375
[9]姚玉静,崔春,邱礼平,等.pH-stat法和早醛滴定法测定大豆蛋白水解度准确性比较[J].食品工业科技,2008(9):268-270
[10]黄薇,宋永康,余华,等.大豆蛋白酶解肽蛋白Tricine-SDSPAGE分离体系的建立[J].中国粮油学报,2013,28(10):10-14
[11]Qi M,Hettiarachchy N S,Kalapathy U.Solubility and emulsifying properties of soy protein isolates modified by pancreatin[J].Food Sci,1997,62(6):1110-1115
[12]鲁健章,孙丽华,周彦钢.凯氏定氮法测定鱼蛋白质含量的干扰因素分析[J].食品科学,2010,31(19):453-456
[13]赵谋明,张远红,崔春,等.胃蛋白酶前处理对大豆蛋白酶解特性的影响[J].华南理工大学学报(自然科学版),2012,40(8):110-115
[14]王章存,李乐静,袁道强,等.豆粕酶解过程中蛋白质分子亚基组成及其抗原性变化[J].食品科学,2013,34(9):267-270
[15]姜红,迟玉杰,胥伟,等.酸法去酰胺提高大豆分离蛋白持水性的研究[J].食品与发酵工业,2011,37(8):32-36
[16]刘宏芳,侯瑶,赵新淮.大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保水性变化[J].东北农业大学学报,2009,40(1):97-103
[17]李秀川,迟玉杰.大豆分离蛋白溶解性能与水解度相关的研究[J].中国粮油学报,2009,24(7):37-40
[18]费国源,孙培龙.蛋白酶改性处理对小麦面筋蛋白溶解度和起泡性的影响[J].农产品加工(学刊),2009(1):32-34
[19]庞雪风,胡传荣,何东平,等.不同酶解程度牡丹籽蛋白与大豆分离蛋白功能特性的比较[J].中国油脂,2014(9):23-26
Study of the Relationship between the Structure and Function Properties on Soy Protein Isolate at Different Hydrolysis Degree
LIU Ru－cui，QU Ling－ling，NIU Xiang－chen，LI Shun－xiu，LI Cheng－hui，LIU Jun*
（Shandong Yuwang Ecological Food Industry Co.，Ltd.，Dezhou 251200，Shandong，China）
Abstract：The alkali protease completed the hydrolysis of soybean protein isolated （SPI），the structure and viscosity of the SPI with different hydrolyzing degree （DH）were analyzed by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis（SGS－PAGE）and rapid viscosity analyzer（RVA），and the correlations of the SPI hydrolyzing degree and its viscosity，solubility，water binding capacity were analyzed.The results showed that，SPI was hydrolyzed to more low molecular weight peptides with the increase of DH，and the low molecular weight protein bands of A subunits and B subunits decreased gradually.With the increase of DH，the water binding capacity of SPI gradually decreased from 2.85 to 2.2 （P＜0.05），and its solubility significantly increased from（41.33±1.18）%to（61.25±0.96）%（P＜0.05），and the viscosity by RVA significantly decreased from 1 945 cp to 545 cp.The DH had a significant negative correlation with the viscosity and water binding capacity，and was positively correlated with the solubility.
Key words：soybean protein isolate；hydrolyzing degree；structure；functional；correlation
引文格式：刘汝萃，曲玲玲，牛祥臣，等.不同水解度的大豆分离蛋白结构与功能性关系探究[J].食品研究与开发，2018，39（11）：22-26，36
LIU Rucui，QU Lingling，NIU Xiangchen，et al.Study of the Relationship between the Structure and Function Properties on Soy Protein Isolate at Different Hydrolysis Degree[J].Food Research and Development，2018，39（11）：22-26，36
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.11.005
作者简介：刘汝萃（1976—），男（汉），工程师，本科，研究方向：工程管理。
*通信作者：刘军（1982—），男，工程师，硕士，研究方向：食品科学。
收稿日期：2017-11-27