表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
金华1，钟方丽2，*，李秀萍3，王建刚1
（1.吉林化工学院分析测试中心，吉林吉林132022；2.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林130022；3.中国石油吉林石化公司研究院，吉林吉林132021）
摘 要：为了优化活性炭对银杏叶黄酮脱色的工艺条件，通过单因素实验考察脱色时间、pH值、脱色温度以及活性炭用量对脱色率和黄酮保留率的影响。在单因素基础上，采用四因素三水平正交试验分析各因素与脱色率及黄酮保留率的关系。结果表明：活性炭脱色最佳条件为脱色时间60 min、pH 6.0、脱色温度80℃、活性炭用量2.0%，在该条件下活性炭脱色率达55.07%，银杏叶黄酮保留率为87.52%，相对误差分别为0.94%及0.19%。脱色使银杏叶黄酮提取液获得良好色泽。
关键词：正交试验；银杏叶黄酮；活性炭；脱色
银杏叶又名白果叶，是我国珍稀树种银杏的干燥叶。目前，以其为原料的提取物广泛应用于药品、保健品、食品添加剂以及化妆品等领域。2015年，银杏叶制品仅在欧洲市场的年销售额即为1.9亿美元，作为植物界的“软黄金”被世界各国消费者确认和接受。黄酮类化合物是银杏叶提取物中的主要活性成分，具有延缓细胞老化、抗衰老、防止中老年常见脑部功能不足等功效。日本将已经其作为食品添加剂用来制作预防老年性痴呆的保健食品。国内已大量生产银杏叶提取物出口，并有冲剂、口服液、功能性饮料等保健食品、药品投放市场。银杏叶黄酮提取物因含有叶绿素、类胡萝卜素等杂质呈现深绿色，严重影响成品质量，因此脱色成为黄酮提取、分离、纯化过程中的重要环节。目前应用较为广泛的脱色方法有双氧水法、活性炭法以及新兴的大孔树脂脱色法。双氧水法是利用其强氧化性破坏色素结构使其不显色而达到脱色目的，但同时也会对有效成分造成影响[2]。而活性炭和大孔树脂是利用其孔状结构对色素产生吸附作用使之与有效成分分离而达到脱色目的，树脂较活性炭而言，价格较贵、操作较复杂，样品处理量有限；活性炭成本低廉、同样具有较强吸附能力，在工业上被广泛用于分离、纯化过程。其脱色效果与活性炭的种类、孔隙结构、表面性质以及具体条件有关[3]。本试验拟采用活性炭吸附脱色法去除银杏叶黄酮中的色素，采用正交试验设计法优化脱色的工艺条件，为银杏叶黄酮的纯化和深度开发利用提供理论依据。
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
银杏叶：吉林省吉林市吉林大药房，颗粒活性炭（分析纯）：沈阳市新西试剂厂。
无水乙醇，芦丁，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠均为国产分析纯；去离子水：吉林化工学院分析测试中心自制。
1.1.2 仪器与设备
KQ2200型超声仪：昆山市超声仪有限公司；电热恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；AUX120电子天平、UV-2501紫外分光光度计：日本岛津；DHG-9070A型烘箱：上海一恒科技有限公司；DIGICEN20型离心机：德国ORTO ALRESA；PHS-3C型数显pH计：上海精密科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 活性炭的预处理
活性炭在使用前先在烘箱中于105℃下烘30 min～40 min，取出置于真空干燥器中备用。
1.2.2 银杏叶总黄酮的制备工艺流程[4-5]
银杏叶→超微粉碎→过60目筛→超声波提取→过滤→浸膏→总黄酮
1.2.3 黄酮含量的测定
配制浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别移取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置于10 mL的比色管中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.30 mL，放置6 min，然后再加入10%的硝酸铝溶液0.30 mL，放置6 min，再加入5%的氢氧化钠溶液4.00 mL后放置15 min，蒸馏水定容，以空白试剂为参比，在510 nm处测定吸光度。芦丁浓度为横标，吸光度为纵标作标准曲线，得回归方程：y=0.113 8x+0.007（R2=0.979 3），线性范围（0～10 μg/mL）。样品配制成一定浓度的溶液，根据回归方程计算提取液中总黄酮的含量。
1.2.4 黄酮脱色率和保留率的测定[6-7]
对活性炭脱色效果的评价，采用脱色率和黄酮保留率来表示。按下面公式计算脱色率和黄酮保留率（注：如样品颜色过深时，稀释一定倍数使吸光度满足标准曲线线性范围再进行测定，以下公式依据上述情况作相应的修正）：
脱色率/%=（脱色前吸光度-脱色后的吸光度）/脱色前的吸光度×100
黄酮保留率/%=脱色后黄酮含量/脱色前黄酮含量×100
1.2.5 活性炭脱色单因素试验[8-10]
准确移取银杏叶黄酮提取液5 mL于具塞试管中，加入1.0%的活性炭，搅拌均匀后置于40℃水浴锅40 min，固定其它条件，分别考察活性炭用量（0%～2.0%）、脱色时间（10 min～100 min）、脱色温度（30℃～80℃）以及pH值（4.0～10.0）对银杏叶黄酮提取液的脱色率和黄酮保留率的影响。
1.2.6 正交试验优化脱色工艺条件
为了考察各因素之间的交互影响，在单因素试验基础上，采用正交试验设计，以活性炭用量、脱色时间、pH值以及脱色温度为因素，以脱色率和黄酮保留率为考察指标，用四因素三水平的正交试验优化工艺条件，因素水平表见表1。
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
2.1 单因素试验结果
2.1.1 活性炭用量对脱色效果的影响
准确移取银杏叶黄酮提取液5 mL于具塞试管中，分别按照活性炭用量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的比例加入活性炭，在中性条件，温度40℃下振荡40 min，离心取上清液，测定吸光度，计算脱色率和黄酮保留率，如图1所示。
图1 活性炭用量对脱色效果的影响
Fig.1 Effect of proportion of active carbon on decolorization
结果表明，脱色率随活性炭用量的增加呈递增趋势，活性炭用量增至1.0%后，脱色率增幅减小；黄酮保留率随活性炭用量增加递减。为了保证脱色率和黄酮保留率均处在较高水平，选择1.0%为最佳活性炭用量。
2.1.2 脱色时间对脱色率的影响
准确移取银杏叶黄酮提取液5 mL于具塞试管中，加入1.0%的活性炭，在中性条件，温度40℃下，控制振荡时间10、20、40、60、80、100 min，离心取上清液，测定吸光度，计算脱色率和黄酮保留率，如图2所示。
图2 脱色时间对脱色效果的影响
Fig.2 Effect of bleaching time on decolorization
结果表明，在60 min前，脱色率随着时间延长显著上升，60 min后脱色率增加趋势减缓；同时黄酮保留率随时间延长逐渐下降，这可能是由于活性炭对黄酮的吸附作用使部分黄酮损失。综合考虑黄酮保留率及脱色率，选择60 min为脱色时间较适宜。
2.1.3 脱色温度对脱色率的影响
准确移取银杏叶黄酮提取液5 mL于具塞试管中，加入1.0%的活性炭，在中性条件，温度40、50、60、70、80℃条件下，振荡40 min，离心取上清液，测定吸光度，计算脱色率和黄酮保留率，如图3所示。
图3 溶液温度对脱色效果的影响
Fig.3 Effect of temperature on decolorization
结果表明，脱色率随温度升高而升高，因为活性炭脱色是吸热过程，温度升高有利于色素分子的扩散运动，对脱色有促进作用[12]。黄酮保留率呈现下降趋势，一方面是活性炭吸附性能随温度升高而增强，造成部分黄酮损失，另一方面随温度升高，部分黄酮的结构可能发生变化，导致黄酮保留率降低。综合考虑脱色率及黄酮保留率，选择70℃为脱色温度较适宜。
2.1.4 溶液pH对脱色率的影响
准确移取银杏叶黄酮提取液5 mL于具塞试管中，加入1.0%的活性炭，在温度40℃条件下，用HCl和NaOH溶液调节pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0，振荡40 min，离心取上清液，测定吸光度，计算脱色率和黄酮保留率，如图4所示。
图4 pH对脱色效果的影响
Fig.4 Effect of pH value on decolorization
结果表明，pH在酸性或偏酸性范围内，脱色率较好[11]，弱碱性脱色效果与中性条件差异不大，pH为碱性时，脱色率明显下降。而黄酮保留率随溶液pH上升增加增加趋势平缓，这可能是由于活性炭的吸附能力随pH升高而下降的原因。综合考虑脱色率和黄酮保留率，本试验选择pH为7.0适宜。
2.2 正交试验优化工艺条件
本试验采用综合加权评分法[13-14]，权重系数均为0.5，分别把两项中最大的指标定位100分，其它各号按下式评分：综合评分=（黄酮保留率÷89.24%×100× 0.5）+（脱色率÷55.52%×100×0.5），结果见表2。
表2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment
续表2 正交试验结果
Continue table 2 Results of orthogonal experiment
由表2所示的正交试验结果看出，影响银杏叶黄酮活性炭脱色效果的因素，按影响程度的大小顺序为A＞C＞D＞B，即活性炭用量影响最显著，脱色温度次之，再次为pH，脱色时间影响最弱。根据正交试验结果确定银杏叶黄酮活性炭脱色的最佳工艺为A3B2C3D1，即活性炭用量2.0%，脱色时间60 min，脱色温度80℃，pH值6.0。
2.3 验证试验
为了检验正交法所得结果的可靠性，在最佳试验条件下进行验证试验3次，银杏叶黄酮脱色率为55.07%，黄酮保留率为87.52%。相对偏差分别为0.94%和0.19%，说明正交试验分析法所得的最佳工艺可靠，验证了该回归模型的合理性。
本试验采用正交试验设计优化银杏叶黄酮活性炭脱色工艺。确定银杏叶黄酮活性炭脱色最佳工艺为：脱色时间60 min、pH6.0、脱色温度为80℃、活性炭用量2.0%。在此条件下验证试验结果为银杏叶黄酮脱色率为55.07%，黄酮保留率为87.52%。该工艺既保证了银杏叶黄酮具有较高水平的保留率，又具有较好的脱色效果。经脱色后的银杏叶黄酮颜色由深绿色转变为浅黄色。
采用活性炭脱色主要是利用其孔状结构对色素产生吸附作用，使之与有效成分分离而达到脱色目的。活性炭的吸附性能除了与吸附条件[15]、吸附质性质[16]有关外，更主要地取决于活性炭本身的孔隙结构和表面官能团[17]。孔隙结构可以为吸附质提供驻留场所，其大小为吸附质的2倍～4倍时最有利于吸附[18]。本试验中只研究了特定孔隙结构和比表面积的活性炭来讨论吸附条件对吸附性能的影响，在后续的试验中可以开展根据吸附质分子的大小来选择活性炭材料的工作，也可以进一步讨论活性炭表面官能团对吸附性能的影响。只有深入完善影响活性炭吸附性能的相关研究，才能在实际生产中真正发挥指导作用。
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Study on Decolorization Technology of Ginkgo Biloba Leaves Flavonoid with Active Carbon
JIN Hua1，ZHONG Fang-li2，*，LI Xiu-ping3，WANG Jian-gang1
（1.Center of Analysis and Measurement，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China；2.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 130022，Jilin，China；3.Research Institute of Jilin Petrochemical Co.，Ltd.，Petro China，Jilin 132021，Jilin，China）
Abstract：Orthogonal array design was used to optimize the process of bleaching Ginkgo Biloba leaves flavonoid solution with activated carbon.On the basis of single factor test，the influence of four main factors including time，pH，temperature and active carbon amount based on flavonoid retention rate and decolorization rate were investigated.The experimental results showed that the optimal conditions were as follows：time 60 min，pH6.0，temperature 80℃and active carbon addition 2.0%.Under this condition，a decolorization rate of 55.07%and flavonoid retention rate of 87.52%were obtained，of which the relative errors were 0.94%and 0.19%respectively.Decolorization made Ginkgo Biloba leaves flavonoid with better color.
Key words：orthogonal array design；Ginkgo Biloba leaves flavonoid；activated carbon；decolorization
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.018
收稿日期：2016－07－31
基金项目：吉林省科技厅项目（20110948）；吉林化工学院科技项目（2015042）
作者简介：金华（1977—），女（汉），副教授，硕士，主要从事分析化学与仪器分析。
*通信作者：钟方丽，教授。