郭兴峰1，2，魏芳1，周祥山2，田守生2，刘海峰2，张建岭2，郭晓飞2
（1.聊城大学农学院，山东聊城252000；2.东阿阿胶股份有限公司，山东聊城252201）
摘 要：蛋白水解物因具有良好的生物活性而备受关注。但因某些水解过程中会产生苦味物质，从而限制了其在现代食品工业中的广泛应用。本文综述了近年来国内外研究对苦味肽的形成机理及脱苦技术的最新研究进展，并指出了脱苦过程中产生的问题，旨在为蛋白水解物的脱苦提供技术支持。
关键词：蛋白酶解物；苦味；形成机理；脱苦方法
蛋白质在酸碱酶的作用下均可发生分解[1]，且水解过程中产生的多肽大都具有一定的生物活性[2]。研究发现，蛋白质经水解制得的多肽营养性能好，且易于被人体吸收利用[3]。但蛋白质水解会产生不同程度的苦味，苦味是一种阀值很低的味感，当含量在较低的时候就可以品尝出来[4]。由于苦味的产生，使食品无法满足人们的口感和嗜好。因此，限制了其在现代工业中的广泛应用[5]。本文主要讨论了蛋白水解物苦味产生机理及脱苦的研究进展，以及现代脱苦方法的缺陷和展望。
蛋白水解物的苦味主要是由于产生了苦味肽，而苦味肽中的疏水性氨基酸则是引起蛋白质产生苦味的主要因素[6]。多肽中的疏水性氨基酸不像蛋白质中的被包埋在里面，它的大部分疏水性氨基酸暴露在外面，能够刺激味蕾，产生苦味。疏水性氨基酸暴露的越多，产生的苦味越大。此外，多肽链的长度、多肽链的疏水度、氨基酸的序列和氨基酸的组成也会对蛋白水解物的苦味产生较大的影响[7]。
目前为止，对于多肽链的疏水度与苦味的关系仍然采用Ney提出的Q规则。根据Q（平均疏水度）来判断疏水度与苦味的关系。付光中[8]等通过对虾头自溶产物成分的疏水度和苦味之间的关系进行研究，发现虾头自溶产物的苦味主要来自分子质量为3 kD～5 kD的肽，并且不同分子质量大小的自溶产物，平均疏水度越小苦味越大。有研究发现，当疏水性氨基酸残基位于多肽链的C-端或者N-端时都会产生苦味，且当位于C-端时比位于N-端时产生的苦味更大。这说明了氨基酸序列与苦味值有关。宋雪梅等[9]利用Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱柱，从牦牛乳硬质干酪中分离出含有14种苦味肽的组分，苦味肽序列中的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，这些疏水性氨基酸对苦味的产生有较大贡献。
针对蛋白质水解会产生苦味，目前为止，蛋白酶解物的苦味脱除方法大体有：分离法、掩盖法、酶法、微生物法等[10]。
选择分离法脱苦其原理是利用蛋白质水解产物中不同多肽组分的理化性质的不同，采用吸附、萃取、沉淀、色谱分离等方法将水解液中具有苦味的多肽予以除去。
吸附法是利用活性炭、树脂等吸附剂将水解液中的苦味去除。赵晨霞等[11]采用活性炭对玉米肽进行初步分离纯化，结果表明在pH值为3，吸附温度为30℃，吸附剂用量为1∶10，吸附时间为2 h时，可对酶解得到的玉米肽进行初步分离纯化，并为脱色脱苦提供了理论依据。此外，李治龙等[12]也做了相同的实验，并得出了一致结论。徐锦等[13]对草鱼蛋白酶解物进行脱腥脱苦的工艺研究，得到的最佳脱腥脱苦工艺条件为：活性炭添加量为0.6%，时间为1.5 h，温度50℃。在此条件下水解液的腥苦味能很好的去除，且酶解液颜色较浅具有良好的风味。Liu等[14]通过比较风味酶和活性炭对大豆蛋白水解物的苦味的影响时发现，风味酶的脱苦效果优于活性炭。此外，硅藻土、珍珠岩也被用于蛋白水解液的脱苦[15-16]。
Cheison等[17]用20%、40%、75%的乙醇洗脱NA-mano G蛋白酶水解的乳清分离蛋白，得到了3个不同的组分HS20、HS40、HS75。结果表明，HS75的疏水性氨基酸含量最高，苦味最重。HS20则没有可以察觉的苦味。米恒振等[18]通过比较8种大孔吸附树脂的吸附解吸效果，最终确定XADTHP树脂具有较好的脱苦效果，树脂DA201-C的脱腥效果较好。
酶解蛋白产物中苦味物质还可用萃取法去除，苦味肽在其沸混合物如水与仲乙醇、水与乙醇或水与丙醇等醇相中浓缩，从而达到分离。采用这种方法对蛋白水解物有良好的去除效果[19]。
杨柳等[20]通过比较活性炭和仲丁醇对牛乳蛋白水解液的脱苦效果，发现仲丁醇添加量较少时脱苦效果不明显。当仲丁醇添加量在150%时，苦味基本可除去，但氨基损失较高。相比之下，活性炭的脱苦效果优于仲丁醇。
王向东等[21]分别采取吸附法、包埋法、掩盖法、萃取法、发酵法对蛋清蛋白的复合酶解产物进行脱苦脱臭处理。结果表明膨润土吸附法、β-环糊精包埋法、柠檬酸掩盖法和酵母发酵法可基本去除蛋清寡肽混合液的苦臭味，是较有效的脱苦脱臭方法，而乙醚萃取法的脱苦效果不理想。
袭迪红等[22]等用乙醚萃取鲐鱼水解液，得到较好的脱苦脱腥效果。除此之外，乙醇、异丙基乙醇都可以作为萃取剂除去蛋白水解液中的苦味[23]。
用于肽与蛋白质分离的色谱分离法有：凝胶电泳色谱分离法（SDS-PAGE）、反相色谱（RLC）和疏水层析等[24-26]。
解铭[27]利用SP Sephadex C-25葡聚糖凝胶填料和反相高效液相色谱，对鳕鱼肉酶解液进行分离纯化，最终得到纯度较高的两条苦味肽。Sephadex C-25色谱柱能分离分子量为1 000 Da～5 000 Da肽类分子，是常用的分离凝胶柱[28-29]。
卢鹤等[30]通过超滤以及凝胶过滤色谱法（Sephadex G-15）分离大豆蛋白水解物，并对分子量在1 000 Da以下的小肽进行收集，从而为大豆酶解物中苦味的去除提供了理论依据。
沉淀法也被应用于蛋白水解物的脱苦中。冯学武[31]通过等电点沉淀脱除大豆蛋白水解液的苦味，但是去除沉淀物后，脱苦效果并不十分明显。Adler-Nissen[32]通过等电点沉淀，将蛋白水解物去除。
掩盖法是利用掩盖剂与蛋白水解物混合，而达到脱苦的目的。因其不会造成其功能性成分的损失从而在食品工业中被广泛应用。
耿瑞婷等[33]通过研究扇贝蛋白酶解液的脱腥脱苦工艺，运用正交试验优化超滤联合掩盖法的最佳工艺条件。确定联合脱腥脱苦的最佳组合为0.005%乙基麦芽酚、0.002%乳酸乙酯、0.1%料酒和0.5%食盐。在此条件下，水解超滤液无苦味和腥味。李萍[34]通过单因素实验和响应面设计探究了β-环状糊精脱苦大豆肽的最佳条件：pH 6.7、温度40.0℃、β-环状糊精与大豆肽的质量比为1∶4、反应时间为40.0 min。在此条件下，能够大大降低大豆肽的苦味且与传统的脱苦方法相比既不会造成功能肽的损失，也不会造成能源的浪费。曹川等[35]利用粉末活性炭和β-环糊精联合处理贻贝肉酶解液，得到较好的脱腥脱苦效果。具体的条件为：先用1.25%的活性炭在40.0℃下吸附35 min，离心过滤除去活性炭，继用1.2%β-环糊精在70.0℃下保温10 min。
此外，其他的一些物质如：聚磷酸盐、柠檬酸、酸性氨基酸等都可以有效降低蛋白水解物的苦味[36]。
王东等[37]采用无机酸、有机酸、酸性氨基酸、β-环糊精、蔗糖、淀粉、脱脂奶粉等对大豆多肽进行脱苦。结果表明，有机酸、酸性氨基酸、β-环糊精以及酸糖按一定比例配合使用有较好的脱苦效果。陈园园[38]通过采用活性炭吸附与有机酸、葡萄糖掩盖结合的方法，运用正交试验优化，当酶解液经2%活性炭处理后，确定了最佳添加比例：柠檬酸0.3%，苹果酸0.1%，葡萄糖3%。此时，水解液苦味基本被掩盖，具有酸甜的口味并带有淡淡苹果香气。此外，多聚谷氨酸也可以作为各种食物的苦味掩盖剂，且作为健康饮食的组成成分而被广泛应用[39]。
甄润英等[40]通过单因素试验和正交试验对羊骨胶原多肽口服液生产过程中的酶解液脱苦进行了研究。发现：采用8.5%蔗糖，1.2%甘氨酸和0.7%柠檬酸进行联合掩盖脱苦效果相对较好。
酶法脱苦主要是利用氨肽酶或羧肽酶去除多肽链末端的疏水性氨基酸残基而达到去除苦味的目的。根据水解的位置不同，酶法可以分为氨肽酶法和羧肽酶法。氨肽酶法是从肽链的N-端开始水解，羧肽酶法则是从C-端开始水解。由于酶法条件温和，不会造成生理活性成分的损失。因此，酶法被广泛应用于蛋白质水解物的脱苦中。
李静等[41]以罗非鱼下脚料经中性蛋白酶所得的呈味肽为底物，经氨肽酶酶解确定了最适合的酶解条件。在此条件下，呈味肽溶液的苦味基本消失。
须瑛敏[42]通过研究从豆腐乳中筛选得到的一种枯草芽孢杆菌所产的氨肽酶对大豆蛋白质水解物苦味的影响，结果表明添加氨肽酶可较好的脱除大豆蛋白水解物的苦味。
早在1970年，Arai研究发现了用黑曲霉羧肽酶处理大豆蛋白水解物，多肽的苦味明显下降[43]。
陈丹等[44]发现利用rocpo（重组米曲酶羧肽酶0）可以减轻大豆蛋白和酪蛋白的Alcalase蛋白酶水解物的苦味。
除了用氨肽酶法和羧肽酶法脱除蛋白质水解物的苦味之外，钱方等[45]在相同条件下，将5种不同的蛋白酶（HAP低温高碱碱性蛋白酶、1398中性蛋白酶、Flavourzyme复合风味蛋白酶、胃蛋白酶和Alcalase碱性内切酶）分别作用于大豆分离蛋白，发现用HAP低温高碱碱性蛋白酶、1398中性蛋白酶、Flavourzyme复合风味蛋白酶处理后的大豆蛋白水解物不易产生苦味，而剩下的两种易产生苦味。此外，类蛋白反应也被应用于蛋白质水解物的脱苦中[46]。
自然界中的许多微生物可以产生肽酶，如少数的细菌、霉菌、酵母等，这些微生物具有脱苦的效果[1]。
张桢等[47]采用微生物发酵和活性炭吸附两种处理方式对罗非鱼下脚料酶解液进行脱腥去苦的研究，通过不同的考察指标，选取最佳活性炭吸附条件和最佳微生物发酵条件。并确定了罗非鱼下脚料酶解液最佳脱腥去苦方式为干酪乳杆菌Lc菌和植物乳杆菌Lp菌混合发酵，发酵条件：发酵比例为 1 ∶1（Lc ∶Lp），接种量2%，发酵时间16 h，最适温度37℃，该条件下对罗非鱼下脚料酶解液脱腥去苦效果最佳。
曾少葵等[48]通过嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌混合发酵，改善罗非鱼下脚料酶解液风味。结果表明，当发酵时间为9 h，温度为45℃，接种量为16%时，能够减弱罗非鱼酶解液的腥味，但脱苦效果不明显。
李萍[49]研究了用黑曲霉对大豆肽进行脱苦处理，根据单因素试验结果设计中心组合试验，以苦味值为指标，采用响应面分析法确定最优脱苦工艺参数。结果得到黑曲霉酶解液脱苦大豆肽的最适条件为：pH 1.0、时间2.1 h、温度34.0℃，在此条件下，苦味大大减轻。
Li等[50]通过比较产自雅致放射毛霉的羧肽酶和碱性蛋白酶发现，产自雅致放射毛霉的羧肽酶能更好的降低大豆蛋白酶解物的苦味。
李杨等[51]采用黑曲霉、米曲霉和毛霉混合发酵制备复合蛋白酶液。用所制得的蛋白酶液酶解大豆肽进行脱苦试验，结果表明，最佳脱苦条件为：蛋白酶浓度为70 U/mL，酶解pH值为5.0，酶解温度为62℃，酶解时间为2 h。在此条件下，短肽得率较大，苦味值较低。
黄继红等[52]研究了乳酸菌和酵母菌混合发酵对于谷朊粉溶解度与酶水解产物苦味特征的影响。结果表明经预处理后的谷朊粉和微生物混合发酵后，溶解度和乳化性得到了明显改善，苦味值降低。
黄薇等[53]以鳕鱼皮复合酶解液为原料，采用粉末状活性炭、酵母粉和β-环糊精为脱腥脱苦材料。并通过正交试验设计研究了复合酶解液的脱腥脱苦工艺技术条件。结果表明：粉末状活性炭吸附法与酵母粉发酵法联合使用的效果最佳，即达到了脱腥脱苦的目的，又提高了鳕鱼皮复合肽的品质。
赵李妮等[54]用木瓜蛋白酶酶解平颏海蛇得到酶解液，并比较活性炭、酵母发酵和β-环糊精包埋对其脱腥去苦效果的影响。通过单因素试验及正交试验发现：活性炭对脱腥去苦的效果优于酵母发酵和β-环糊精包埋。
除了采用选择分离法、包埋法、酶法和微生物法对蛋白酶酶解液进行脱苦外，乙酰化法也被应用于蛋白水解物的脱苦中[55-56]。
近年来，虽然在探究蛋白水解物的苦味成因及脱苦技术上取得了重大进展，但仍存在一系列问题：（a）对于短肽苦味构效关系的研究欠缺；（b）选择分离法脱苦虽然有一系列优点，但会造成营养物质的损失；（c）包埋法因为不会造成营养物质损失而被广泛应用，但可能产生不愉快的风味；（d）微生物和酶法脱苦效果较好，但由于脱苦选用的微生物种类有限，也限制了其在食品工业中的应用。
蛋白水解物有较好的营养价值，有些还具有生物活性。但水解过程中产生苦味，限制了其在食品方面的应用。目前，应该更深入的了解蛋白水解物产生苦味的原因，并根据苦味产生机理对现有的脱苦方法进行改进和创新，使蛋白水解物能广泛应用于食品中。
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GUO Xing-feng1，2，WEI Fang1，ZHOU Xiang-shan2，TIAN Shou-sheng2，LIU Hai-feng2，ZHANG Jian-ling2，GUO Xiao-fei2
（1.School of Agriculture，Liaocheng University，Liaocheng 252000，Shandong，China；2.Dong-E E-jiao Co.，Ltd.，Liaocheng 252201，Shandong，China）
Abstract：Protein hydrolysate has good bioactivities.However，its bitter taste is major hindrance for its use in the food industry.The latest research in domestic and overseas on bitterness mechanism and debittering method are reviewed and discussed.And the problems and prospects in the process of removing bitterness also pointed out for the debittering of protein hydrolysate.
Key words：protein hydrolysate；bitterness；formation mechanism；debittering technology
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.041
基金项目：东阿阿胶博士后工作站博士后课题（K15LD0907）；聊城大学大学生创新创业训练计划项目（201510447054）
作者简介：郭兴峰（1983—），男（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物研究与开发、农产品加工。
收稿日期：2017-02-23