倪沁1，朱柏羽1，蒋浣竹1，郑小坚1，陆小平2，曹霞敏1，*
（1.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；2.苏州大学金螳螂建筑与城市环境学院，江苏苏州215123）
摘 要：1-脱氧野尻霉素是一种存在于自然界的生物碱类化合物，对人体具有多种保健功能。主要就近年来国内外对1-脱氧野尻霉素的提取、分离和纯化的研究进展进行综述。
关键词：1-脱氧野尻霉素；提取；分离；纯化
Abstract：1-Deoxynojirimycin is an alkaloid in mulberry leaf.The research interests of 1-deoxynojirimycin are increasing due to its potential health benefits.A review of the most significant advances achieved in the field of extraction，isolation and purification of 1-deoxynojirimycin in recent years at home and abroad was made.
Key words：1-deoxynojirimycin；extraction；isolation；purification
1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种哌啶生物碱，学名为3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶[1]。DNJ最早由Yagi等[2]从桑根皮中分离得到，之后相继在野拓草[3]、风信子[4]、沙参属植物[5]及芽孢杆菌[6]体内也发现了DNJ，但其含量远低于桑资源，因此桑树是DNJ的主要来源。在桑树的种子、叶、根和枝中均有DNJ分布，其中桑树种子中DNJ的含量约为0.13%[7]，桑叶中的含量较高，约为0.11%～0.49%[7-14]，桑根中含量约为0.10%[7]，桑树茎中含量约为0.19%[7]，桑枝皮中含量可达0.38%～0.50%[10-11]，桑枝木质部含量仅为0.04%～0.05%[10-11]。另外，不同生长期的桑叶中的DNJ含量也不同，研究表明，同一季节不同发育时期桑叶中的DNJ含量均按叶位（成熟度）由高到低递减，即嫩芽＞嫩叶＞成熟叶＞老叶[15]，嫩芽中含量约为11.9%[16]。目前桑叶已经成为获取天然DNJ的主要来源。DNJ是桑叶中主要的生物活性物质，它能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，显著降低人体空腹血糖和餐后血糖峰值，目前多作为功能性或药用添加剂用于控制血糖[17-19]。目前国内外有关DNJ的研究主要集中在DNJ的定性与定量方法研究、DNJ的高效提取与分离、DNJ的生理活性与功能研究机制以及以DNJ为原料或辅料开发降血糖药物4个方面，这些内容的深入研究有利于进一步合理利用与开发桑叶中的DNJ资源。本文重点就近年来国内外学者对1-脱氧野尻霉素的提取、分离和纯化方法的最新研究进行了分析总结。
提取是分离、纯化和利用DNJ的基础和主要环节。近年来DNJ的提取获得了越来越多的关注，有关的研究报道逐渐增多，一些新的提取方法如微波、超声波等都得到了应用。
溶剂提取是植物天然产物的常规提取方法，溶剂多选择甲醇、乙醇、丙酮、水或者混合溶剂等。DNJ的提取目前多采用传统溶剂进行热提取，已有研究通常从提取溶剂、料液比、提取温度和时间等因素进行优化，尽管工艺简便，但提取得率均较低[20-22]。
从桑叶中提取DNJ的最初方法是蒸馏水提取法，即将样品烘干后以蒸馏水为溶剂，沸腾条件下多次提取，该方法耗时长，并且DNJ极易被破坏而失去生物活性[12]。杨海霞等[21]以水为溶剂，加热回流2 h～2.5 h提取桑叶粉中的DNJ，两次提取得率仅为0.038%。刘树兴等[22]改良了蒸馏水提取工艺，通过将样品暴晒而大量缩短了样品热分解的时间，通过正交试验优化了热溶剂提取桑叶DNJ的工艺参数，提取溶剂为水，物料粒为 60目，料液比为 1∶30（g/mL），温度为 70℃，时间为3 h，依此工艺，桑叶DNJ的提取得率为0.088%。黎欢吉[23]用蒸馏水浸提桑叶中的DNJ，通过阳离子交换柱层析对DNJ进行初步纯化后采用分光光度法测定DNJ的含量，发现提取液pH值为9.4～10.5时DNJ含量最高，约为0.023 7%。蒸馏水提取法提取率较低，杂质多，分离困难。
为了改进提取工艺，根据DNJ的化学特性，酸提取法发展起来，酸溶液可以有效软化细胞壁，溶解DNJ，提高提取率。马静等[24]采用正交试验确定酸水提取桑叶DNJ的最佳工艺为：粒度60目、提取温度为55℃、提取溶剂为HCl酸化水溶液（pH 3.0）、料液比为1∶20（g/mL）、提取时间为15 h，DNJ的得率为0.062%。
有机溶剂提取法是目前提取生物碱的常用方法，该方法提取时间短，纯度高。周炎等[20]比较了不同溶剂对桑枝DNJ提取得率的影响，发现80%乙醇的提取效果好于水。胡娟霞[7]研究发现65%乙醇为溶剂提取的DNJ的量比以0.05 mol/L HCl为溶剂提取的 DNJ量高。Wang等[25]通过响应面法优化DNJ的提取条件为：乙醇浓度55%，提取温度80℃，提取时间1.2 h，料液比 1∶12（g/mL），提取率达到 0.256%。马静等[24]结合酸水提取法和有机溶剂提取法，确定了酸性乙醇提取法的最佳工艺：粉末粒度60目、提取温度55℃、pH值为1的 75%乙醇溶液、料液比 1∶30（g/mL）、提取时间1.5 h，DNJ得率0.064%。
超声波作为一种辅助提取手段主要集中在中草药成份、植物油、多酚、芳香成份、多糖以及其他功能成份的提取等研究领域。陈岩[26]、耿鹏[27]等均采用超声波辅助提取了桑树中的DNJ，徐鑫等[28]开展了不同的提取方法对桑叶中DNJ的提取率影响的对比研究，相同条件下超声波细胞破碎仪辅助提取的DNJ得率是热（70℃）浸提的3.02倍；同时，采用响应面法优化了超声波辅助提取DNJ的工艺参数，最佳提取条件为超声功率 350 W，料液比 1∶16（g/mL），温度 75℃，时间60 min。花俊丽等[29]以桑叶为原料，优化了超声波辅助提取DNJ的最佳工艺参数，提取溶剂为乙醇（浓度65%），料液比为 1∶40（g/mL），超声波功率 125 W，温度为70℃，时间为20 min，DNJ的得率为0.091%，固形物中DNJ纯度为27.2%。李宇亮等[30]采用超声波提取桑叶中的DNJ，发现以65%的乙醇为提取剂，料液比为 1∶8（g/mL），1 800 W 下超声 20 min，提取率达到95.8%，得率为124.54 mg/100 g。超声波辅助提取与传统提取方法相比，大大缩短了提取的时间，提高了提取效率以及提取物的稳定性。
1986年，Ganzleret等[31]首次报道了利用微波从土壤、种子、食品、饲料中分离各种类型化合物的样品制备新方法。2007年，胡瑞君等[32]通过对微波辅助萃取提取桑叶中DNJ的工艺研究，发现对桑叶DNJ得率的影响因素依次为：微波功率＞时间＞固液比，确定了微波提取的最佳工艺条件为：功率为406 W、时间为1.5 min、固液比为 1∶40（g/mL），提取次数为 2 次，得率为0.024%。
基于单一提取手段的利弊不一，有学者尝试采用联合辅助提取的方式以提高产物的提取率。刘超等[33]采用超声-微波结合法提取桑叶中DNJ，发现用0.05mol/L的盐酸水溶液作为溶剂，液料比为46.47 mg/L，微波处理9.6 min后超声波处理30.89 min，DNJ的得率最高可达0.205%。同时，研究了不同溶剂对提取效果的影响，发现得率依次为：正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。杨翠平等[34]比较了超声-表面活性剂辅助提取法、回流提取法及超声-回流法对桑叶DNJ提取效果的影响，发现用超声-表面活性剂辅助法的得率显著高于回流提取法、超声-回流法，并优化了最佳参数：超声时间为32 min、料液比为 1∶10（g/mL）、提取温度为 73 ℃、表面活性剂（聚乙二醇辛基丙基醚）浓度为2.1%，在此工艺下DNJ的提取量为0.996 mg/g。
DNJ的分离与纯化方法是DNJ领域的一个研究重点，目前报道的主要方法有薄板层析、柱层析、高效液相、膜分离技术等。
膜分离是20世纪60年代后迅速崛起的一门分离新技术，已广泛应用于天然产物的分离纯化[35]。若直接采用超滤膜分离桑叶水提物浸膏，膜通量很低，且超滤膜污染严重，清洗非常困难。而先用陶瓷膜微滤处理，再采用超滤去除大分子杂质，膜通量的衰减变化则不显著[36]。因此，颜继中等[36]将微滤与超滤膜结合用于桑叶DNJ的纯化，桑叶水提取液中DNJ的质量分数从1.32%提高到7.84%，回收率为88.06%。刘国艳等[37]比较了不同的超滤和纳滤膜对桑叶DNJ浓缩效果的影响，发现截留分子量为8.0 kDa的复合超滤膜最适于DNJ的分离，截留分子量为0.2 kDa的复合纳滤膜对DNJ的浓缩效果显著，浓缩倍数可以达到10.1，对DNJ的截留率为81.94%，DNJ纯度为4.65%。
溶剂萃取分离法是在两种互不相溶或微溶的溶剂中，目标化合物在其中的溶解度或分配系数不同，而从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中，并经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。杨茹等[38]将桑叶提取浓缩液以氯仿萃取，保留水相，水相以正丁醇萃取，保留正丁醇相，浓缩至小体积，收集析出的固相，所得产物中DNJ含量达到98%。
薄层色谱也是分离天然产物的一种传统而重要的手段，固定相一般选用硅胶、氧化铝、聚酰胺或纤维素等。李玲等[39]建立了薄层层析分离鉴定DNJ的方法，确定最佳条件为：硅胶G薄层板，展开剂为正丁醇∶冰乙酸∶水（5∶3∶1），显色剂为 0.2%茚三酮，DNJ的 Rf=0.36，分离效果和显色效果均很好。
植物天然产物的分离纯化多选择各种树脂来去除提取物中糖、有机酸、矿物质及其它水溶性杂质。蒋磊等[40]研究了不同树脂对桑叶DNJ分离纯化效果的影响，结果表明纯度依次为阳离子交换树＞大孔树脂＞硅胶树脂。花俊丽等[41]进行了大孔树脂吸附法纯化DNJ的研究，结果表明：以DXA-6树脂装柱、pH10、原液浓度0.352 mg/mL、流速2.0 BV/h条件下吸附，80%乙醇溶液以2.5 BV/h的流速洗脱，解析率可达到85.5%，通过纯化DNJ的纯度由21.3%增加到61.6%。黄勇等[42]以001×7型阳离子交换树脂分离纯化桑叶DNJ，得到纯度为29.75%的分离物。殷红等[43]将桑叶提取液浓缩后过阳离子树脂，洗脱液浓缩后经有机溶剂萃取、重结晶、凝胶过滤层析后制备获得1-DNJ精制品，纯度高于98.5%。杨翠平[34]采用D72型阳离子交换树脂、D296型阴离子交换树脂和氧化铝柱层析联用，得到了纯度63.9%的DNJ，浓度比桑叶粗提液高40.97倍。李宇亮等[30]采用732 H阳离子树脂分离纯化桑叶DNJ的乙醇提取物，发现用蒸馏水洗至流出液为无色后用0.25 mol/L的氨水洗脱（洗脱速度1 mL/min～2 mL/min），洗脱液用旋转蒸发仪浓缩，正丁醇萃取，回收正丁醇，真空干燥后可得到纯度为92.3%的DNJ。刘卫旗等[12]采用磺酸型离子交换树脂法纯化桑叶DNJ水提取液，用0.5 mol/L的氨水洗脱纯化后再进行液相检测，桑叶中的DNJ含量为1.622 mg/g。杨梅等[44]以桑叶粉为原料，用蒸馏水热提取其中的DNJ，提取液用001×7强酸型阳离子交换树脂进行纯化，经过氨水洗脱、浓缩后进行液相检测，发现DNJ纯度高达95.98%。刘树兴等[22]比较了4种不同的大孔吸附树脂D101、LX-38、AB-8、DXA-6对DNJ的纯化效果，发现XDA-6树脂最适于桑叶DNJ的分离纯化，通过静态、动态吸附试验，确定pH10，原液浓度0.352 g/L，流速2.0 BV/h为最佳条件。
高速逆流色谱是一种较新型的液-液分配色谱，在天然产物纯化方面得到越来越广泛的开发和应用。刘玲等[39]釆用传统提取分离方法与高速逆流色谱相结合的方式，对桑叶乙酸乙酯提取物进行分离纯化，分离得到包括DNJ的9种化合物。高速逆流色谱技术分离效率高且分离量大，为桑叶DNJ的分离提供了一个新的技术，可以用来大批量分离制备DNJ，以解决当前临床以及分析中对DNJ需求量大的难题。
反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料做固定相，以可以和水混溶的有机溶剂作流动相的液相色谱，是应用广泛的液相色谱方法之一。周惠燕等[14]采用反相柱色谱纯化法对桑叶盐酸-水DNJ粗提液进行纯化，先将DNJ提取液过MCI gel CHP 20P柱色谱，用不同浓度的甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，收集含有DNJ的洗脱液浓缩后再过Sephadex LH-20色谱柱，以不同浓度的甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，最后收集含DNJ的洗脱液，浓缩并干燥，得到的固体中DNJ含量为10.7%。
为了得到高纯度产品，也有将多种分离技术联合用于DNJ的纯化。魏晓蕊等[10]将阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和超滤联合应用于DNJ的分离纯化，结果表明，DNJ的纯度达到15.18%。徐鑫等[45]联合膜分离和柱层析技术纯化DNJ，将桑叶水提取液通过离心、微滤膜处理后经过二次超滤、纳滤、阳离子交换树脂层析和葡聚糖凝胶层析，获得纯度为80%以上的DNJ。马全民等[46]将提取液用超滤膜、强酸性阳离子树脂柱和大孔树脂柱洗脱，经浓缩、干燥、溶解、吸附、结晶后，得到DNJ含量可达98.3%。李凡等[47]将桑叶提取液经浓缩、大孔树脂、阴离子交换树脂、碱液洗脱，纯化分离桑叶中DNJ效果明显。李有贵[48]等采用液质联用仪分离纯化法对粗提的DNJ进行了纯化，将粗提的DNJ用蒸馏水溶解后经制备型液相色谱仪分离，通过LC-MS对收集液进行鉴定，然后50℃恒温下旋转蒸发除去乙腈，-50℃下冷冻干燥后经柱前荧光衍生反相高效液相色谱法检测，发现DNJ纯度高于95%。
目前，国内外关于桑叶中DNJ的提取与分离纯化研究还处于起步阶段，并且提取及分离纯化的方法研究与优化较为局限，提取上仍集中在热溶剂浸提、超声波辅助萃取、微波辅助萃取等，而在其他提取方法（如超临界流体辅助萃取等）研究很少。新的提取分离方法可以为工业化提取DNJ开辟新的途径，然而其应用还处于起步阶段，许多技术条件还不成熟，还不适宜大规模生产，但就其方法本身而言，比现有方法具有更大的优越性。
我国是世界上最大的桑树种植国，桑树资源丰富，而我国的桑叶资源开发利用率很低，且大都处于较为简单的初级加工阶段，桑叶中的DNJ具有很好的降血糖、抗氧化等功能，因此了解、掌握、寻求新的桑叶中DNJ的分离纯化技术，对充分利用我国桑叶资源优势，有效开发桑叶中所含有效物质具有重要的现实意义。
参考文献：
[1]李勇,苗敬芝.桑叶的功能性成分及保健制品的开发[J].中国食物与营养,1999(3):25
[2]YAGI M,KOUNO T,AOYAGI Y,et al.The structure of moranoline,a piperidine alkaloid from Morus species[J].Nippon Nougei Kagakn Kaishi,1976,50:571-572
[3]HANG S K,YOUNG H K,YOUNG S H,et al.α-Glucosidase inhibitors from commelina communis[J].Planta Medica,1999,65:437-439
[4]NAKIO A,ATUSUSHI K,MIWA M,et al.Nitrogen-containing furanoseandpyranoseanaloguesfromhyacinthusorientalis[J].J Nat Prod,1998,62:625-628
[5]NAKAIO A,MAKOTO N,MIWA M,et al.Polyhydroxylated pyrrolidine and piperidine alkaloids form Adenophora triphylla var.japonica(Campanulaceac)[J].Phytochemistry,2000,53:379-382
[6]FROMMER W,MULLER L,SCHMIDT D D,et al.Inhibitors for glycoside hydrolases from bacilli:German,2658563[P].1976-12-23
[7]胡娟霞.桑籽发芽过程中1-脱氧野尻霉素的变化及乳汁抗蚜虫研究[D].合肥:安徽农业大学,2011
[8]YOSHIAKI Y.Inhibition of intestinal α-glucosidase activity and postprandial hyperglycemia by moranoline and its N-alkyl derivatives[J].Agric Biol,Chem,1988,52(1):121-128
[9]欧阳臻,陈钧.不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量的测定[J].食品科学,2004,25(10):211-214
[10]魏晓蕊.桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取纯化及其降血糖活性的研究[D].扬州:扬州大学,2012
[11]蒋磊.桑叶中1-脱氧野尻霉素的检测、提取及其生理活性研究[D].合肥:合肥工业大学,2010:23-25
[12]刘卫旗,朱祥瑞.桑树不同部位DNJ的含量分析[J].蚕桑通报,2006,37(4):31-34
[13]吴方睿.桑叶中1-脱氧野尻霉素提取分离工艺研究[D].合肥:合肥工业大学,2009
[14]周惠燕,胡晓渝,马英.桑叶中1-脱氧野尻霉素的纯化及含量测定[J].中国现代应用药学,2008,25(5):367-369
[15]叶晶晶,殷浩,孙波,等.桑树中的1-脱氧野霉素含量变化规律研究[J].蚕业科学,2009,35(4):722-727
[16]饭冢幸澄.桑叶对二糖酶的抑制作用[J].国外医学(中医药分册),1999,21(3):54
[17]杨海霞,朱祥瑞.1-脱氧野尻霉素(DNJ)的研究进展[J].桑蚕通报,2002,34(1):6-10
[18]李时珍.本草纲目[M].王首杰整理.北京:人民卫生出版社,1999:1867-1868
[19]方晓,李向荣,陈伟平,等.桑叶浸出液对糖尿病模型大鼠降血糖作用初步观察[J].1999,21(4):218-222
[20]周炎,刘朝良,朱保建,等.桑枝中1-脱氧野尻霉素的提取及其降血糖效果的研究[J].激光生物学报,2009,18(5):626-628
[21]杨海霞.桑叶中DNJ分离纯化及含量测定的研究[D].杭州:浙江大学,2003
[22]刘树兴,花俊丽,陈素娟.桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)和多糖提取工艺优化[J].陕西科技大学学报,2008,26(5):55-58
[23]黎欢吉.桑叶和蚕粉中DNJ分离纯化及含量测定研究[J].陕西农业科学,2010,56(5):50-53,94
[24]马静,万志平.正交优化桑叶中1-脱氧野尻霉素酸水提取的工艺[J].食品研究与开发,2010,31(10):36-38
[25]WANG T,LI C Q,ZHANG H,et al.Response Surface Optimized Extraction of 1-Deoxynojirimycin from Mulberry Leaves(Morus alba L.)and Preparative Separation with Resins[J].Molecules,2014,19:7040-7056
[26]陈岩,王智勇,杨一坤.HPLC法测定蚕桑资源中1-脱氧野尻霉素的含量[J]．中国药房,2010,21(3):245-247
[27]耿鹏,朱元元,杨洋,等.桑树资源中1-脱氧野尻霉素的测定及其生物活性分析[J].中草药,2005,36(8):1151-1154
[28]徐鑫,魏晓蕊,叶群,等.超声波辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素工艺的响应面法优化[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2012,33(4):81-86
[29]花俊丽,刘树兴,陈素娟.超声波法提取1-脱氧野尻霉素[J].食品与生物技术学报,2009,28(6):845-849
[30]李宇亮,李剑敏,吴雅睿.1-脱氧野尻霉素提取分离方法研究[J].应用化工,2006,35(9):659-661,665
[31]GANZLER K.Microwave Extraction:Anovel sample preparation method for chromatography[J].J Chromatogr,1986,371(11):299-306
[32]胡瑞君,车振明,徐丹,等.微波辅助提取桑叶生物碱DNJ的工艺研究[J].食品科技,2007(8):139-141
[33]刘超,史正琴,向伟,等.桑枝1-脱氧野尻霉素的提取及其含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性分析[J].林业科学,2015,51(2):112-120
[34]杨翠平.桑叶中1-脱氧野尻霉素的检测、提取及分离纯化研究[D].南昌:南昌大学,2015:1-65
[35]TALESHI M.Progress in Membrane Science and Technology for Seawater Desalination-a Review[J].Desalination,2001,134:47-54
[36]颜继忠,雷伟,李行诺,等.桑叶中降血糖组分1-脱氧野尻霉素的富集与纯化研究[J].浙江工业大学学报,2013,41(3):241-243,249
[37]刘国艳,徐鑫,叶群.超滤与纳滤膜技术应用于桑叶中1-脱氧野尻霉素分离浓缩的效果观察[J].扬州大学烹饪学报,2013,30(4):55-60
[38]杨茹,卢朝华.天然产物中提取分离高纯1-脱氧野尻霉素的方法:200910167602.5[P].2010-02-24
[39]李玲,张琴,朱卫敏,等.药桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的薄层鉴别的研究[J].广州化工,2016,44(1):72-74
[40]曹学丽.高速逆流色谱及其在生物活性成分分离中的应用[C].全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集,2010
[41]花俊丽.桑叶DNJ和多糖的提取分离及活性研究[D].西安:陕西科技大学,2009:1-74
[42]黄勇,刘凡,廖森泰.采用大孔树脂与阳离子交换树脂分离纯化桑叶活性物质的效果分析[J].蚕业科学,2012,38(6):1079-1085
[43]殷红.脱氧野尻霉素的一种纯化方法:201110422786.2.5[P].2011-12-16
[44]杨梅,刘玉明,高瑞昶.高效液相色谱法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量[J].武警医学,2007,18(2):121-124
[45]徐鑫,刘国艳,叶群,等.一种联合膜分离和柱层析技术制备高纯度1-脱氧野尻霉素的方法:201310237898.X.0[P].2013-09-04
[46]马全民,聂复礼,李雪斌,等.由桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法:201110038204.0[P].2011-06-22
[47]李凡,裘雅渔,钱文春,等.桑叶中总生物碱和1-脱氧野尻霉素的含量考察[J].中国药学杂志,2008,43(3):176-179
[48]李有贵,储一宁,钟石,等.59份野生桑桑叶中的DNJ含量及粗提物对α-糖苷酶的抑制活性[J].蚕业科学,2010,36(5):729-737
Review on the Methods of Extraction，Isolation and Purification of 1-Deoxynojirimycin in Mulberry Leaf
NI Qin1，ZHU Bo-yu1，JIANG Huan-zhu1，ZHENG Xiao-jian1，LU Xiao-ping2，CAO Xia-min1，*
（1.School of Biology&Basic Medical Science，Medical College，Soochow University，Suzhou 215123，Jiangsu，China；2.Gold Mantis School of Architecture，Soochow University，Suzhou 215123，Jiangsu，China）
收稿日期：2017-03-30
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.042
基金项目：苏州大学大学生创新项目（2016xj058）
作者简介：倪沁（1995—），女（汉），本科生，研究方向：食品质量与安全。
*通信作者：曹霞敏（1986—），女，讲师，博士，研究方向：果蔬非热加工。