崔丽霞，张志军*，李晓君，李会珍
（中北大学化工与环境学院，山西太原030051）
摘 要：花青素是水溶性天然色素，具有重要的营养价值和药用价值，在食品、化妆品、医药等行业有着巨大的潜力。综述花青素的溶剂浸提法和辅助提取法等提取方法，膜分离法、柱层析法、高效液相色谱法和高速逆流色谱法等纯化方法，总结各种方法的优势和不足，为花青素的产业化开发和深入研究提供参考。
关键词：花青素；提取；纯化
Abstract：Anthocyanins which are water-soluble natural colorants and possess significant nutritional and pharmaceutical values，have great potential in food，cosmetics and medicine industries.The extraction methods，such as solvent extraction and the assisted extraction，and the purification methods，such as membrane separation，column chromatograph，high performance liquid chromatograph and high speed counter current chromatograph were reviewed.The advantages and disadvantages of various methods were summarized.The paper provided a reference for industrial development and further study of anthocyanins.
Key words：anthocyanins；extraction；purification
花青素是水溶性天然色素，属黄酮类化合物，存在于植物细胞的液泡中，能随液泡pH值变化呈现出不同颜色。在食品工业，合成色素的安全性备受质疑，而天然植物色素花青素副作用小、安全性高、着色艳丽，广受好评。在欧洲、日本、美国等国家，天然来源的花青素被广泛应用在食品和饮料中[1]。花青素的另一个显著特征是具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、保护心血管等多种生物活性[2-4]，还具有防止体重增加，保护视力等功能[5-6]，因此研究者对花青素的开发和研究越来越感兴趣。提取纯化方法关系到花青素的活性研究及结构鉴定，进而关系到花青素产品的开发，因此本文对国内外花青素提取和纯化方法进行了系统的综述，旨在为花青素进一步研究奠定基础，为花青素的产业化开发提供参考。
花青素的提取方法主要包括两类：溶剂浸提法和辅助提取法。其中，溶剂浸提法是传统的提取方法，目前仍然被各实验室所用。随着科技的发展，以提取率高、条件温和、溶剂用量少和环境友好等为直接目标，出现了超声波辅助提取法，微波辅助提取、酶辅助提取法、双水相萃取法、高压脉冲电场法和超临界流体萃取等提取方法。
溶剂浸提法是指将植物材料干燥粉碎或新鲜材料破碎后直接加入溶剂浸提。为了避免细胞内花青素不被降解，某些学者也采用液氮研磨或冷冻干燥（-80℃）的方法来处理植物材料[7-8]。适宜的提取条件为4℃避光浸提1 d～2 d，或50℃～70℃搅拌浸提1 h～2 h。提取溶剂包括水、乙醇、甲醇、丙酮或者几种溶剂的混合溶液。几种提取溶剂的提取效率不同，水提法提取率低，杂质含量高；乙醇无毒，且提取率高，是常用的提取溶剂；甲醇和丙酮有毒，限制了它们的应用，但实验室的基础研究并不受此限制。由于花青素在酸性条件下稳定，在提取时为了防止花青素降解，通常加入一定量的有机酸或无机酸，甲酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、盐酸等较为常用[9]，硫酸、硝酸也有报道[10]。该法操作简单，不足之处是提取时间长，效率低，常与各种辅助提取手段结合使用。
超声能量产生强烈的空化效应加速了溶剂对植物组织的渗透，提高了溶质的浸出效率。目前，该法被广泛应用于植物多酚、多糖等生物活性物质的提取。在超声波提取过程中，超声功率、时间、温度等在适合的范围内能提高花青素的提取率，需要研究这些因素的单独和协同作用对结果的影响，从而优化出最佳方案。Rodrigues等[11]通过响应面法优化了巴西嘉宝果皮的超声辅助提取工艺，最适合的提取工艺为：乙醇体积分数 46%，pH1，料液比 1∶20（g/mL），在此条件下，花色苷提取率为4.8 mg/g干重。Ivanovic等[12]研究了超声辅助法提取黑莓花青素，在一定的超声功率（60 W）下，随着超声提取时间（15 min～30 min）的延长和提取温度（25℃～40℃）的升高，花青素的提取率和提取物的抗氧化活性也随之升高。与传统的提取方法相比，超声波提取法能降低提取温度，避免高温对花青素的降解，缩短提取时间，同时该法具有设备简单，操作方便的特点。此法使用大量的有机溶剂，需要对有机溶剂进行有效回收，另外由于有机溶剂具有易燃性，因此在放大生产中必须考虑设备的安全性。
微波辅助提取法是利用微波加热来促进溶剂的萃取速度和效率的方法。Liazid等[13]采用微波提取法从葡萄皮中提取花青素，提取工艺为微波功率500 W，提取温度100℃，甲醇体积分数40%，相对于传统的溶剂浸提法，提取时间从5 h缩短至5 min，同时发现提取物种的3种酰化花青素在传统提取法的提取物中并不存在。贾士芳等[14]比较了热水浸提、直接酸解、超声波和微波辅助4种提取方法对紫玉米穗轴花青素提取结果的影响，4种方法的提取时间分别为720、360、40、7 min；提取温度分别为 65、60、50、40 ℃；花青素得率分别为7.85%、12.11%、18.42%、16.78%，表明超声波和微波法有显著的优势，尤其是微波提取法，提取时间只有7 min，而提取率与超声波法相差不大。该法具有操作简单，提取时间短，有效成分得率高的优势。但是该法同超声波辅助提取法一样使用大量的有机溶剂，因此提取过程要加强安全管理。
在提取溶剂中加入一定量的酶对植物细胞进行破壁，有利于目标产物的溶出。张慢等[15]等优化了酶-超声波辅助法提取紫薯花青素的条件，结果表明，当纤维素酶添加剂量为54 U/mL时，该法与传统的有机溶剂浸提法相比花青素得率提高了2.73倍，提取时间缩短了75%。Segade等[16]在提取溶剂中添加纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶等对葡萄皮细胞进行软化，结果缩短了浸提时间，受到酶的剂量和葡萄品种的影响，花青素得率比对照提高8%～15%。此法作用条件温和，提取率高，不足之处是在处理结束后，酶的回收和再利用造成了困难，从而增加了提取成本。
双水相萃取法利用短链醇（乙醇、甲醇和异丙醇）和无机盐（如磷酸盐和硫酸盐）形成稳定的、可调的双水相体系统，给目标产物提供了一个温和无毒的环境。这种方法在提取的同时，对样品有初步纯化的作用。Wu等[17]利用乙醇-NaH2PO4双水相系统提取葡萄汁中的花青素，最优条件为NaH2PO4质量分数28%，乙醇体积分数25%，提取温度25℃，提取时间1 h，在此条件下花青素回收率达到99%以上，同时除去75%的多糖。Liu等[18]利用响应面法优化了紫薯花青素的提取条件，当料液比 1∶45（g/mL），（NH4）2SO4质量分数22%，乙醇体积分数25%，pH3.3时，花青素得率为90.02%。此法在接近室温的条件下操作，条件温和，活性物质损失少，同时易于放大操作，比较适合工业化的应用，但是此法相分离时间长，单次分离效率不高等限制了其工业化的应用。另外，此法中废盐水的后续处理比较困难。
高压脉冲电场产生的电脉冲破坏细胞膜，导致细胞膜形成暂时（可逆）或永久性（不可逆）的孔，从而加速了细胞内容物的释放，电场强度是影响提取物浓度的重要因素。Puértolas等[19]等将高压脉冲电场应用于紫薯花青素的提取研究，预处理工艺为电场强度3.4 kV/cm，处理时间105 μs，在此条件下显著的提高了花青素的提取率；进一步比较发现，水作为提取溶剂，处理组的花青素得率为65.8 mg/100 g鲜重，而96%乙醇作为提取溶剂，未处理组的花青素得率为63.9 mg/100 g鲜重，这表明高压脉冲电场法极大的减少了有机溶剂的使用。López-Giral等[20]利用高压脉冲电场法提取葡萄皮中的酚类化合物，产品的色度，花青素和多酚含量均高于对照组，但提高幅度与葡萄品种有关，应针对植物材料不同，选择最佳的处理条件。该法最大特点是处理时间短，所需有机溶剂少，环境友好，然而此法需要在短时间内产生强的高压电场，对设备要求较高。
超临界流体萃取是以高压、高密度的超临界状态流体为溶剂，从原料中萃取所需要的组分，然后采用升温、降压或二者兼用的方法，将溶剂与所萃取的组分进行分离的一门新型工艺。该过程以CO2为萃取剂，通过混合改性剂水、乙醇、甲醇或丙酮来提取花青素等极性成分。Paes等[21]对超临界CO2提取蓝莓果渣花青素的工艺进行了研究，萃取温度40℃，萃取压力20 MPa，溶剂流速10 mL/min，添加5%水和5%乙醇，其产量，抗氧化性，多酚含量和花青素含量为最优。该法具有明显的提取优势，首先，CO2为萃取剂，具有无色、无味、无毒、不易燃、安全和高性价比的特点；同时，该法提取温度低，减少了生物活性物质的降解；另外，该法显著减少了有机溶剂的使用，是一种环境友好的提取技术，因此在生物活性物质的提取方面受到很高的重视。虽然涉及到大型设备和安装成本，但从长期利益分析，符合绿色环保的现代工业提取概念，发展潜力巨大。
花青素粗提物中含有大量的糖类、有机酸、氨基酸和蛋白质等，不仅含量低，色价低，而且容易吸潮，在实际应用中会产生大量的沉淀，也不能满足活性研究及结构鉴定的需要，因此需建立经济有效的纯化方法来消除杂质。目前，花青素的分离纯化方法主要包括以下几种。
膜分离法是以选择性透过膜为分离介质，利用膜对混合物各组分渗透性能的差异实现分离、提纯或浓缩的技术。常用的膜分离法有微滤、超滤、纳滤、反渗透和电渗析。徐贞贞等[22]研究了不同的膜分离法对花青素粗提液的浓缩效果，结果表明无机陶瓷膜超滤+纳滤膜，和无机陶瓷膜超滤+反渗透两种集成膜处理工艺均可得到品质优越的花青素浓缩液。Husson等[23]采用电渗析膜装置，在膜装置上施加电场，导致花青素在电场迁移，从而有效富集花青素。膜分离法无需加热，能够保留天然产物的生物活性。然而，随着分离时间的延长，造成膜的污染和堵塞，因此在使用中需要适当增加膜的使用面积，或多种膜分离方法串联使用，并对膜进行定期清洗，以增加膜的使用寿命。
柱层析法又称柱色谱法，是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数的不同，从而进行分离的一种方法。根据填充基质和样品分配交换原理的不同，可分为大孔树脂柱、硅胶柱、聚酰胺柱、凝胶柱和离子交换柱。大孔树脂具有操作简单、可再生和成本低的特点，是纯化花青素的主要方法。目前市场上有不同类型的大孔树脂，满足了不同的纯化需要。胡晓梅等[24]比较了10种大孔树脂对越橘花青素的纯化效果，结果表明DM21树脂为具有较好的吸附和解析能力，为纯化越橘花青素的最佳树脂，经HPLC检测，纯化后的花青素含量为36%，产品纯度完全符合欧洲标准。本实验室利用AB-8树脂纯化紫苏花青素，纯度为5.437%，是纯化前的7.269倍[25]。
大孔树脂与其它柱层析法串联使用，能获得更高纯度的花青素产品。Yang等[26]利用大孔树脂AB-8和凝胶柱Sephadex LH-20纯化树莓花青素，矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-槐糖苷的纯度分别为95.52%和94.76%。Kang等[27]串联使用离子交换大孔树脂XAD-7，硅胶RP-18和凝胶柱Sephadex LH-20，结合液质及核磁分析，纯化并鉴定了紫苏叶提取物中的多种花青素和酚类化合物。
高效液相色谱分离的产品具有纯度高、回收率高且分离效率高的优点，并具有较大的样品处理能力，被广泛应用在花青素的分离、富集和纯化。由于花青素在酸性条件下稳定，应使用耐酸性强的色谱材料。Wang等[28]串联使用 Amberlite XAD-7HP、Sephadex LH-20和半制备液相色谱法相结合的方法，从野生蓝莓得到3个单体花青素锦葵色素-3-O-葡萄糖苷，牵牛色素-3-O-葡萄糖苷，飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷，纯度分别为97.7%，99.3%和95.4%。Chorfa等[29]首先用固相萃取柱硅胶C-18和DSC-SCX阳离子交换树脂对野生蓝莓花青素进行纯化，然后通过制备液相色谱法分级分离，LC-MS和NMR进行结构鉴定，主要花青素包括飞燕草素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷，矢车菊素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷，芍药色素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷，锦葵色素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷的纯度几乎高达100%。
高速逆流色谱是一种液-液色谱分离技术，与传统的固体支持基质相比，具有能够减少吸附损失和样品失活，避免溶质峰的污染和拖尾，样品回收率高的优点，已经应用在天然产物的分离与纯化领域，该方法的重点在于两相溶剂体系的优化。Chen等[30]首先利用AB-8树脂初步纯化金银花花青素，然后应用叔丁基甲基醚/正丁醇/乙腈/水/三氟乙酸组成的两相溶剂体系（2∶2∶1∶5∶0.01，体积比），从100 mg金银花花青素粗提物中，得到了22.8 mg纯度为98.1%的矢车菊素-3-葡萄糖苷。胡晓丹等[31]先后利用XAD-7树脂和高速逆流色谱纯化紫苏花青素，丙二酰基紫苏宁和紫苏宁纯度分别为96.7%、97.5%。
针对以上花青素提取和纯化方法的研究，归纳总结如下：提取方面，传统的溶剂浸提法提取率低，耗时长，而辅助提取方法具有显著的优势，尤其是高压脉冲电场和超临界辅助提取法具有提取率高、溶剂用量少和环境友好的特点，发展潜力巨大。纯化方面，需要针对纯化目的来选择纯化方法，大孔树脂法适合对花青素的前期纯化，后续可以通过与其他纯化方法组合使用，来获得更高纯度的产品。
随着人们保健意识的提高，市场上对花青素产品的需求量越来越大。深入研究花青素的提取纯化方法，能有效促进花青素资源的产业化开发，满足消费者的需要。提取和纯化是一项系统工作，如何简化操作、降低成本，同时获得提取率高、回收率高和生物活性高的产品是一项挑战性课题。在以后的工作中，一方面在现有的技术基础上，继续优化提取纯化工艺，积极探索和开发新技术，提高花青素的提取纯化效率，为花青素的研究和应用提供有力的技术支持。另一方面加大研究成果的转化力度，探索花青素的标准化生产工艺，从而获得质优价廉的花青素产品。
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Research Progress on Extraction，Separation and Purification of Anthocyanins
CUI Li-xia，ZHANG Zhi-jun*，LI Xiao-jun，LI Hui-zhen
（School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China）
收稿日期：2017-02-28
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.041
基金项目：山西省科技厅社会发展攻关项目（201603D321031）；山西省农业科技攻关项目（20150311009-4）
作者简介：崔丽霞（1976—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：植物有效成分提取。
*通信作者：张志军（1973—），男（汉），博导，博士，主要从事植物资源开发与利用研究。