思茅甜竹是禾本科，刚竹属乔木或灌木状竹类，主要生长在我国云南普洱地区，甜笋出笋期在4月中旬[1]。甜笋营养价值较高，富含蛋白质、脂肪、糖类及多种微量元素、维生素与膳食纤维，不仅具有防癌、解毒的作用，适量食用还可促进人体肠道蠕动，减少人体内脂肪堆积[2]。竹笋多糖是竹笋中重要的活性成分之一，具有抗氧化[3]、降血糖[4]、调节肠道菌群[5-7]、增强免疫力[1，8]等生物活性。多糖是由酮糖、醛糖或其衍生物通过不同类型的糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，根据原料来源不同，分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖[9]。随着研究的深入，多糖被证明具有抗癌[10]、抗病毒[11]、免疫调节[12]、改善肾损伤和炎症[13]等生物活性，尤其是植物来源的多糖因其抗氧化特性和无毒特性，在多糖领域逐渐成为研究热点。植物多糖大多为活性多糖，具有抗氧化[14]、免疫调节[15]、抗肿瘤[16]、降血糖[17-19]等生理活性，而且其来源广泛，种类繁多，具有天然无污染、安全性高、毒副作用小等优势，具有潜在的研究价值。目前多糖提取方法主要有水提法[20]、溶剂浸提法[21]、酶解法[22]、超声波法[23]和微波辅助提取法[24]。水提法是最常用的多糖提取方法，该方法条件较为温和，不会破坏多糖的原始结构，且具有成本低、操作安全便捷、所需设备简单等优点[1，20]，但提取耗时较长，且部分大分子多糖不溶于水[25]。溶剂浸提法的优点是多糖提取较为彻底，但需严格控制温度，且易破坏多糖结构。酶解法提取条件温和、提取效率高，但提取时间较长，试验过程需严格控制反应条件，并且酶制剂成本较高[9]。超声波法和微波辅助提取法均具有提取时间短、易操作和提取效率高的优点，但超声处理时产生的噪音会对人体产生一定影响[26]，且长时间的超声作用可能导致多糖部分降解[9]；而微波辅助提取法成本相对较高。本试验采用内部沸腾法，该方法通常用乙醇溶剂浸润原料，再快速加入一定量特定温度的水或其他溶剂，使植物组织内部乙醇沸腾，通过强化传质提升提取效果[27]，具有耗时短、提取率高、杂质少、无需特殊仪器设备、对环境影响小等优点，目前尚未见有采用内部沸腾法提取甜笋多糖的报道。因此，本试验将内部沸腾法应用于思茅甜笋多糖的提取，并对其单糖组成及抗氧化活性进行分析，以期得到较好的思茅甜笋多糖提取工艺，为思茅甜竹资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
思茅甜笋：市售。无水乙醇、盐酸、过氧化氢水溶液：汕滇药业有限公司；95%乙醇：天津市致远化学试剂有限公司；硫酸亚铁、硫酸：天津市大茂化学试剂厂；水杨酸、三氯乙酸、硝酸钠：国药集团化学试剂有限公司；L-抗坏血酸：成都市科隆化学品有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、1，2，3-三羟基苯、正丁醇、苯酚：上海麦克林生化科技有限公司；Tris-盐酸缓冲液：上海源叶生物科技有限公司；磷酸缓冲液、铁氰化钾：南京化学试剂有限公司；三氯化铁：西陇化工股份有限公司；石油醚：广东光华科技股份有限公司；三氟乙酸、甲醇：上海安谱实验科技股份有限公司；氢氧化钠（色谱纯）、醋酸钠：北京萘析生化科技有限公司；岩藻糖（fucose，Fuc）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，Fru）、核糖（ribose，Rib）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，Gal-UA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，Glc-UA）、甘露糖醛酸（mannuronic acid，Man-UA）、古罗糖醛酸（guluronic acid，Gul-UA）（均为色谱纯）：美国西格玛奥德里奇公司。除特殊标注外，其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ScoutSE-SE202F电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；TDL-5-A低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；DFY-500摇摆式高速中药粉碎机：温岭市林大机械有限公司；RV8旋转蒸发仪：艾卡仪器设备有限公司；WFJ7200紫外-可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；HH-S2电子恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限责任公司；FD-1C-50冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司；ICS5000离子色谱系统、Nicolet iS20红外光谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司；DAWN HELEOS II 18角激光光散射检测、OPTILAB T-rEX 示差检测器：美国怀雅特技术公司。
1.3 试验方法
1.3.1 思茅甜笋粗多糖提取工艺
将思茅甜笋在65 ℃下干燥8 h后粉碎、过筛。准确称取干燥甜笋粉1.00 g，加入30%乙醇作为解析剂，解析15 min；待其完全渗透材料后，迅速加入料液比为1∶30（g/mL）的热水提取6 min。提取结束后，待提取物冷却至室温，以10 000 r/min离心5 min，提取液过滤并浓缩至5 mL左右，加入95%乙醇进行醇沉，置于冰箱静置12 h。所得甜笋多糖浸膏于65 ℃下烘干至恒重后称量[27-28]。粗多糖得率（y，%）的计算公式如下。
y=a/b×100
式中：a为提取得到的粗多糖质量，g；b为思茅甜笋的质量，g。
1.3.2 思茅甜笋粗多糖提取单因素试验
在预试验基础上，固定基本提取条件为解析温度60 ℃、提取时间6 min、解析时间15 min、料液比1∶30（g/mL）、解析剂用量6 mL、解析剂（无水乙醇）浓度30%，依次考察以下单因素对思茅甜笋粗多糖得率的影响。其中解析剂浓度分别设置为20%、30%、40%、50%、60%（体积分数）；提取时间分别设置为4、5、6、7、8 min；解析剂用量分别设置为3、4、5、6、7 mL；解析温度分别设置50、60、70、80、90 ℃；料液比分别设置为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）；解析时间分别设置为5、10、15、20、25 min。其余条件按基本条件固定。
1.3.3 思茅甜笋粗多糖的初步纯化
将提取的甜笋粗多糖用蒸馏水配成10 mg/mL的多糖溶液，加入适量的活性炭脱色，搅拌均匀，静置30 min后抽滤。向脱色的滤液加入体积比为5∶1的Sevage试剂（氯仿与正丁醇体积比为4∶1），充分振摇后静置，待溶液明显分层后除去蛋白层，重复操作3～5 次以除尽蛋白质[29]。将处理后的多糖溶液装入截留分子量为1 000 Da的透析袋中，用蒸馏水透析48 h，收集透析液，经抽滤、浓缩、冷冻干燥后，得到初步纯化的思茅甜笋多糖。采用苯酚-硫酸法[30]以葡萄糖为对照品，测定纯化后的多糖质量分数。
1.3.4 粗多糖结构表征
采用溴化钾压片法对纯化后的多糖进行结构表征；在波长200～800 nm范围内对多糖样品进行光谱扫描，测定其纯度。
1.3.5 单糖组分测定
采用离子色谱系统结合电化学检测器对样品单糖组分进行分析。色谱条件：DionexTM CarboPacTM PA20色谱柱（150 mm×3.0 mm，10 μm）；进样量为5 μL；流动相A为超纯水，流动相B为0.1 mol/L NaOH溶液，流动相C为体积比1∶1的0.2 mol/L NaAc溶液和0.1 mol/L NaOH溶液；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃。
1.3.6 粗多糖分子量检测
将样品溶解于0.1 mol/L硝酸钠水溶液中，配制成终浓度为1 mg/mL的样品溶液，经0.45 μm滤膜过滤后上机检测。色谱条件：检测器为DAWN HELEOS II 18角激光光散射检测和OPTILAB T-rEX 示差检测器；凝胶排阻色谱柱为Ohpak SB-805 HQ（300 mm× 8 mm）、Ohpak SB-804 HQ（300 mm×8 mm）和 Ohpak SB-803 HQ（300 mm×8 mm）；流动相为0.1 mol/L NaNO3，流速为0.4 mL/min，柱温为45 ℃，进样量为100 μL。
1.3.7 思茅甜笋粗多糖的抗氧化活性测定
1.3.7.1 羟自由基清除能力测定
取1.0 mL不同质量浓度的思茅甜笋多糖溶液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）于5 个比色管中，加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液（50%乙醇溶液配制）、1 mL 0.03% H2O2，在37 ℃下水浴加热1 h，冷却至室温后，采用紫外-可见分光光度计测定其在510 nm处的吸光度。以L-抗坏血酸作为对照组，每组试验设置3次平行[31]。羟自由基清除率（E，%）的计算公式如下。
式中：A1为多糖样品的吸光度；A2为1 mL 50%乙醇溶液代替水杨酸溶液的吸光度；A0为1 mL去离子水代替的多糖样品溶液的吸光度。
1.3.7.2 DPPH自由基清除能力测定
将3 mL不同浓度的思茅甜笋多糖水溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）与5 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合，在黑暗环境中室温反应30 min，采用紫外-可见分光光度计测定其在517 nm处的吸光度。以L-抗坏血酸作为对照组，每组试验设置3次平行[32]。DPPH自由基清除率（D，%）的计算公式如下。
式中：A1为3 mL思茅甜笋多糖溶液和5 mL DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2为3 mL思茅甜笋多糖溶液和5 mL乙醇的吸光度；A0为3 mL乙醇和5 mL DPPH-乙醇溶液的吸光度。
1.3.7.3 超氧阴离子自由基清除能力测定
取2.0 mL不同质量浓度的多糖溶液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL），加入4.5 mL置于25 ℃水浴锅中水浴30 min后的Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH8.2）、0.4 mL 25 mmol/L 邻苯三酚溶液混合均匀，于25 ℃下反应4 min。加入2滴8 mol/L盐酸停止反应后加入15 mL去离子水。采用紫外-可见分光光度计测定其在320 nm处的吸光度。以L-抗坏血酸作为对照组，每组试验设置3次平行[33]。超氧阴离子自由基清除率（O，%）的计算公式如下。
式中：A1为加邻苯三酚溶液和思茅甜笋多糖样品溶液的吸光度；A2为不加邻苯三酚溶液但加思茅甜笋多糖样品溶液的吸光度；A0为加邻苯三酚溶液但不加多糖样品溶液的吸光度。
1.3.7.4 总还原能力测定
取1 mL不同质量浓度的思茅甜笋多糖溶液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）于比色管中，分别加入1 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）和1 mL 1%铁氰化钾溶液（现配现用），混匀，在50 ℃的水浴锅中反应20 min，取出冷却至室温，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，室温下反应10 min；再向溶液中加入1 mL蒸馏水和0.2 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀放置10 min，采用紫外-可见分光光度计测定其在700 nm处的吸光度。以L-抗坏血酸作为对照组，每组试验设置3次平行[34]。
1.4 数据处理
采用Origin 2018以及Excel 2016对数据进行处理并绘图，利用软件Chromeleon处理色谱数据。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 解析剂浓度和提取时间对思茅甜笋粗多糖得率的影响
设定解析温度为60 ℃，解析剂用量为6 mL，解析时间为15 min，料液比为1∶30（g/mL），考察解析剂浓度和提取时间对粗多糖得率的影响，结果如图1所示。
图1 解析剂浓度和提取时间对粗多糖得率的影响
Fig.1 Effect of resolving agent concentration and extraction time on the yield of crude polysaccharides
由图1a可知，粗多糖得率在解析剂浓度为30%时最高；进一步增加解析剂浓度，粗多糖得率反而下降。因此，综合考虑确定最佳解析剂浓度为30%。由图1b可知，粗多糖得率在提取时间为6 min时最高，继续延长提取时间，粗多糖得率无明显变化，表明多糖已基本溶出，因此，确定最佳提取时间为6 min。
2.1.2 解析剂用量和解析温度对思茅甜笋粗多糖得率的影响
设定解析剂浓度为30%，提取时间为6 min，解析时间为15 min，料液比为1∶30（g/mL），考察解析剂用量和解析温度对粗多糖得率的影响，结果如图2所示。
图2 解析剂用量和解析温度对粗多糖得率的影响
Fig.2 Effect of resolving agent dosage and desorption temperature on the yield of crude polysaccharides
由图2a可知，粗多糖得率随着解析剂用量的增加先升高，而后趋于平缓。当解析剂用量为6 mL时，粗多糖得率达到最高，继续增加解析剂用量，粗多糖得率无明显变化，表明多糖已基本溶出，因此，确定最佳解析剂用量为6 mL。由图2b可知，粗多糖得率在解析温度为60 ℃时达到最高，进一步升高温度，粗多糖得率呈下降趋势，可能是因为随着解析温度的升高，内部乙醇沸腾速度过快，对流扩散维持时间缩短，而多糖分子较大，扩散迁移较慢，还未充分扩散出即造成溶出通道堵塞[34-35]，导致粗多糖得率降低，因此，确定最佳解析温度为60 ℃。
2.1.3 提取料液比和解析时间对思茅甜笋粗多糖得率的影响
设定解析温度为60 ℃，解析剂浓度为30%，提取时间为6 min，解析剂用量为6 mL，考察料液比和解析时间对粗多糖得率的影响，结果如图3所示。
图3 料液比和解析时间对粗多糖得率的影响
Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio and desorption time on the yield of crude polysaccharides
由图3a可知，粗多糖得率随着溶剂用量的增加先升高，而后趋于平缓。当料液比达到1∶30（g/mL）时，粗多糖得率达到最高，多糖已基本溶出，继续增加溶剂用量对得率无影响，因此，确定1∶30（g/mL）为最佳料液比。由图3b可知，粗多糖得率随着解析时间的延长先升高，而后趋于平缓。可能是随着解析时间的延长，解析剂对多糖分子的作用增强，解析更充分；当解析时间达15 min时，多糖已基本解析完全，粗多糖得率为7.5%，继续延长解析时间多糖得率变化不大。因此，选择15 min为最佳解析时间。
2.2 思茅甜笋粗多糖结构分析
红外光谱可用于测定多糖分子中的官能团，常用于多糖结构的初步表征。紫外分光光谱则用于对多糖中蛋白质和核酸进行定性检测。思茅甜笋粗多糖的红外光谱和紫外光谱分析如图4所示。
图4 粗多糖的红外光谱和紫外光谱图
Fig.4 Infrared and ultraviolet spectra of crude polysaccharides
由图4a可知，3 407.09 cm-1的宽频带为—OH的拉伸振动，2 833.33 cm-1处的吸收带归因于—CH2的C—H伸缩振动；1 700 cm-1处无吸收峰，表明该多糖结构不含糖醛酸[36]。在1 200～1 020 cm-1范围内，强烈重叠的红外波段归因于吡喃环上的C—O拉伸振动。1 643 cm-1处的条带可能由结合水引起，900 cm-1附近的吸收峰表明多糖中存在β-吡喃皂苷连锁[37]。870～810 cm-1之间无吸收峰，表明多糖中不存在甘露糖残基。770 cm-1附近的弱吸收带是归因于α-D-（1-4）和α-D-（1-6）糖苷键的环拉伸和环变形[38]。由图4b可知，在271 nm处有吸收峰，说明初步纯化后的多糖仍含有蛋白质和核酸，表明其仍为粗多糖。
2.3 思茅甜笋粗多糖单糖组成分析
利用离子色谱分析思茅甜笋粗多糖的单糖组成，结果如图5所示。
图5 思茅甜笋粗多糖的离子色谱图
Fig.5 Ion chromatogram of crude polysaccharides from Simao sweet bamboo shoots
由图5a可知，思茅甜笋粗多糖由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖组成，其含量百分比依次为43.79∶39.82∶12.82∶1.73∶1.84。由图5b可知，思茅甜笋粗多糖中未检测到葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古罗糖醛酸等糖醛酸，该结果与红外光谱中未发现糖醛酸结构的结论一致。
2.4 思茅甜笋粗多糖的重均分子量分析
利用软件ASTRA 6.1处理色谱数据，形成思茅甜笋粗多糖的重均分子量分析图，该图以检测的保留时间为横坐标，以摩尔质量为纵坐标，展示了甜笋多糖的光散射信号（light scattering，LS）和示差信号（refractive index，RI）与流出时间关系，结果如图6所示。
图6 重均分子量分析
Fig.6 Weight-average molecular weight analysis
由图6可知，示差信号有2 个多糖峰，通过进一步计算，甜笋多糖的重均分子量为100 000 Da，分子量分布较宽，表明初步纯化后的多糖仍为粗多糖，该结论与红外光谱的结论一致。
2.5 思茅甜笋粗多糖的抗氧化活性
2.5.1 羟自由基清除能力
思茅甜笋粗多糖对羟自由基的清除率见图7。
图7 思茅甜笋粗多糖对羟自由基的清除能力
Fig.7 Scavenging ability of crude polysaccharides from Simao sweet bamboo shoots against hydroxyl radicals
由图7可知，随着思茅甜笋粗多糖质量浓度的增加，其对羟自由基的清除能力也相应增强，说明思茅甜笋粗多糖浓度与羟自由基的清除能力存在一定的量效关系。5.0 mg/mL的思茅甜笋粗多糖的羟自由基清除率为48.79%，为1.0 mg/mL L-抗坏血酸的52.18%，说明思茅甜笋粗多糖对羟自由基有一定的清除能力。这可能与其所含单糖的种类及含量有关[39]。研究表明，植物中多糖具有清除羟自由基的能力[40-41]。
2.5.2 DPPH自由基清除能力
思茅甜笋粗多糖对DPPH自由基的清除率见图8。
图8 思茅甜笋粗多糖对DPPH自由基的清除能力
Fig.8 Scavenging ability of crude polysaccharides from Simao sweet bamboo shoots against DPPH radicals
由图8可知，随着思茅甜笋粗多糖质量浓度的增加，DPPH自由基清除率也逐渐升高，表现出一定的浓度依赖性。结果表明，1.0 mg/mL的思茅甜笋粗多糖溶液的DPPH自由基清除率为47.39%，能达到同浓度下L-抗坏血酸的50.58%，说明其对DPPH自由基具有一定的清除能力，冉俊枫等[42]的研究也表明苦笋壳多糖对DPPH自由基具有较好的清除能力。
2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力
思茅甜笋粗多糖对超氧阴离子自由基的清除率如图9所示。
图9 思茅甜笋粗多糖对超氧阴离子自由基的清除能力
Fig.9 Scavenging ability of crude polysaccharides from Simao sweet bamboo shoots against superoxide anion radicals
由图9可知，随着思茅甜笋粗多糖质量浓度不断增加，超氧阴离子自由基的清除能力也逐渐上升。5.0 mg/mL粗多糖的超氧阴离子自由基清除率可达到1.0 mg/mL L-抗坏血酸的81.33%。表明其对超氧阴离子自由基具有较好的清除能力，李贵荣[43]发现野菊花多糖对超氧阴离子自由基具有较好的清除效果。
2.5.4 总还原能力
思茅甜笋粗多糖对总还原能力的测定结果见图10。
图10 思茅甜笋粗多糖的总还原能力
Fig.10 Total reducing capacity of crude polysaccharides from Simao sweet bamboo shoots
由图10可知，随着质量浓度的增加，铁离子的还原能力呈逐渐上升的趋势。5.0 mg/mL竹笋粗多糖总还原能力能达到相同浓度L-抗坏血酸的70.08%，表明其具有较好的抗氧化能力。倪力军等[44]在对黄芪等中药材多糖的体外抗氧化研究过程中发现，多糖的抗氧化活性与木糖和葡萄糖含量密切相关，且活性随着单糖含量的增加而提高。
3 结论
通过单因素试验，可以得出思茅甜笋粗多糖的最佳解析温度为60 ℃，提取时间为6 min，解析时间为15 min，料液比为1∶30（g/mL），解析剂用量为6 mL，解析剂浓度为30%，在此条件下，多糖的平均得率为 7.5%。单糖组成分析结果表明，思茅甜笋粗多糖由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖组成。通过分子量分析，思茅甜笋粗多糖的重均分子量为100 000 Da，分子量分布较宽，表明初步纯化后的多糖仍为粗多糖。抗氧化活性测试结果表明，质量浓度为5 mg/mL的思茅甜笋粗多糖对羟自由基的清除能力可达1.0 mg/mL L-抗坏血酸的52.18%；质量浓度为1.0 mg/mL的思茅甜笋粗多糖对DPPH自由基的清除能力为同浓度L-抗坏血酸的50.58%；质量浓度为5 mg/mL的思茅甜笋粗多糖对超氧阴离子自由基的清除能力可达到1.0 mg/mL L-抗坏血酸的81.33%。此外，总还原能力测定结果也表明思茅甜笋粗多糖具有良好的还原能力。综上所述，思茅甜笋粗多糖是一种具有开发潜力的天然抗氧化剂，对其纯化组分的结构表征与构效关系分析将是未来工作的重点。
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