我国是世界上茶产量最大的国家，2024年茶叶产量接近300万t。茶叶根据其采摘时节的不同可分为春茶、夏茶和秋茶，其中夏秋茶的采摘量约占茶叶总产量的60%。夏秋茶中因含有更多的茶多酚、咖啡碱等苦味物质，其滋味较春茶更为苦涩，消费者接受度不高[1]。因而采摘的夏秋茶多被废弃，造成了极大的资源浪费。但研究表明，由于生长时间跨度大，夏秋茶中多糖含量显著高于春茶，而茶多糖被证实具有减脂、降血糖、抗氧化、提高免疫力和调节肠道菌群等多种生理功能[2-5]，在食品、营养健康、医药等领域有着广阔的应用前景。
多糖的提取方法有热水浸提法、微波法、超声法、酶解法等[6-8]。传统的热水浸提法虽操作简单，但耗时且效率低；超声法借助超声波产生的机械力、空化和热效应，破坏植物细胞壁，促使多糖快速溶出；酶解法通过分解植物细胞壁中纤维素、果胶等组分，或酶解与多糖结合的蛋白等物质，可有效释放多糖。复合酶辅助超声提取结合了两者优点，缩短提取时间的同时，提取条件更加温和，避免热敏成分的破坏，有利于保护多糖结构和活性[9]。有研究者采用超声与酶解联合的方法对碧螺春茶多糖、藏柳茶多糖分别进行提取，均获得了较高的提取效率[10-11]。但目前采用复合酶辅助超声提取夏秋茶多糖的研究还鲜见报道。
本研究以夏秋茶为原料，采用复合酶辅助超声法提取茶多糖，对其结构进行表征，并探究其体外抗氧化活性，以期为其在食品、医药等领域的应用提供理论依据，促进夏秋茶资源的深度开发和利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
信阳夏秋茶：信阳申林茶业开发有限公司。中性蛋白酶（120 U/mg）、纤维素酶（50 U/mg）、果胶酶（50 U/mg）、过硫酸钾（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、浓硫酸、盐酸、苯酚、无水乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、KH2PO4、NaOH、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1，2-dihydro-5-methyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-one，PMP）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度≥96%）、2，2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（纯度≥99%）、葡萄糖（纯度≥98%）、抗坏血酸（纯度≥99%）、纤维素DE-52（cellulose DE-52，色谱纯）：北京索莱宝科技有限公司；葡聚糖标准品（0.18、0.99、9.9、23、50.6、115、202、343 kDa）（纯度≥98%）：西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）公司。
1.2 仪器与设备
数控超声波清洗器（KQ-700DE）：南北仪器有限公司；旋转蒸发器（RE-2000A）：上海亚荣生化仪器厂；电子天平（FA2004）：上海衡际科学仪器有限公司；磁力加热搅拌器（79-1）：江苏中大仪器科技有限公司；电热鼓风干燥箱（101-1AB）：天津市泰斯特仪器有限公司；台式低速离心机（L550）：湖南湘仪离心机仪器有限公司；高速万能粉碎机（FW400A）：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2700）：日本岛津公司；高速冷冻离心机（CR22N）：日本日立公司；傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet iS50）、聚焦离子束场发射扫描电镜（Helios 5 CX）：赛默飞世尔科技有限公司；同步热分析仪（STA 6000）：珀金埃尔默仪器有限公司；X-射线衍射仪（Smart Lab）：日本理学株式会社；凝胶渗透色谱仪（Waters 1515-2414）：美国沃特世公司。
1.3 试验方法
1.3.1 夏秋茶预处理
茶叶粉碎后过40 目筛网，参考文献[12]的方法，用石油醚、无水乙醇进行脱脂脱色处理，得到茶粉样品待用。
1.3.2 夏秋茶多糖提取
称取5 g茶粉，按1∶30（质量比）加入去离子水，按比例加入复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶中性蛋白酶=1∶1∶1，质量比），用0.1 mol/L盐酸将pH值调至4.5后开始酶解，结束后95 ℃灭酶10 min，之后进行超声辅助提取。提取结束后冷却至室温，4 500 r/min离心20 min，收集提取液。旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，4 ℃下醇沉16 h，4 500 r/min离心20 min，取沉淀冻干得到粗多糖。
1.3.3 夏秋茶多糖的纯化
粗多糖用去离子水溶解，加入Sevage试剂（氯仿与正丁醇体积比为4∶1）脱蛋白直至无白色絮状物产生，再加入多糖液体积的3%的30%过氧化氢溶液。用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至8，55 ℃搅拌2 h脱色，结束后将pH值调至7，70 ℃水浴20 min除去多余过氧化氢。透析24 h，冷冻干燥得到茶多糖。
1.3.4 单因素试验
以夏秋茶多糖提取率作为评价指标，选取复合酶添加量（6%、8%、10%、12%、15%）、酶解温度（25、35、45、55、65 ℃）、酶解时间（40、50、60、70、80 min）、超声温度（40、50、60、70、80 ℃）、超声时间（20、30、40、50、60 min）以及超声功率（140、280、420、560、700 W） 6 个因素，考察其对茶多糖提取率的影响。
1.3.5 响应面优化试验
在单因素试验基础上，通过Box-Behnken法对茶多糖提取工艺作进一步优化，具体因素与水平设置见表1。
表1 响应面试验因素及水平
Table1 Factors and levels of response surface experiment
因素水平A复合酶添加量/%B酶解温度/℃C酶解时间/min-110255001235601144570
1.3.6 夏秋茶多糖提取率的测定
参考杨龙宇等[13]的方法并稍作修改。配制浓度为100 μg/mL的葡萄糖标准溶液，分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖标准溶液至对应试管，用去离子水补至2 mL，再依次加入1 mL 6%苯酚溶液与5 mL浓硫酸，反应20 min，随后60 ℃水浴25 min，于490 nm处测定吸光度。绘制得到标准曲线y=0.017 18x-0.020 93（R2=0.994 2）。称取适量1.3.3中茶多糖，用去离子水配制成溶液，按上述方法测定吸光度，并按公式（1）计算茶多糖提取率（Y，%）。
式中：D为稀释倍数；c为待测茶多糖溶液多糖浓度，g/mL；V为待测茶多糖溶液移取体积，mL；m为茶粉质量，g。
1.3.7 夏秋茶多糖表征
1.3.7.1 分子量分布的测定
参考陈燕云等[14]的方法，采用高效凝胶渗透色谱法测定分子量分布。以不同分子量葡聚糖标准品（0.18、0.99、9.9、23、50.6、115、202、343 kDa）相对分子质量的对数值（lgMw）为纵坐标，以色谱峰的保留时间（t）为横坐标，建立分子量分布标准曲线，计算样品的分子量分布。
色谱条件：采用Shodex 860M-SB 804凝胶色谱柱（8 mm×300 mm，10 μm）；柱温40 ℃；流动相为0.1 mol/L硝酸钠水溶液；流速1.0 mL/min；进样量30 μL；样品浓度2 mg/mL，洗脱时间30 min，检测波长410 nm。
1.3.7.2 单糖组成的测定
参考钱荣等[15]的方法并稍作改动。称取10 mg茶多糖样品溶解在2 mol/L TFA溶液中，110 ℃条件下水解反应4 h，用0.3 mol/L NaOH溶液中和水解产物，并用PMP标记；产物过0.45 μm滤膜后进行液相色谱分析。以甘露糖、古洛糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖作为标准品，通过标准品的保留时间和紫外信号响应值确定单糖组成。
色谱条件：采用Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm× 150 mm，5μm）；称取13.6 g KH2PO4和1.8 g NaOH，溶于2 L超纯水中，充分混匀后过0.45 μm滤膜，将此混合溶液与乙腈以体积比83∶17混匀，超声脱气，制得高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）流动相；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL；波长254 nm。
1.3.7.3 红外光谱测定
取茶多糖粉末2 mg，进行傅里叶变换红外光谱分析，设置光谱仪扫描范围400～4 000 cm-1，每个样品累计扫描16次。
1.3.7.4 扫描电子显微镜观察
取适量茶多糖进行样品固定、镀金后，通过扫描电子显微镜观察茶多糖样品的微观结构。
1.3.7.5 热重分析
称取8.17 mg茶多糖样品，以5 ℃/min的升温速率从30 ℃升高至600 ℃，在氮气保护下（气体流速20 mL/min）进行热重分析。
1.3.7.6 X-射线衍射测定
将茶多糖粉末放置于X-射线衍射仪样品架上，在管压40 kV、电流35 mA、衍射角范围3°～80°的条件下对茶多糖进行扫描。
1.3.8 夏秋茶多糖抗氧化活性测定
1.3.8.1 DPPH自由基清除能力测定
参考陈衍真等[16]的方法并稍加修改。配制不同浓度（0.05～2.00 mg/mL）的茶多糖溶液，移取4 mL茶多糖溶液与等体积0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液混合均匀，于暗处反应30 min后，在517 nm波长处测定体系吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照，按照公式（2）计算DPPH自由基清除率（D，%）。
式中：A1为样品吸光度；A2为DPPH无水乙醇换成无水乙醇时的吸光度；A0为多糖溶液换成蒸馏水时的吸光度。
1.3.8.2 ABTS+自由基清除能力测定
参考沈晓静等[17]的方法并稍加修改。准备ABTS工作液，取等体积7 mmol/L的ABTS溶液与浓度2.45 mmol/L的K2SO4溶液混合，蒸馏水稀释使其在734 nm处吸光度为0.7左右。取0.4 mL茶多糖溶液（0.05～2.00 mg/mL），与4 mL ABTS工作液充分混合，暗处反应5 min后于734 nm测定吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照，按照公式（3）计算ABTS+自由基清除率（A，%）。
式中：A1为样品吸光度；A2为ABTS溶液换成蒸馏水时的吸光度；A0为多糖溶液换成蒸馏水时的吸光度。
1.4 数据处理
所有试验均设置3次平行，结果以平均值表示。采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行显著性分析（p＜0.05），采用Origin Pro 2024软件作图，采用SPSS 22与Design-Expert 12软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 复合酶添加量对夏秋茶多糖提取率的影响
复合酶添加量对夏秋茶多糖提取率的影响如图1所示。
图1 复合酶添加量对夏秋茶多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of compound enzyme dosage on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图1可知，随着复合酶添加量的增加，多糖提取率先增加后减小。当复合酶添加量为12%时，多糖提取率最大，为12.24%。添加复合酶可分解茶叶细胞壁中的纤维素、果胶、蛋白质，破坏细胞结构，促进多糖溶出，使其提取率增加。但当复合酶添加量过大时，酶活性会受到抑制，空间位阻也会降低酶与底物的结合效率，使酶催化效率下降。因此，选择复合酶添加量10%、12%、14%进行响应面试验。
2.1.2 酶解温度对夏秋茶多糖提取率的影响
酶解温度对夏秋茶多糖提取率的影响如图2所示。
图2 酶解温度对夏秋茶多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图2可知，在酶解温度为25～65 ℃时，多糖提取率呈现先增加后减小的趋势。在酶解温度35 ℃时，多糖提取率最大。温度升高会加速分子运动，有利于多糖分子溶出，提高多糖提取效率。酶在最适温度下才能发挥其最高效率，当温度高于或低于其最适温度时，酶活性均会下降。温度过高会导致酶结构破坏而失活，多糖提取率降低。因此，选择酶解温度为25、35、45 ℃进行响应面试验。
2.1.3 酶解时间对夏秋茶多糖提取率的影响
酶解时间对夏秋茶多糖提取率的影响如图3所示。
图3 酶解时间对夏秋茶多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图3可知，多糖提取率在酶解时间40～80 min范围内先增加后降低，当酶解时间为60 min时，多糖提取率最大。酶解时间较短时，酶解作用不充分，多糖不易从细胞中向外扩散。随着酶解时间延长，复合酶逐步渗透至茶叶细胞壁内部，持续分解纤维素、果胶等结构多糖，释放包裹的茶多糖，使提取率升高。酶解时间过长，部分酶可能与多糖作用使其降解。同时，酶活随着体系中pH值、黏度等条件的改变而受到抑制，降低提取效率。因此，选择酶解时间为50、60、70 min进行响应面试验。
2.1.4 超声温度对夏秋茶粗多糖提取率的影响
超声温度对夏秋茶多糖提取率的影响如图4所示。
图4 超声温度对茶多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图4可知，多糖提取率随着超声温度的增加先增加后降低。当超声温度为60 ℃时，多糖提取率最大。超声温度升高有利于多糖分子从细胞中溶出并转移至溶剂中。但超声温度过高会破坏多糖结构，造成部分多糖降解，进而导致提取率显著下降。因此，选择超声温度为60 ℃进行后续试验。
2.1.5 超声时间对夏秋茶粗多糖提取率的影响
超声时间对夏秋茶多糖提取率的影响如图5所示。
图5 超声时间对茶多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图5可知，多糖提取率随着超声时间的延长先增加后降低。当超声时间为30 min时，多糖提取率达到最大。超声产生的空化作用可持续破坏茶叶细胞壁残存结构，随超声时间的延长释放更多被包裹的多糖。但当超声时间过长时，可能会导致已释放的多糖链断裂，使其结构和功能遭到破坏[18]。因此，选择超声时间为30 min进行后续试验。
2.1.6 超声功率对夏秋茶粗多糖提取率的影响
超声功率对夏秋茶多糖提取率的影响如图6所示。
图6 超声功率对茶多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图6可知，多糖提取率随超声功率的增加先上升后降低。当超声功率为280 W时，多糖提取率最大。随着超声功率增加，空化效应增强，多糖释放量增多，提取率随之升高；但当超声功率超过280 W时，多糖提取率下降，这可能是因为超声波的热效应导致多糖结构被破坏[19]。因此，选择超声功率为280 W进行后续试验。
2.2 响应面试验及验证试验结果
2.2.1 响应面及方差分析结果
响应面试验设计及结果如表2所示。
表2 响应面试验设计及结果
Table2 Response surface experiment design and results
10-1111.02±0.282-11010.86±0.33611011.96±0.160-1-111.26±0.221300012.17±0.55编号A复合酶添加量B酶解温度C酶解时间多糖提取率/%310111.65±0.4141-1011.48±0.345-10110.27±0.22700012.12±0.238-1-109.67±0.19910-10-110.23±0.541100012.26±0.671201111.62±0.451400012.24±0.491510-111.83±0.521601-112.07±0.641700012.30±0.43
经Design-Expert 12软件拟合，得到多糖提取率的二次多元回归方程为Y=12.22+0.736 2A+0.385 0B-0.103 8C-0.177 5AB-0.055 0AC-0.052 5BC-0.861 5A2-0.364 0B2-0.361 5C2。
表3为夏秋茶多糖提取率回归模型方差分析。
表3 夏秋茶多糖提取率回归模型方差分析
Table3 Analysis of variance of yield of polysaccharide from summer and autumn tea
A复合酶添加量4.3414.34448.02＜0.000 1**B酶解温度1.1911.19122.51＜0.000 1**C酶解时间0.086 110.086 18.90.020 4*残差0.067 870.009 7失拟项0.046 930.015 62.990.158 6方差来源平方和自由度均方F值p值显著性模型10.3791.15119.06＜0.000 1**AB0.12610.12613.020.008 6**AC0.012 110.012 11.250.300 4 BC0.01110.0111.140.321 3 A23.1213.12322.85＜0.000 1**B20.557 910.557 957.640.000 1**C20.550 210.550 256.850.000 1**净误差0.020 940.005 2总离差10.4416
注：*表示差异显著（p＜0.05）；**表示差异极显著（p＜0.01）。
由表3可知，该模型极显著（p＜0.000 1）且失拟项不显著（p=0.158 6＞0.05），决定系数R2=0.993 5，表明此回归模型可行，对数据的拟合较高且对响应值解释度较强。校正系数R2adj（0.985 2）与R2接近且差值小于0.2，说明该模型能进行分析和预测。由F值可知各因素对提取率影响排序为复合酶添加量（A）＞酶解温度（B）＞酶解时间（C）。A和B影响极显著（p值均小于0.01），C影响显著（＜0.05）。
2.2.2 各因素交互作用对夏秋茶多糖提取率的影响
响应面坡度越陡峭、等高线越密集且趋于椭圆形，说明因素间交互作用越显著，反之不显著。各因素交互作用结果如图7所示。
图7 不同因素交互作用对夏秋茶多糖提取率的响应面及等高线
Fig.7 Response surface and contour plots of interaction between various factors on yield of polysaccharide from summer and autumn tea
由图7a可知，复合酶添加量与酶解温度交互作用响应面曲线坡度较大，等高线排列最密集且趋于椭圆，表明两因素间交互作用显著。由图7b可知，酶添加量对提取率的影响高于酶解时间，两因素间交互作用对提取率影响较弱。由图7c可知，酶解温度与酶解时间的响应面曲面坡度最缓，且等高线形状趋于圆形，表明两因素间交互作用较弱，对提取率影响较小。
2.2.3 验证试验结果
通过Design-Expert 12软件分析可知，夏秋茶多糖的最佳提取条件为复合酶添加量12.57%、酶解温度43.34 ℃、酶解时间62.43 min，预测多糖提取率为12.32%。结合实际，将参数调整为复合酶添加量12.5%、酶解温度43 ℃、酶解时间62 min。按此工艺参数进行3次平行验证试验，所得多糖提取率为（12.30±0.06）%，与模型预测值接近，表明夏秋茶多糖提取工艺合理，所建模型可靠。
2.3 夏秋茶多糖表征
2.3.1 夏秋茶多糖分子量
使用凝胶渗透色谱与示差折光检测器串联对茶多糖分子量进行测定，结果如表4所示。
表4 夏秋茶多糖分子量参数
Table4 Molecular weight parameters of polysaccharide from summer and autumn tea
保留数均重均峰值多分散组分名称时间/min分子量/kDa分子量/kDa分子量/kDa指数组分117.22--258.42-组分217.9525.8541.5417.911.61组分321.051.633.653.612.24
注：-表示未测定或未检出。
由表4可知，茶多糖中主要包含3 个组分。组分1较为单一，峰值分子量为258.42 kDa，约占峰面积的13.11%。多分散指数（polydispersity index，PDI）是衡量粒径分布均匀性的重要参数，当PDI值较大时，表示多糖的分子量分布范围较宽，样品中分子量大小差异较大。组分2和组分3的多分散指数分别为1.61、2.24，表明了其成分的复杂性和分子大小的多样性。组分2、组分3的重均分子量分别为41.54、3.65 kDa，分别占峰面积的28.4%、34.2%，是茶多糖的主要组分。
2.3.2 夏秋茶多糖单糖组成分析
采用PMP衍生-高效液相色谱（PMP derivatization high performance liquid chromatography，PMP-HPLC）法测定夏秋茶多糖的单糖组成，结果如图8所示。
图8 夏秋茶PMP衍生-高效液相色谱图
Fig.8 PMP-HPLC chromatogram of monosaccharides derived from the polysaccharide of summer and autumn tea
由图8可知，茶多糖由甘露糖（Man）、古洛糖（Gul）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖醛酸（GlcA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）组成，其物质的量比为Man∶Gul∶Rha∶GalA∶GlcA∶Glc∶Gal∶Ara=7.1∶1.0∶4.4∶1.86∶10.5∶3.04∶12.6∶17.0。其中，占比前三的分别为Ara、Gal、GlcA。徐珊等[20]研究以夏秋茶为原料的黄大茶时，发现其多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖组成，占比超过70%。本研究茶多糖的单糖组成与其研究结果相似但存在一定差异，这可能与茶叶的产地、加工及多糖提取方式的差异有关。
2.3.3 傅里叶变换红外光谱分析
夏秋茶多糖的红外光谱分析结果如图9所示。
图9 夏秋茶多糖的红外光谱图
Fig.9 Infrared spectrum of polysaccharide from summer and autumn tea
由图9可知，位于3 428.28 cm-1附近强烈且极宽的吸收峰是茶多糖分子内或分子间氢键的—OH伸缩振动的结果，该峰具有较大的宽度往往是多糖分子间的氢键结构引起的[21]。说明茶多糖中含有较多联合羟基基团，使其具有很强的亲水特性。在2 925.93 cm-1处的峰是较弱的吸收峰，归属于糖类物质中C—H键的伸缩振动[22]；1 419.35 cm-1处是—CH2的拉伸振动吸收峰[23]，这些吸收峰均为多糖的典型吸收峰，由此可判断组分属于糖类化合物。1 742.25 cm-1附近为C
O伸缩振动吸收峰，与糖醛酸密切相关[24]。1 100～1 000 cm-1间存在吡喃糖苷特征吸收峰，对应着吡喃糖环中C—O—C和C—O—H两种伸缩振动；1 048.63、1 075.15 cm-1处的吸收峰表明吡喃糖环骨架的存在[25]。
2.3.4 微观结构分析
夏秋茶多糖微观结构如图10所示。
图10 夏秋茶多糖的扫描电子显微镜图
Fig.10 Scanning electron microscopy images of polysaccharide from summer and autumn tea
由图10a可知，茶多糖表面分布着大量类似蜂窝状的孔洞结构，这可能是由于冻干过程中游离水快速蒸发造成的，推测多糖分子间的结构相对松散。由图10d和图10e可明显看出，多糖破碎程度较明显，呈不规则的片状结构，但多糖碎片表面较为平整光滑。
2.3.5 热重分析
图11为茶多糖在氮气保护下的热重分析结果。
图11 夏秋茶多糖的热重分析曲线
Fig.11 Thermogravimetric curves of polysaccharide from summer and autumn tea
由图11中热重（thermogravimetry，TG）曲线可知，夏秋茶多糖的热失重过程大致分为3 个阶段。第一阶段处于29.9～163.9 ℃温度区间，失重率达13.46%，这是由于茶多糖中的游离水、结合水在此阶段失去所致。第二阶段温度范围为163.9～418.1 ℃，失重率为43.15%，可能是该温度区间内多糖发生了剧烈的分解反应。第三阶段处于418.1～599.8 ℃温度区间，由重量变化趋于平缓可知此阶段多糖在高温下发生碳化。结果表明，夏秋茶多糖在163.9 ℃以下热稳定性较好。由微商热重分析（derivative thermogravimetry，DTG）曲线可知，茶多糖的最大失重速率点在267.4 ℃。
2.3.6 X-射线衍射分析
图12为夏秋茶多糖的X-射线衍射图谱。
图12 夏秋茶多糖的X-射线衍射图谱
Fig.12 X-ray diffraction patterns of polysaccharide from summer and autumn tea
一般来说，X-射线衍射分析所得图谱中出现清晰、尖锐的衍射峰，表明物质具有部分晶体结构；如果图谱呈现弥散的宽峰，则表明物质以无定形状态存在[26]。由图12可知，多糖在20°（2θ）具有一个较强的衍射峰，其他范围内无明显峰。表明夏秋茶多糖中同时存在晶体与无定形结构。
2.4 夏秋茶多糖抗氧化活性
夏秋茶多糖的抗氧化活性如图13所示。
图13 夏秋茶多糖的抗氧化能力
Fig.13 Antioxidant activity of polysaccharides from summer and autumn tea
由图13a可知，夏秋茶多糖对DPPH自由基有较强的清除能力，但要弱于阳性对照VC。当浓度在0.05～2.00 mg/mL范围内，茶多糖的DPPH自由基清除率先逐渐增强后缓慢增加。当浓度达到2.00 mg/mL时，DPPH自由基清除率最强，达到81.22%。经拟合计算得到夏秋茶多糖对DPPH自由基清除的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为0.39 mg/mL。
由图13b可知，夏秋茶多糖对ABTS+自由基也有较强的清除能力，但弱于阳性对照VC。在0.05～2.00 mg/mL浓度范围内，茶多糖对ABTS+自由基的清除率呈浓度依赖性增加，当浓度为2.00 mg/mL时ABTS+自由基清除率与阳性对照接近，可达到96.93%。夏秋茶多糖对ABTS+自由基清除率的IC50值为0.57 mg/mL。
3 结论
本研究以信阳夏秋茶为原料，经单因素和响应面优化试验对复合酶辅助超声法提取茶多糖工艺进行优化，得到最佳提取条件：复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶中性蛋白酶=1∶1∶1，质量比）添加量12.5%，酶解温度43 ℃，酶解时间62 min，超声温度60 ℃，超声时间30 min，超声功率280 W，在此条件下茶多糖提取率为12.30%。通过凝胶色谱、红外光谱、扫描电子显微镜、热重、X-射线衍射等分析结果表明，夏秋茶多糖为酸性杂多糖，具有疏松孔状结构，由表面光滑的不规则片状结构聚集而成，内部同时存在晶体与无定形结构，在163.9 ℃以下具有较好的热稳定性。抗氧化活性试验结果表明，夏秋茶多糖对DPPH自由基、ABTS+自由基具有较好的清除能力。本研究结果为夏秋茶资源在食品、生物医药领域的开发利用提供了技术支撑和理论依据，有助于推动茶产业的可持续发展。
[1] 余成龙, 吴风堃, 陈昭文. 金寨县夏秋茶生产现状与高质量发展策略探讨[J]. 茶业通报, 2025, 47(1): 12-17.YU Chenglong, WU Fengkun, CHEN Zhaowen. Discussion on production status and high quality development strategy of summer and autumn tea in Jinzhai County[J]. Journal of Tea Business,2025, 47(1): 12-17.
[2] ZHANG Z B, SUN L L, CHEN R H, et al. Recent insights into the physicochemical properties, bioactivities and their relationship of tea polysaccharides[J]. Food Chemistry, 2024, 432: 137223.
[3] KUANG D D, LI X Y, QIAN X P, et al. Tea polysaccharide ameliorates high-fat diet-induced renal tubular ectopic lipid deposition via regulating the dynamic balance of lipogenesis and lipolysis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(22): 12582-12595.
[4] WEI Y, SHAO J, PANG Y X, et al. Antidiabetic potential of tea and its active compounds: From molecular mechanism to clinical evidence[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(21): 11837-11853.
[5] JIN C, ZHOU T T, DUAN Z H, et al. Effect of chin brick tea [Camellia sinensis (L.) Kuntze] on lipid metabolism and inflammation by modulating intestinal flora and bile acids in mice with non-alcoholic fatty liver disease[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2024,318(B): 116950.
[6] YANG B, ZHANG X Y, ZHU J B, et al. Effect of extraction methods of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai on digestion and fecal fermentation in vitro[J]. Food Chemistry, 2024, 24:101725.
[7] BU Y X, LIU Y P, ZHU L Y, et al. Recent advances in polysaccharides derived from the genus Panax: Preparation strategies, structural profiles, functional properties and structure-activity relationships[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(47):26074-26097.
[8] JAYASREE SUBHASH A, BABATUNDE BAMIGBADE G, AL-RAMADI B, et al. Characterizing date seed polysaccharides: A comprehensive study on extraction, biological activities, prebiotic potential, gut microbiota modulation, and rheology using microwaveassisted deep eutectic solvent[J]. Food Chemistry, 2024, 444:138618.
[9] 刘芷珊, 石玉涛, 肖锟月, 等. 茶多糖研究进展与展望[J]. 中国茶叶加工, 2023(4): 66-74.LIU Zhishan, SHI Yutao, XIAO Kunyue, et al. Progress and prospects of research on tea polysaccharides[J]. China Tea Processing,2023(4): 66-74.
[10] 刘鑫, 陈香玉, 郭锐, 等. 碧螺春多糖的超声辅助酶提取工艺优化、分离纯化及性质分析[J]. 食品工业科技, 2021, 42(16): 138-146.LIU Xin, CHEN Xiangyu, GUO Rui, et al. Process optimization of ultrasound-assisted enzyme extraction of Biluochun polysaccharide and its separation, purification and property analysis[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(16): 138-146.
[11] 杨许花, 张竞文, 刘红海, 等. 藏柳茶多糖的提取、结构解析及抗氧化活性分析[J]. 现代食品科技, 2022, 38(12): 318-328.YANG Xuhua, ZHANG Jingwen, LIU Honghai, et al. Extraction,structure, and antioxidant activity analysis of polysaccharides from Sibiraea angustata[J]. Modern Food Science and Technology, 2022,38(12): 318-328.
[12] 张玲赫, 谢浩, 努尔买买提. 微波辅助低共熔溶剂提取新疆野生樱桃李多糖工艺及抗氧化、抑菌活性分析[J]. 食品工业科技,2025, 46(10): 228-236.ZHANG Linghe, XIE Hao, NUER Maimaiti. Microwave-assisted deep eutectic solvent extraction of Xinjiang wild Prunus cerasifera Ehrh. polysaccharides and analysis of its antioxidant and antibacterial activities[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025,46(10): 228-236.
[13] 杨龙宇, 李虎, 许鹏飞, 等. 夏秋季‘石佛翠’茶树鲜叶多糖提取、分离纯化与抗氧化活性研究[J]. 茶叶学报, 2023, 64(6): 26-36.YANG Longyu, LI Hu, XU Pengfei, et al. Extraction, separation,purification, and antioxidant activity of polysaccharides in summer and autumn Shifocui tea[J]. Acta Tea Sinica, 2023, 64(6): 26-36.
[14] 陈燕云, 平华, 高媛, 等. 黍稷麸皮多糖分离纯化、结构表征及抑菌活性分析[J]. 食品工业科技, 2024, 45(10): 1-7.CHEN Yanyun, PING Hua, GAO Yuan, et al. Isolation, purification, structure characterization and antibacterial activity of polysaccharides from proso millet bran[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(10): 1-7.
[15] 钱荣, 安佳鑫, 续晓琪, 等. 黑果枸杞多糖结构表征及对乙醇诱导胃黏膜上皮细胞损伤的影响[J]. 食品科学, 2024, 45(9): 109-115.QIAN Rong, AN Jiaxin, XU Xiaoqi, et al. Structural characterization of a water-soluble polysaccharide from Lycium ruthenicum Murr. fruits and its protective effect on ethanol-induced damage in GES-1 cells[J]. Food Science, 2024, 45(9): 109-115.
[16] 陈衍真, 满文娟, 程雷娜, 等. 响应面法优化肉苁蓉多糖提取液的脱色工艺及其抗氧化活性研究[J]. 食品安全质量检测学报,2025, 16(5): 94-103.CHEN Yanzhen, MAN Wenjuan, CHENG Leina, et al. Optimization of decolorization process and antioxidant activity of Cistanche deserticola polysaccharide extract by response surface methodology[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2025, 16(5): 94-103.
[17] 沈晓静, 袁彪, 郭毅, 等. 普洱茶多糖结构及抗氧化活性的比较研究[J]. 粮食与油脂, 2024, 37(8): 117-121.SHEN Xiaojing, YUAN Biao, GUO Yi, et al. Comparative study on structure and antioxidant activity of polysaccharides from Pu-erh tea[J]. Cereals & Oils, 2024, 37(8): 117-121.
[18] DONG Z, ZHANG M M, LI H X, et al. Structural characterization and immunomodulatory activity of a novel polysaccharide from Pueraria lobata (Willd.) Ohwi root[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 154: 1556-1564.
[19] GU J Y, LI Q W, LIU J, et al. Ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Auricularia auricula and effects of its acid hydrolysate on the biological function of Caenorhabditis elegans[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 167: 423-433.
[20] 徐珊, 谢海, 李敏妮, 等. 黄大茶多糖的结构表征及其对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用[J]. 食品工业科技, 2025, 46(8): 67-75.XU Shan, XIE Hai, LI Minni, et al. Structural characterization of large yellow tea polysaccharides and its inhibitory effects on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(8): 67-75.
[21] WEN J, HUANG R J, LI S, et al. Polysaccharides from sea buckthorn-Ultrasound-assisted enzymatic extraction, purification, structural characterization, and antioxidant activity analysis[J]. Food Chemistry, 2025, 26: 102265.
[22] 陈丽, 陆安霞, 刘飞, 等. 茶多糖结构特征研究进展[J]. 食品科学, 2022, 43(17): 389-397.CHEN Li, LU Anxia, LIU Fei, et al. Progress in research on the structural characteristics of tea polysaccharides[J]. Food Science,2022, 43(17): 389-397.
[23] 彭紫君, 林润, 李泓杭, 等. 单丛茶多糖的表征及其体外降糖降脂活性研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2024, 15(7): 283-288.PENG Zijun, LIN Run, LI Honghang, et al. Characterization of Dancong tea polysaccharide and its in vitro hypoglycemic and lipidlowering activity[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2024, 15(7):283-288.
[24] 钟思彦, 邹波, 吴继军, 等. 黄皮多糖结构表征及抗氧化与益生活性研究[J]. 食品与发酵工业, 2025, 51(3): 234-242.ZHONG Siyan, ZOU Bo, WU Jijun, et al. Structural characterization, antioxidant, and prebiotic activity of wampee polysaccharides[J]. Food and Fermentation Industries, 2025, 51(3): 234-242.
[25] GU H F, LIANG L, ZHU X P, et al. Optimization of enzymatic extraction, characterization and bioactivities of Se-polysaccharides from Se-enriched Lentinus edodes[J]. Food Bioscience, 2023, 51:102346.
[26] 阿衣吐逊·阿布都外力, 宋年年, 易宇欣, 等. 西伯利亚白刺果实多糖的结构表征及功能特性[J]. 现代食品科技, 2024, 40(10):200-207.AYITUXUN Abuduwaili, SONG Niannian, YI Yuxin, et al. Structural characterization and functional properties of the polysaccharides from the fruits of Nitraria sibirica Pall[J]. Modern Food Science and Technology, 2024, 40(10): 200-207.