枸杞子亦名白刺、狗奶子，含有枸杞子多糖、天然黄酮类化合物、枸杞甜菜碱、枸杞色素、蛋白质类等[1-3]。枸杞子具有抗癌、保护肝脏、降血压与降血糖、抗氧化等功效[4-6]。许多研究证实枸杞子中的多糖是其生理和药理活性的主要成分之一，已有研究表明枸杞子中的多糖组成包括半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、木糖、葡萄糖醛酸等[7-9]。目前枸杞子多糖的提取包括热水浸提[10-11]、超声波辅助提取[12-13]、微波辅助提取[14-15]等方法。由于超声波的空化效应、热效应及机械效应[16-17]，破坏了细胞壁、细胞膜等结构，加快了多糖的扩散速度，具有提取速度快、操作简单、不会破坏多糖的结构及生物活性等优点。黎云龙等[18]研究超声波辅助提取骏枣多糖最佳的工艺条件；Gharibzahedi等[19]的研究表明超声波辅助提取多糖的得率明显优于传统的热水回流提取等方式；Xue等[20]的研究表明超声波处理不会破坏多糖的结构和成分，并且多糖的提取率从传统提取方法的6.23%提高到7.95%。超声辅助提取多糖的方法具有广阔的应用前景。本试验采用单因素试验对超声波辅助提取枸杞子粗多糖的工艺条件进行优化，对超声时间、超声温度、超声功率进行研究，利用响应曲面法优化相关参数，并通过模型预测与验证试验结果，建立参数模型，同时利用吸附、沉淀和相似相容的原理，去除提取液中天然色素、蛋白质和黄酮等杂质，通过低温干燥法获得枸杞子粗多糖，并进一步测定粗多糖对于1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力及其对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞的抑制增殖与迁移作用，探索其抗氧化性能及生物活性，以期为其进一步开发功能性抗氧化食品与保健药品提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞子、纯净水：市售；葡萄糖标准品（色谱纯）、硫酸、苯酚、氢氧化钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、维生素E（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；细胞培养液：上海冠导生物工程有限公司；HCC细胞：上海弘顺生物科技有限公司；无血清培养基（通用型RPMI1640）：深圳中科百抗生物科技有限公司；活性炭：福建元力活性炭股份有限公司。
1.2 仪器与设备
HR1889榨汁机：飞利浦（中国）投资有限公司；Secura213-1CN万分之一分析天平：赛多利斯仪器有限公司；HT-160离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TU-1901 分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；KQ5200DE、KQ400GDV超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；CKX53显微镜：奥林巴斯（中国）有限公司；LC-D6090AB真空干燥箱：浙江力辰仪器科技有限公司；HWS-24水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
干枸杞子→挑选→浸泡→破碎→超声波辅助提取→粗多糖含量测定。
1.3.2 操作要点
1）浸泡：将清洗后的枸杞子与水按料液比1∶10 （g/mL）于60 ℃恒温水浴中浸泡30 min，备用。
2）破碎与提取：使用榨汁机将枸杞子与水混合物破碎处理，置于超声波清洗器中，在一定的温度和超声功率条件下，提取一定时间后，测定提取液中粗多糖的含量。
1.3.3 枸杞子提取液中粗多糖含量的测定
采用硫酸-苯酚法测定样品中的粗多糖含量。精确移取经过超声波辅助提取后的样品1.0 mL于10 mL的具塞比色管中，依次加入新配制的5%苯酚溶液1.0 mL、98%浓硫酸5.0 mL，用去离子水定容至10 mL，静置10 min，置于40 ℃的恒温水浴锅内30 min，取出后置于20 ℃的水浴锅5 min，取出后于490 nm处测定其吸光度，依据葡萄糖标准曲线，计算样品中粗多糖的含量[21]。
1.3.4 超声波辅助提取枸杞子粗多糖单因素试验
1.3.4.1 超声功率对提取液中枸杞子粗多糖含量的影响
按照1.3.1的工艺流程提取枸杞子中的粗多糖，控制超声时间为55 min，超声温度为90 ℃，超声功率分别为80、100、120、140、160、180 W，研究超声功率对提取液中枸杞子粗多糖含量的影响。
1.3.4.2 超声时间对提取液中枸杞子粗多糖含量的影响
按照1.3.1的提取工艺流程提取枸杞子中的粗多糖，控制超声温度为90 ℃，超声功率为160 W，超声时间分别为15、25、35、45、55、65 min，研究超声时间对提取液中枸杞子粗多糖含量的影响。
1.3.4.3 超声温度对提取液中枸杞子粗多糖含量的影响
按照1.3.1的提取工艺流程提取枸杞子中的粗多糖，控制超声时间为55 min，超声功率为160 W，超声温度分别为40、50、60、70、80、90、100 ℃，研究超声温度对提取液中枸杞子粗多糖含量的影响。
1.3.5 超声波辅助提取枸杞子粗多糖条件的优化
以超声时间、超声温度、超声功率为变量因素，以枸杞子粗多糖含量为指标，采用三因素二次通用旋转回归响应面法设计优化超声波提取时间，因素与水平如表1所示。
表1 试验因素与水平
Table1 Factors and levels of test
因素水平A超声时间/minB超声温度/℃C超声功率/W-1.68246.6081.60151.60-150.0085.00155.00055.0090.00160.00160.0095.00165.001.68263.4198.41168.41
1.3.6 枸杞子粗多糖的纯化
由于采用水溶液浸提、超声波辅助提取的方法，枸杞子提取液中含有黄酮类化合物、蛋白质、天然色素等，其中黄酮类化合物由于在不同的酸碱环境中呈现不同的颜色，影响粗多糖的应用。因此，本研究向提取液中加入2.5%的活性炭吸附色素，吸附时间为40 min，吸附完成后于7 000 r/min离心20 min，取其上清液，以除去提取液中的天然色素；将浓度为15%的三氯乙酸溶液倒入上清液中，直至无蛋白质沉淀浑浊产生，低温下静置24 h，7 000 r/min离心10 min，取其上清液，以除去蛋白质杂质。将无水乙醇加入上述处理后的上清液中，由于粗多糖不溶于乙醇溶液，而黄酮类溶于乙醇溶液，控制乙醇的浓度为80%，沉淀12 h，过滤，使用80%乙醇溶液清洗沉淀，重复3次，将沉淀放入真空干燥箱中，40 ℃条件下烘干至恒重[22]，按照葡萄糖标准曲线计算枸杞子粗多糖的含量。
1.3.7 粗多糖体外清除DPPH自由基能力测定
准确配制10.0 mg/mL的粗多糖标准溶液，依次稀释至浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，加入2 mL 0.05 mg/mL DPPH溶液，避光静置30min后测定其吸光度A1，用无水乙醇替代粗多糖溶液测定吸光度为A2，用蒸馏水替代测定吸光度为A3，以同浓度的维生素E乙醇溶液为对照，按照下列公式计算DPPH自由基清除率[23]。
式中：D为DPPH自由基清除率，%；A1为加入粗多糖溶液的吸光度；A2为加入无水乙醇的吸光度；A3为加入蒸馏水的吸光度。
1.3.8 枸杞粗多糖的HCC细胞存活率测定
将枸杞子粗多糖稀释为10、20、40、80、100、120、140 μg/mL，备用。在96 孔板中接入HCC细胞24 孔，同时3 孔仅放入培养液作为空白组。待细胞培养24 h后，将不同浓度的枸杞子粗多糖滴入培养了HCC细胞的格子中，空白组和未处理的对照组滴入同体积的蒸馏水，培养72 h。反应完全后，测定吸光度，通过下列公式计算不同浓度下细胞存活率。
式中：S为细胞存活率，%；As为枸杞子粗多糖处理的吸光度；Ab为纯培养液测定的吸光度；Ac为未处理后测定的吸光度。
1.3.9 枸杞粗多糖的HCC细胞迁移能力测定
将含有5×105 个细胞的2 mL HCC细胞悬液的等分试样接种在6 孔板中，并且在显微镜下观察到细胞覆盖板后，使用200 μL移液器吸头在板上画一条直线。然后，加入2 mL无血清培养基，并将细胞置于5% CO2培养箱中，培养8 h，观察HCC细胞迁移结果。然后使用枸杞粗多糖处理HCC细胞，同上试验方法培养8 h后显微镜下观察HCC细胞迁移结果。
1.4 数据处理
单因素试验数据采用 SPSS 22.00 及 GraphPad Prism 5 软件进行分析处理，结果以平均值±标准差表示，交互作用分析采用Minitab 17.0软件进行分析处理，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示具有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制结果
葡萄糖标准曲线如图1所示。
图1 葡萄糖溶液标准曲线
Fig.1 Standard curve of glucose solution
由图1可知，经回归分析可得标准曲线方程为y=0.008 7x-0.011，R2=0.999 2。
2.2 不同超声功率对枸杞子提取液粗多糖含量的影响
不同超声功率对枸杞子提取液粗多糖含量的影响如图2所示。
图2 超声功率对提取液中粗多糖含量的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic power on crude polysaccharide content in Lycium barbarum extract
由图2可知，随着超声功率的增大，枸杞子提取液中粗多糖的含量迅速增大，这主要也是由于超声波的热作用、机械作用和空化作用促进了粗多糖在水溶液中的扩散，当超声功率大于160 W时，提取液中粗多糖的含量几乎保持不变。因此，选择超声功率160 W为中心点进行后续响应面试验。
2.3 不同超声时间对枸杞子提取液粗多糖含量的影响
不同超声时间对枸杞子提取液粗多糖含量的影响如图3所示。
图3 超声时间对提取液中粗多糖含量的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on crude polysaccharide content in Lycium barbarum extract
由图3可知，随着超声时间的延长，枸杞子提取液中粗多糖的含量迅速增大，这主要是由于超声波的空化和机械作用不断破坏枸杞子细胞壁，使得其内部的粗多糖释放出来，但当超声时间超过55 min时，提取液中粗多糖的含量几乎保持不变。因此，选择超声时间55 min为中心点进行后续响应面试验。
2.4 不同超声温度对枸杞子提取液粗多糖含量的影响
不同超声温度对枸杞子提取液粗多糖含量的影响如图4所示。
图4 超声温度对提取液中粗多糖的含量的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on crude polysaccharide content in Lycium barbarum extract
由图4可知，超声温度的升高使得粗多糖含量迅速增加，但当超声温度超过90 ℃时，由于叠加超声波的热效应，使得粗多糖的结构被破坏，粗多糖的提取物含量迅速降低。因此，选择超声温度90 ℃为中心点进行后续响应面试验。
2.5 响应曲面优化试验设计结果
以提取液中粗多糖含量为指标，采用响应曲面法设计优化超声时间、超声温度、超声功率，结果如表2所示。
表2 响应面试验结果
Table2 Results of response surface experiment
试验号150.0085.00155.000.560660.0085.00165.000.592946.6090.00160.000.527 A超声B超声C超声粗多糖含量/时间/min温度/℃功率/W（mg/mL）260.0085.00155.000.580350.0095.00155.000.448460.0095.00155.000.428550.0085.00165.000.590750.0095.00165.000.406860.0095.00165.000.3961063.4190.00160.000.6091155.0081.60160.000.5541255.0098.41160.000.2851355.0090.00151.600.5811455.0090.00168.410.6081555.0090.00160.000.6021655.0090.00160.000.6061755.0090.00160.000.604
由表2可知，超声时间、超声温度、超声功率3 个处理条件间存在相互作用，利用Minitab 17.0统计分析软件进一步分析超声时间、超声温度、超声功率的交互作用对粗多糖含量的影响，结果如图5～图10所示。
图5 超声时间和超声温度等值线图
Fig.5 Contour map of ultrasonic time and ultrasonic temperature
图6 超声时间和超声功率等值线图
Fig.6 Contour map of ultrasonic time and ultrasonic power
图7 超声温度和超声功率等值线图
Fig.7 Contour map of ultrasonic temperature and ultrasonic
图8 超声时间和超声温度交互作用图
Fig.8 Interaction diagram between ultrasound time and ultrasound temperature
图9 超声功率和超声温度交互作用图
Fig.9 Interaction diagram between ultrasound power and ultrasound temperature
图10 超声功率和超声时间交互作用图
Fig.10 Interaction diagram of ultrasound power and ultrasound time
由图5～图10可知，超声温度对粗多糖含量增长作用最为显著，超声时间次之，超声功率的作用最弱。
利用二次旋转回归拟合粗多糖含量与超声时间、超声温度、超声功率的定量数学关系为Z=-41.7+0.104 6A+0.612 2B+0.157 2C-0.000 690A2-0.002 843B2-0.000 315C2-0.000 305AB -0.000 005AC-0.000 625BC，R2=0.945 1，对回归方程进行统计学检验，其结果如表3所示。
表3 回归方程准确性的检验结果
Table3 Accuracy detection results of regression equation
来源自由度校正平方和校正均方F值P值回归90.150 7250.016 74731.590.00
由表3可知，F值与P值分别符合统计学特性，回归方程拟合比较准确。
由Minitab17.0软件进一步分析可知，超声时间的最优值为57.3 min，超声温度的最优值为86.5 ℃，超声功率的最优值为164 W。按照最优工艺条件进行提取，并进行粗多糖含量的测定，实际粗多糖含量为（0.631 6±0.002 6） mg/mL，与理论值（0.636 4 mg/mL）基本相一致，经过上述1.3.6步骤纯化后粗多糖含量为（29.42±2.15）%。
2.6 粗多糖体外清除DPPH自由基结果
粗多糖与维生素E清除DPPH自由基的能力如图11所示。
图11 枸杞子多糖对DPPH自由基的清除能力
Fig.11 DPPH free radical scavenging ability of Lycium barbarum polysaccharides
由图11可知，同浓度的枸杞子粗多糖对DPPH自由基清除能力明显优于维生素E，枸杞子多糖清除DPPH自由基的能力随着其浓度的增加而增大，浓度高于2.5 mg/mL时，其DPPH自由基清除率变化不大，DPPH自由基清除率达到80%以上，表明枸杞子粗多糖具有很强的抗氧化活性，可作为抗氧化剂应用于功能性食品中。
2.7 枸杞粗多糖对HCC细胞存活率的影响结果
枸杞子粗多糖对HCC细胞存活率的影响如图12所示。
图12 枸杞子粗多糖含量对HCC细胞存活率的影响
Fig.12 Effect of Lycium barbarum crude polysaccharide content on HCC cell survival rate
由图12可知，在枸杞子粗多糖浓度范围为10～140 μg/mL时，随着枸杞子粗多糖浓度的增高，HCC细胞存活率逐渐降低，当枸杞子粗多糖浓度达到140 μg/mL，HCC细胞存活率仅为44.4%，且同一浓度的试验结果精密性高，重复性好，说明枸杞子粗多糖对于HCC细胞的抑制能力稳定。
2.8 枸杞粗多糖对HCC细胞迁移抑制作用结果
枸杞子粗多糖对HCC细胞迁移抑制作用结果如图13所示。
图13 枸杞子粗多糖对HCC细胞迁移的抑制作用照片
Fig.13 Images of the inhibitory effect of Lycium barbarum crude polysaccharides on HCC cell migration
由图13可知，HCC细胞无粗多糖提取液抑制自然迁移时，8 h后细胞自然生长至彼此间几乎完全接触；通过枸杞子粗多糖提取液进行抑制，8 h后细胞生长划痕依旧明显，划痕两边模糊，且中间有些许细胞群，说明枸杞子粗多糖对于HCC细胞的迁移有着明显的抑制作用。
3 结论
利用超声波辅助提取工艺制备枸杞子粗多糖提取液，采用单因素试验研究了超声时间、超声温度、超声功率与粗多糖含量的关系。在此基础上，通过响应面试验优化枸杞子粗多糖的最佳提取条件，获得了提取液粗多糖含量与超声时间、超声温度与超声功率的交互作用关系，最佳提取工艺为超声时间57.3 min、超声温度86.5 ℃、超声功率164 W，在此条件下，提取液粗多糖含量为（0.631 6±0.002 6） mg/mL。利用吸附、沉淀和相似相容的原理，去除了提取液中天然色素、蛋白质和黄酮等杂质，通过低温干燥法获得了枸杞子粗多糖，纯化后粗多糖的含量为（29.42±2.15）%，同浓度的枸杞子粗多糖对DPPH自由基清除能力明显优于维生素E，枸杞子粗多糖清除DPPH自由基的能力随着其浓度的增加而增大，浓度高于2.5 mg/mL时，其DPPH自由基的清除率变化不大，DPPH自由基清除率达到80%以上。细胞实验结果表明，随着枸杞子粗多糖浓度的增加，HCC细胞的存活率逐渐降低，当枸杞子粗多糖的浓度达到140 μg/mL，HCC细胞存活率仅为44.4%，枸杞子粗多糖有抑制HCC细胞存活的能力，划痕实验结果表明枸杞子粗多糖提取液对于HCC细胞具有良好的抑制转移能力。本研究为进一步开发枸杞多糖功能性抗氧化及生物活性药物相关产品提供理论基础。
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