1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，可抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，从而减少肠道对葡萄糖的吸收，进而降低餐后血糖峰值[1-2]，其降血糖的作用类似阿卡波糖，是一种安全性良好的天然生物制剂[3]。近年来DNJ在食品和医药领域受到广泛关注，尤其在调节糖代谢及抗糖尿病、抗病毒等方面具有很大的应用潜力。目前发现的植物和微生物中，桑树的DNJ含量最高[4]，桑树资源是DNJ产业化开发的主要原材料。现有研究大多从桑叶中提取DNJ，但也有研究发现桑枝皮DNJ含量远大于桑叶[5]，具有很高的提取价值。桑枝皮DNJ提取物可用来制备治疗糖尿病、癌症、肥胖症和艾滋病的药物和保健食品[6]。降血糖天然药物“桑枝总生物碱片”发挥降血糖作用的主要成分即为DNJ[7]。
常见的DNJ提取方法有有机溶剂提取[8]、酸提取[9]、酶法提取[10]等。传统提取方法提取率较低，而随着生物酶及超声技术的发展[11]，多种方法组合开始逐渐应用于各种天然活性物质的提取。桑枝皮富含纤维素、果胶等，因此，将纤维素酶和果胶酶复合后对桑枝皮进行破壁处理，比单一酶可以进一步提高桑枝皮细胞壁和细胞膜的通透性[12]，加快细胞中DNJ的溶出。DNJ易溶于甲醇、乙醇、水等极性溶剂[7]。其中乙醇安全性好、无污染，可以减少提取过程中的杂质干扰且绿色环保，极大地提升提取效率。因此可选择乙醇作为溶剂。目前最常用的辅助提取方法为超声辅助提取法，该方法较为成熟稳定，提取效率高。
本文以桑枝皮为提取材料，采用复合酶（纤维素酶和果胶酶）协同超声辅助乙醇法提取1-脱氧野尻霉素，以期为桑枝皮的DNJ提取和加工应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
桑枝皮：采自陕西省榆林市林科所农业示范园桑树种质资源圃内，采集树种为吴堡桑，采集时间为2023年7月29日。样品清洗后，105 ℃杀青5 min，70 ℃烘干至恒重，粉碎后过60 目筛，储存至-20 ℃冰箱中备用。
1.1.2 试剂
1-脱氧野尻霉素标准品（纯度≥98%）：北方伟业计量集团；芴甲氧羰酰氯（纯度≥98.0%）：山东西亚化学有限公司；甘氨酸（纯度99%）、纤维素酶（400 U/mg）、果胶酶（50 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
UltiMate3000高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；160A离心机：北京白洋医疗器械有限公司；Scientz-1500E超声波提取仪：宁波新芝生物科技有限公司；Me204 万分之一电子精密天平：梅特勒托利多科技（中国）有限公司；MS3 digital数显型涡旋混合器：德国IKA公司；S-476水浴锅：天津泰斯特检测有限公司；SG2 pH测定仪：梅特勒托利多科技（中国）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计
参考纤维素酶的最适pH值范围4.0～5.5，最适作用温度40～60 ℃；果胶酶最适pH值范围3.0～6.0，作用温度10～55 ℃，分别考察复合酶添加质量比（纤维素酶∶果胶酶分别为1∶4、3∶7、2∶3、1∶1、3∶2、7∶3、4∶1）、复合酶质量浓度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）、乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、超声温度（20、30、40、50、60 ℃）对DNJ提取率的影响。
在单因素试验结果的基础上，利用Design Expert 13.0软件设计响应面试验方案。依据Box-Behnken的试验设计原理[8]，以DNJ提取率为响应值，选择提取过程中的主要影响因素复合酶质量浓度、超声时间、乙醇体积分数作为变量，根据Box-Behnken试验设计三因素三水平的响应面试验，共17组试验，其中的12组为析因试验，其余5组试验为中心点试验。响应面因素水平见表1。
表1 DNJ提取工艺的Box-Behnken试验因素水平
Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for DNJ extraction process
水平04.06020因素A复合酶质量浓度/（mg/mL）B乙醇体积分数/%C超声时间/min-13.0501015.07030
1.3.2 提取工艺
精密称取试样0.50 g，加入25 mL提取液后涡旋混匀，调节pH值，在不同超声温度、超声时间下酶解，8 000 r/min离心8 min后取上清液，沉淀重复提取1 次，合并上清液，定容至50 mL。然后在95 ℃下灭活5 min，冷却后测定DNJ提取率。每组重复3次。
提取液配制：将纤维素酶和果胶酶按一定质量比混匀后，加入一定体积分数的乙醇溶液，配制成不同质量浓度的复合酶乙醇提取液。
1.3.3 DNJ浓度测定及提取率的计算
DNJ浓度的测定参考GB/T 40642—2021《桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素的检测 高效液相色谱法》[13]并略做修改。色谱条件：流动相为乙腈-0.1%乙酸溶液（体积比40∶60）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。以DNJ标准品溶液浓度（mg/mL）为横坐标、色谱峰的峰面积为纵坐标进行线性回归分析，得到线性回归方程为y=0.04+67.76x，相关系数R2=0.999 7，表明DNJ浓度在0.005～0.080 mg/mL范围内线性关系良好。DNJ提取率的计算公式如下。
式中：X为DNJ提取率，%；c为样品最终测得浓度，mg/mL；V为样品制备最终提取体积，mL；m为样品质量，mg。
1.4 数据处理
使用Excel 2019对数据进行处理，使用SPSS 26.0进行单因素方差分析，使用Origin 23.0软件作图。用Design Expert 13.0进行响应面试验分析。
2 结果与分析
2.1 提取条件对DNJ提取率的影响
2.1.1 纤维素酶和果胶酶质量比对DNJ提取率的影响
果胶酶可以水解细胞壁之间的果胶成分，从而破坏细胞壁，纤维素酶能有效降解细胞壁主骨架[14-15]。纤维素酶和果胶酶质量比对DNJ提取率的影响见图1。
图1 纤维素酶和果胶酶质量比对DNJ提取率的影响
Fig.1 Effect of cellulase-to-pectinase mass ratio on DNJ extraction yield
由图1可知，随着纤维素酶添加量增加，DNJ提取率先升高后降低。当纤维素酶和果胶酶的质量比为1∶1时，DNJ提取率最高，达到0.713%，继续增加纤维素酶的添加量，DNJ提取率下降。纤维素酶和果胶酶的协同作用能显著提升细胞壁破壁效率[16]。当两种酶质量比平衡（1∶1）时协同作用发挥最好。而当纤维素酶的添加量过高时，不利于细胞壁的降解[17]。
2.1.2 复合酶质量浓度对DNJ提取率的影响
复合酶质量浓度对DNJ提取率的影响见图2。
图2 复合酶质量浓度对DNJ提取率的影响
Fig.2 Effect of enzyme complex mass concentration on DNJ extraction yield
由图2可知，当复合酶质量浓度从1.0 mg/mL升至4.0 mg/mL时，DNJ提取率显著升高；当复合酶质量浓度达到4.0 mg/mL时，DNJ提取率最高，为0.793%，与复合酶质量浓度为1.0～3.0 mg/mL时的提取率差异显著（P＜0.05）。继续增加复合酶的质量浓度，DNJ提取率下降。这可能是因为随着复合酶质量浓度的增大，复合酶与反应底物的接触和碰撞程度开始加强，加速了桑枝皮细胞壁的酶解速度，使细胞内DNJ的溶出率增大[18]。当复合酶质量浓度过高时，酶解反应已趋于饱和状态，使得DNJ提取率略微下降。
2.1.3 乙醇体积分数对DNJ提取率的影响
乙醇体积分数对DNJ提取率的影响见图3。
图3 乙醇体积分数对DNJ提取率的影响
Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on DNJ extraction yield
由图3可知，随着乙醇体积分数的增大，DNJ提取率先升高后降低。当乙醇体积分数达到60%时，DNJ提取率最高，为0.711%，与其他乙醇体积分数的提取率差异显著（P＜0.05）。DNJ是一种极性较强的生物碱，分子中含多个羟基，易溶于极性溶剂。提取液中乙醇浓度过高时容易溶出脂溶性杂质，乙醇浓度过低时则易溶出水溶性杂质（如多糖、果胶等），都会影响DNJ的提取率[7，19-20]。当乙醇体积分数为60%时，溶剂和提取液极性达到平衡[21]，杂质的影响最小，此时DNJ的溶出度最大。
2.1.4 pH值对DNJ提取率的影响
pH值对DNJ提取率的影响见图4。
图4 pH值对DNJ提取率的影响
Fig.4 Effect of pH on DNJ extraction yield
图4可知，随着pH值的增大，DNJ提取率明显降低。pH值在3.0时DNJ提取率最高，达0.730%，与其他pH值的DNJ提取率差异显著（P＜0.05）。这可能是因为DNJ在酸性条件下更稳定，低pH值可能减少DNJ氧化或降解，从而提高了提取率[22]。而且酸性条件也可以促进细胞壁的溶解，与酶解反应产生协同作用，所以在pH3.0时DNJ提取率最佳。
2.1.5 超声时间对DNJ提取率的影响
超声时间对DNJ提取率的影响见图5。
图5 超声时间对DNJ提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasound time on DNJ extraction yield
由图5可知，在超声时间为10～20 min时，DNJ的提取率升高。随着超声时间继续延长，DNJ的提取率反而下降。20 min为最佳提取超声时间。短时间超声可以破损细胞壁，使酶与底物快速结合，加速果胶链断裂，提高DNJ提取率[23]。长时间的超声可能增加其他杂质的溶出量，降低产物中DNJ的纯度[24]。
2.1.6 超声温度对DNJ提取率的影响
超声温度对DNJ提取率的影响见图6。
图6 超声温度对DNJ提取率的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on DNJ extraction yield
由图6可知，超声温度为20～30 ℃时，DNJ的提取率升高。随着超声温度的增加，DNJ的提取率下降，但在50 ℃时提取率又升高。在酶解过程中，果胶酶的作用温度范围为10～55 ℃，最适温度是50 ℃；纤维素酶的最适温度范围为40～60 ℃。在20～60 ℃范围内，超声温度对DNJ提取率的影响不显著（P＞0.05），变化趋势不明显。考虑到60 ℃可能会使果胶酶的活性受到影响，且30 ℃时DNJ的提取率大于60 ℃时DNJ的提取率，因此选择最佳超声温度为30 ℃。低温超声可以增强底物扩散，提升酶和底物的结合效率，提高DNJ提取率。
2.2 提取条件的优化
2.2.1 响应面结果与分析
Box-Behnken响应面法试验结果见表2。
表2 Box-Behnken响应面法试验结果
Table2 Experimental results of Box-Behnken response surface design
编号13.050200.78225.050200.80333.070200.77553.060100.81265.060100.82194.050100.781104.070100.792114.050300.811124.070300.735 A复合酶质量B乙醇C超声DNJ浓度/（mg/mL）体积分数/%时间/min提取率/%45.070200.76973.060300.79485.060300.805134.060200.891144.060200.887154.060200.876164.060200.882174.060200.884
利用Design Expert 13.0软件分析表2的试验数据，以DNJ提取率（Y）为响应值，对复合酶质量浓度（A）、乙醇体积分数（B）、超声时间（C）3 个因素进行二次回归拟合得到方程：Y=0.884 0+0.004 4A-0.013 2B-0.007 6C-0.006 8AB+0.000 5AC-0.002 18BC-0.036 8A2-0.065 0B2-0.039 2C2。
响应面回归模型方差分析见表3。
表3 响应面回归模型方差分析
Table3 Analysis of variance for the response surface regression model
项目平方和自由度均方F值P值模型0.037 290.004 1139.76＜0.000 1 A0.000 210.000 25.170.057 1 B0.001 410.001 447.440.000 2 C0.000 510.000 515.710.005 4 AB0.000 210.000 26.160.042 1 AC0.000 00110.000 0010.03380.859 4 BC0.001 910.001 963.91＜0.000 1 A 20.005 710.005 7192.07＜0.000 1 B20.017 810.017 8600.85＜0.000 1 C20.006 510.006 5219.09＜0.000 1残差0.000 270.000 0失拟项0.000 130.000 00.859 80.530 7净误差0.000 140.000 0总离差0.037 416
由表3可知，构建的回归模型P＜0.000 1，表明模型达到高度显著水平，可用于预测DNJ提取工艺。失拟项P=0.530 7＞0.05，不显著，说明试验误差小；决定系数是拟合程度的衡量指标[25]，决定系数R2=0.994 5＞0.95，校正决定系数R2Adj=0.987 4＞0.9，均表明该模型可以准确预测得率与因素之间的关系；变异系数（coefficient of variation，CV）=0.665 5%＜5%，进一步证实模型稳定可靠。从各因素对DNJ提取率的影响来看，二次项A2、B2、C2以及交互项BC影响高度显著（P＜0.000 1）；一次项B与C的影响极显著（P＜0.01）；交互项AB的影响达到了显著水平（P＜0.05）。而一次项A与交互项AC的影响并不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对试验结果影响大小依次为乙醇体积分数（B）＞超声时间（C）＞复合酶质量浓度（A）。
2.2.2 响应面图分析
曲面图可直观地表现2 个因素同时对响应值的影响，曲面的坡度越大，表明各因素的改变对响应值的影响越大；曲面坡度越小，表明各因素的改变对响应值的影响越小[26]。复合酶质量浓度和乙醇体积分数对DNJ提取率的影响见图7。
图7 复合酶质量浓度和乙醇体积分数对DNJ提取率的影响
Fig.7 Interactive effects of enzyme complex mass concentration and ethanol volume fraction on DNJ extraction yield
由图7可知，在复合酶质量浓度3.0～5.0 mg/mL范围内，DNJ提取率变化不大；在乙醇体积分数50%～70%变化范围内，DNJ提取率先升高后降低，且响应曲面坡度较陡峭，呈马鞍形。表明复合酶质量浓度（A）和乙醇体积分数（B）有较强交互作用，对DNJ提取率的影响显著。
复合酶质量浓度和超声时间对DNJ提取率的影响见图8。
图8 复合酶质量浓度和超声时间对DNJ提取率的影响
Fig.8 Interactive effects of enzyme complex mass concentration and ultrasound time on DNJ extraction yield
由图8可知，在复合酶质量浓度3～5 mg/mL范围内和超声时间10～30 min范围内，DNJ提取率变化不大，且复合酶质量浓度和超声时间的响应曲面坡度平缓，表明复合酶质量浓度（A）和超声时间（C）变化对DNJ提取率的影响不明显，A与C之间的交互作用对DNJ提取率的影响力未达显著水平。从响应面图的陡峭程度来看，超声时间对DNJ提取率的影响比复合酶质量浓度更明显。
乙醇体积分数和超声时间对DNJ提取率的影响见图9。
图9 乙醇体积分数和超声时间对DNJ提取率的影响
Fig.9 Interactive effects of ethanol volume fraction and ultrasound time on DNJ extraction yield
由图9可知，响应面坡度陡峭，这一特征直观地反映出乙醇体积分数（B）与超声时间（C）之间存在着极为强烈的交互作用，这种交互作用对DNJ提取率产生的影响极为显著。进一步观察响应面的表面坡度能够发现，在二者的交互影响过程中，乙醇体积分数对DNJ提取率的影响比超声时间更明显。
2.2.3 最佳提取工艺条件验证
利用Design Expert 13.0软件对试验数据解析，经系统优化后获得DNJ的最优提取参数组合：超声时间17.8 min，乙醇体积分数64.6%，复合酶质量浓度4.82 mg/mL。在此条件下DNJ提取率的理论值为0.845%。
为验证模型预测可靠性，按纤维素酶与果胶酶质量比为1∶1、超声温度为30 ℃、pH值为3.0、超声时间为17.8 min、乙醇体积分数为64.6%、复合酶添加浓度为4.82 mg/mL的条件进行验证试验。经测定，DNJ实际提取率为0.820%，与理论预测值的绝对误差为0.025%，表明所建立的回归模型对桑枝皮中DNJ提取工艺具有良好的优化效果。
3 讨论与结论
王中兴[27]采用超声辅助提取桑枝中的DNJ，得到最佳提取条件为乙醇浓度65%、超声处理时间35 min；曹琳等[28]采用超声法辅助提取桑枝中的DNJ，得到的最佳提取条件为pH2.5、温度65 ℃；陈博伦[29]优化桑叶DNJ提取工艺，得到的最佳提取条件为乙醇体积分数63%、回流温度81 ℃、回流时间1.7 h；王璐等[30]优化超声细胞破碎机辅助低共熔溶剂提取桑叶DNJ，得到超声时间的最优条件为32 min；刘一衡等[31]使用优化超声法辅助提取新疆药桑桑叶总生物碱，提取的优化工艺条件为提取时间20 min、温度60 ℃、乙醇浓度60%。赵翔[10]采用纤维素酶进行桑叶DNJ的提取，确定桑叶DNJ的最佳提取条件为纤维素酶质量浓度3.4 mg/mL、pH3.8。薛婷婷等[32]采用乙醇从新鲜桑叶中提取DNJ，得到最佳提取条件为乙醇体积分数65%、pH3.5、提取温度55 ℃。
可见现有研究DNJ最佳提取条件范围大多集中在超声辅助提取时间20～35 min，乙醇浓度60%～65%，pH3.0～4.0，纤维素酶质量浓度3.4 mg/mL。这些条件与本研究结果相似。
本试验通过单因素试验与Box-Behnken 响应面法优化复合酶（纤维素酶和果胶酶）协同超声辅助乙醇法提取1-脱氧野尻霉素的工艺参数，经过优化得到最佳工艺条件为纤维素酶和果胶酶质量比1∶1、复合酶质量浓度4.82 mg/mL、乙醇体积分数64.6%、提取液pH3.0、超声时间17.8 min、超声温度30 ℃，最终DNJ实际提取率为0.820%。
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