核桃分心木为核桃内核的木质隔膜,俗称核桃夹层、核桃片,为胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)植物坚果的内部干燥木质层,其质量占坚果总质量的4%~5%。该隔膜多呈细薄片状,质地轻脆,表面为棕色或浅棕褐色[1-2]。研究表明,核桃分心木富含多酚[3]、多糖[4]、黄酮类[5]等生物活性成分,其中多酚类物质兼具抗菌、抗衰老、抗辐射等生物活性,且在缓解氧化应激、抑制高分子氧化方面效果显著[6],使其在食品、医药、染料等领域具有重要商业价值[7]。然而,核桃分心木长期以来多被当作废弃物丢弃,造成资源浪费。因此,开展核桃分心木多酚的提取及其抗氧化活性研究,对推动该资源的回收再利用具有重要意义。
当前多酚提取方法主要有有机溶剂萃取、离子沉淀、树脂吸附、超临界CO2萃取及热水提取等[8-9]。其中,有机溶剂萃取法为传统且易实施的技术,基于多酚酚羟基的溶解特性,采用水、乙醇、丙酮等极性溶剂溶解多酚;该类物质在乙酸乙酯中溶解度较高,而不溶于乙醚、氯仿、石油醚等非极性溶剂[10-11]。此方法提取速度快、溶剂易得且低毒,但提取效率偏低,提取过程易受温度、时间等因素影响。离子沉淀法工艺简单、成本低廉,但过滤转移过程中易造成多酚损失,且溶液酸碱度难以调控,可能破坏多酚结构。树脂吸附与超临界CO2萃取技术应用广泛,但前者操作复杂,后者成本较高。超声波辅助提取技术可充分利用声波物理特性,既避免化学反应对活性成分的破坏,又能有效促进多酚溶解与提取,较传统溶剂萃取效率更高。同时,该技术的自动化可控性契合工业发展趋势,为相关研究提供了新方向。
李克香等[12]通过试验证明了核桃分心木多酚提取与超声功率密切相关。许欢欢等[13]利用大孔树脂法和高效液相色谱法对多酚提取工艺进行了研究。程艳刚等[14]采用响应面分析法优化了乙醇逆流萃取核桃分心木中的黄酮总量,提取效率达到64.12 mg/g,与模型预测结果接近。刘静等[15]利用超声辅助法增大了核桃分心木内多酚的提取率,通过条件优化,多酚的得率达到了6.98%。随着超声波提取技术设备的日趋完善,该技术的产业化应用已成为可能。
核桃分心木的提取是近期研究核桃副产品的焦点,其中富含一定比例的多酚类物质。多酚作为植物的次级代谢产物,具有潜在的健康促进作用。目前关于核桃分心木混合物质的结构研究文献较多,但针对多酚的研究还相对不足,缺乏综合和系统的分析[16-18]。在应用层面,核桃分心木的二次产品研究主要集中于速溶茶粉、核桃分心木茶包、染料辅助原料等,尽管其基础功效已知,但在单一物质功效方面的研究成果有限,全面的研究和分析也显不足。因此,本研究以核桃分心木为研究对象,采用超声波技术辅助提取核桃分心木多酚,并分析其体外抗氧化活性,明确核桃分心木多酚的提取规律与抗氧化潜力,以期为该副产物的高值化利用提供理论支撑,同时填补核桃分心木多酚系统性研究的空白。
1.1.1 材料与试剂
新疆和田核桃分心木:市售;福林酚(folin-phenol)试剂(分析纯):天津歆毅翎科技有限公司;没食子酸(纯度≥98%)、2,2-二苯基-1-苦肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)(优级纯):上海源叶生物科技有限公司;95%乙醇溶液、无水碳酸钠(均为分析纯):天津市风船化学试剂科技有限公司;3%过氧化氢分析纯:山东利尔康科技有限公司;硫酸亚铁(分析纯):天津市光复精细化工研究所;水杨酸(分析纯):天津市河北区海晶精细化工研究所。
1.1.2 仪器与设备
粉碎机(SU1415)、100 目筛:赫枫电器有限公司;电子天平(EX124):上海奥豪斯仪器有限公司;超声波清洗器(SN-QX):保定圣峰仪器科技有限公司;低温低速离心机(L530R):湖南湘仪仪器有限公司;紫外可见分光光度计(TU-1080):上海普析分析仪器有限公司。
1.2.1 没食子酸标准溶液的配制
精密称取0.025 g没食子酸,加蒸馏水定容至500 mL,得到没食子酸标准储备液。采用福林酚显色法测定没食子酸浓度[19]:分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL 50 μg/mL没食子酸标准储备液,各加1 mL福林酚试剂摇匀,静置5 min;随后加入2 mL 5%碳酸钠溶液,用蒸馏水定容至刻度,配制成浓度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 μg/mL的没食子酸溶液。将混合液充分摇匀后,置于避光环境中反应1 h。
1.2.2 和田核桃分心木中多酚的提取与测定
精密称取干燥后粉碎过100 目筛的和田核桃分心木粉末 0.5 g,以乙醇为提取溶剂,按预设料液比、乙醇浓度、超声时间及超声温度进行超声波辅助多酚提取。提取后于 3 000 r/min 离心 15 min,收集上清液即为和田核桃分心木多酚提取液,备用。采用福林酚试剂法测定提取液中多酚含量,多酚得率按公式(1)计算。
式中:W为多酚得率,mg/g;C为样品液多酚浓度,mg/mL;V为样品提取液体积,mL;N为稀释倍数;m为样品质量,g。
1.2.3 单因素试验
1.2.3.1 液料比对多酚得率的影响
精确称取0.500 0 g核桃分心木细粉,使用60%乙醇溶液作为溶剂,超声温度保持在30 ℃,超声时间设定为60 min。试验中调整液料比至60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1(mL/g),研究液料比对核桃分心木中多酚得率的影响。
1.2.3.2 乙醇浓度对多酚得率的影响
准确称取0.500 0 g核桃分心木细粉,设置液料比为60∶1(mL/g),采用30 ℃的超声温度和40 min的超声时间,分别使用30%、40%、50%、60%和70%的乙醇作为溶剂,研究不同乙醇浓度对核桃分心木多酚得率的影响。
1.2.3.3 超声时间对多酚得率的影响
准确称取0.500 0 g核桃分心木细粉,设置液料比为60∶1(mL/g)、乙醇浓度为50%,在30 ℃的超声温度下,选择超声时间分别为30、45、60、75、90 min,研究超声时间对核桃分心木多酚得率的影响。
1.2.3.4 超声温度对多酚得率的影响
准确称取0.500 0 g核桃分心木细粉,设置液料比60∶1(mL/g)、乙醇浓度50%、超声时间为60 min,将超声温度分别调节至25、30、35、40、45 ℃,探讨不同超声温度对核桃分心木多酚得率的影响。
1.2.4 响应面试验
在单因素试验的基础上,以提取核桃分心木中的多酚含量作为评价指标,采用中心组合设计(central composite design,CCD),选择液料比(A)、乙醇浓度(B)、超声时间(C)和超声温度(D)作为独立变量,设计四因素三水平的试验方案,旨在优化核桃分心木多酚提取的工艺流程,详见表1。
表1 响应面因素与水平
Table1 Factors and levels of response surface design
因素水平A液料比/B乙醇C超声D超声(mL/g)浓度/%时间/min温度/℃-180∶1304535090∶14060401100∶1507545
1.2.5 测定多酚的抗氧化能力
1.2.5.1 DPPH自由基清除率
基于卢俊[20]、吴书天[21]的研究方法并略作优化。精密称取10 mg DPPH粉末,用95%乙醇溶液定容至100 mL棕色容量瓶中,经超声助溶制备100 mg/L的标准储备液,于2~4 ℃避光冷藏。核桃分心木提取物经95%乙醇溶液梯度稀释后,精密移取稀释核桃分心木提取物2 mL至6 个10 mL棕色容量瓶中,各加2 mL DPPH储备液,混匀避光静置30 min,测定510 nm处吸光度(A1)。样品空白组:取等量提取物溶液,以95%乙醇溶液代替DPPH储备液,同法测定510 nm吸光度(A2);空白对照组:以2 mL 95%乙醇溶液代替提取物,加2mL DPPH储备液,同条件测定吸光度(A0)。通过公式(2)计算DPPH自由基清除率(D,%),经回归分析确定半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。
1.2.5.2 羟自由基清除率
取6 个10 mL棕色试管,分别加入梯度浓度的核桃分心木提取液,依次加入6 mmol/L硫酸亚铁溶液、8 mmol/L水杨酸溶液与8 mmol/L过氧化氢溶液,涡旋混匀后置于37 ℃水浴反应30 min。以蒸馏水校准仪器基线,测定各样品在510 nm处吸光度(A1);样品空白组以蒸馏水替代过氧化氢溶液,取等量提取液同法操作,510 nm处测定吸光度(A2);空白对照组以蒸馏水替代提取液,其余条件不变,测510 nm处吸光度(A0)。按公式(3)计算羟自由基清除率(O,%),并求得IC50值。
利用Design-Expert 12.0.3.0版本进行响应面法设计与分析,各试验组重复3次,结果以平均值表示。
以没食子酸浓度(X)为横坐标,吸光度(Y)为纵坐标绘制没食子酸标准曲线,结果如图1所示。
图1 没食子酸标准曲线图
Fig.1 Gallic acid standard curve
由图1可知,回归方程为Y=0.076 9X-0.010 6,R2=0.994 6,线性关系良好。
2.2.1 液料比对多酚得率的影响
液料比对多酚得率的影响如图2所示。
图2 液料比对多酚得率的影响
Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on polyphenol yield
由图2可知,液料比在60∶1~90∶1(mL/g)区间内,随着液体比例的提升,核桃分心木多酚得率逐渐上升。然而,当液料比超过90∶1 (mL/g)时,多酚得率反而降低。当液料比为90∶1 (mL/g)时,多酚得率达到最大值,为57.289 3 mg/g。综合考虑,选择液料比为80∶1、90∶1、100∶1 (mL/g)进行后续响应面试验。
2.2.2 乙醇浓度对多酚得率的影响
乙醇浓度对多酚得率的影响如图3所示。
图3 乙醇浓度对核桃分心木多酚得率的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield
由图3可知,随着乙醇浓度的增加,多酚得率先上升至峰值,然后逐渐降低。当乙醇浓度达到40%时,多酚得率达到最高。原因可能是乙醇浓度过高会导致其他醇溶性物质被提取,从而干扰多酚在乙醇溶液中的溶解过程。因此,选择乙醇浓度为30%、40%、50%进行后续响应面试验。
2.2.3 超声时间对多酚得率的影响
超声时间对多酚得率的影响如图4所示。
图4 超声时间对核桃分心木多酚得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield
由图4可知,超声处理60 min得到的多酚得率明显超过其他时间,此时多酚得率达到最高,为44.424 3 mg/g。然而,当超声时间进一步延长时,多酚得率反而下降。原因可能是核桃分心木的细胞结构遭到破坏,导致细胞内部的其他物质释放;或者是过长的处理时间导致多酚成分本身受到损害。综上,选择超声时间为45、60、75 min进行后续响应面试验。
2.2.4 超声温度对多酚得率的影响
超声温度对多酚得率的影响如图5所示。
图5 超声温度对核桃分心木多酚得率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield
由图5可知,多酚得率随着超声温度的升高先上升后下降。当超声温度达到40 ℃时,多酚得率达到峰值,为43.635 5 mg/g。但进一步提高超声温度会导致多酚得率逐渐下降。这是因为在一定温度范围内,升温可以加速多酚分子的扩散速率,促进其溶解度的提高,从而使得多酚得率上升;然而,当超声温度继续升高至一定程度后,高温可能会破坏多酚,导致得率下降。因此,选择超声温度35、40、45 ℃进行后续响应面试验。
2.3.1 响应面试验结果
理论值对比实际值见图6,残差分析结果见图7。
图6 理论值对比实际值
Fig.6 Theoretical values compared to actual values
图7 残差分析图
Fig.7 Residual analysis plot
由图6、图7可知,残差点基本沿正态参考线分布,表明试验残差服从正态分布,模型无系统性误差;预测值与实际值对比图中,数据点均匀分布在对角线两侧,呈现显著的线性关系,说明回归模型的预测值与试验实际值吻合度极高。综上,本研究建立的核桃分心木多酚超声辅助提取工艺响应面模型拟合度良好、预测能力可靠,可用于该提取工艺的分析与优化。
响应面试验结果见表2。
表2 响应面试验结果
Table2 Response surface test results
液料比/乙醇超声超声多酚编号(mL/g)浓度/%时间/min温度/℃得率/%190∶140604066.518 72100∶150453556.675 3380∶130453550.165 9480∶130753551.533 2580∶130754553.283 46100∶130454556.150 77100∶130754559.315 5890∶140604066.437 5990∶140604066.418 257.904 310100∶150454556.504 011100∶13075351290∶140904053.998 61380∶130454552.286 614100∶150753559.315 515100∶150754558.750 81690∶140304049.735 21780∶150754556.131 21890∶140604066.617 81980∶150453550.119 12090∶160604056.750 821110∶140604060.982 954.457 622100∶13045352390∶140605052.379 62490∶140603059.557 12590∶120604059.071 42690∶140604066.634 12780∶150753552.457 32880∶150454550.815 22970∶140604048.933 5
运用Design-Expert 12.0.3.0软件对表2数据进行方差及模型的显著性审查,得到回归方程:Y=66.53+2.77A+0.16B+1.14C-0.039D+0.25AB-0.08AC-0.19AD+0.22BC-0.21BD+0.12CD-2.96A2-2.23B2-3.74C2-2.71D2。
回归模型的方差分析如表3所示。
表3 回归模型的方差分析
Table3 ANOVA of the regression model
C超声时间30.92130.928.210.012 5*AB0.982 310.982 30.260 70.617 6方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型817.321458.3815.5<0.000 1**A液料比107.041107.0428.410.000 1**B乙醇浓度0.611 410.611 40.162 30.693 2 D超声温度0.037 210.037 20.009 90.922 2 AC0.10910.1090.028 90.867 4 AD0.589 810.589 80.156 50.698 3 BC0.794 610.794 60.210 90.653 1 BD0.697 710.697 70.185 20.673 5 CD0.233 310.233 30.061 90.807 1 A2227.971227.9760.51<0.000 1**B2128.561128.5634.12<0.000 1**C2362.341362.3496.17<0.000 1**D2190.781190.7850.64<0.000 1**残差52.75143.77失拟项0.038105.27532.18>0.050 0纯误差50.3440.009 9总误差870.0728
注:*表示影响显著(P<0.05);**表示影响极显著(P<0.01)。
由表3可知,该模型在统计上具有显著性(P值小于0.000 1),失拟项的P值大于0.050 0。校正后的决定系数(R2adj)高达0.878 8,未校正的R2值为0.939 4,表明液料比、乙醇浓度、超声时间与超声温度对多酚得率的解释力约为87.88%。借助该回归模型,该模型可用于有效预测和分析核桃分心木多酚的提取效率。F检验结果显示,在影响多酚得率的4 个变量中,作用大小依次为液料比(A)>超声时间(C)>乙醇浓度(B)>超声温度(D)。响应面分析显示,二次项A2、B2、C2、D2对多酚提取的影响极为显著(P值均小于0.001)。
2.3.2 响应面优化分析
通过观察三维曲面的坡度和等高线的形状,可以评估4 个因素交互作用的强度。如果三维曲面平缓展开,说明这些因素对多酚得率的影响较小;相反,当曲面陡峭时,意味着因素影响显著。等高线接近圆形表明两个因素之间的交互作用不显著,而倾向椭圆形则表明它们之间具有重要的交互效应。
利用响应值的大小,通过响应面的三维曲面图,综合评估液料比(A)、乙醇浓度(B)、超声时间(C)、超声温度(D)4 个因素之间的交互作用对和田核桃分心木多酚得率的影响,结果见图8~图13。
图8 乙醇浓度与液料比对多酚得率的影响
Fig.8 Effect of the interaction between ethanol concentration and liquid-to-material ratio on polyphenol yield
图9 超声时间和液料比对多酚得率的影响
Fig.9 Effect of the interaction between ultrasonic time and liquid-to-material ratio on polyphenol yield
图10 超声温度和液料比对多酚得率的影响
Fig.10 Effect of the interaction between ultrasonic temperature and liquid-to-material ratio on polyphenol yield
图11 超声时间和乙醇浓度对多酚得率的影响
Fig.11 Effect of the interaction between ultrasonic time and ethanol concentration on polyphenol yield
图12 超声温度和乙醇浓度对多酚得率的影响
Fig.12 Effect of the interaction between ultrasonic temperature and ethanol concentration on polyphenol yield
图13 超声温度和超声时间对多酚得率的影响
Fig.13 Effect of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic time on polyphenol yield
由图8~图13可知,尽管所有交互项均未达到统计学显著水平(P> 0.05),但通过F值与均方和的比较可见,AB和BC的效应强度相对更高。这表明AB和BC对多酚得率变异的贡献更大,其交互效应更为突出,与响应面等高线偏离圆形的趋势相呼应。
2.3.3 最佳工艺条件及验证试验
通过响应面法构建的回归分析对模型的方差进行识别后,发现最优的提取条件为液料比94.771∶1(mL/g)、乙醇浓度40.736%、超声时间62.25 min、超声温度39.878 ℃。在上述参数下,多酚得率可达到67.263 mg/g。
为确保操作的可行性,将提取条件微调至液料比95∶1(mL/g)、乙醇浓度41%、超声时间62 min、超声温度40 ℃,并进行3次重复试验。结果显示,多酚平均得率为67.025 mg/g。试验所得的多酚平均得率与模型预测值几乎相同,说明试验结果与预设模型高度吻合,表明试验具有高度的稳定性和精确性。
2.4.1 核桃分心木多酚对DPPH自由基的清除能力
核桃分心木多酚对DPPH自由基的清除能力如图14所示。
图14 核桃分心木多酚对DPPH自由基的清除能力
Fig.14 Scavenging capacity of DPPH free radicals by polyphenols from walnut septa
由图14可知,随着多酚浓度的增加,核桃分心木多酚对DPPH自由基清除率逐渐增强。当多酚浓度达到1.0 g/L时,其DPPH自由基清除率达到70.43%,表明核桃分心木具有较强的抗氧化能力。计算得出DPPH自由基的IC50值为0.5 g/L。
2.4.2 核桃分心木多酚对羟自由基的清除能力
核桃分心木多酚对羟自由基的清除能力如图15所示。
图15 核桃分心木多酚对羟自由基的清除能力
Fig.15 Scavenging capacity of hydroxyl radicals by polyphenols from walnut septa
由图15可知,核桃分心木多酚对羟自由基的清除作用随着其浓度的增加而增强。当核桃分心木多酚的浓度达到1.0 g/L时,其羟自由基清除率可达到14.79%。计算得出羟自由基的IC50值为0.56 g/L,这表明核桃分心木多酚对羟自由基具有一定的清除作用。
本研究以核桃分心木为研究对象,采用超声波技术辅助提取核桃分心木多酚,分析其体外抗氧化活性,明确核桃分心木多酚的提取规律与抗氧化潜力。结果表明,在提取新疆和田核桃分心木多酚时,最适宜的工艺条件为液料比95∶1(mL/g)、乙醇浓度41%、超声时间62 min、超声温度40 ℃。通过试验验证,所得核桃分心木的多酚得率为67.025 mg/g,与模型预测结果极为接近,证明了所用回归模型的可信度。体外抗氧化效能评估显示,1.0 g/L浓度的核桃分心木多酚提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为70.43%和14.79%,表现出较好的抗氧化活性。
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Process Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Total Polyphenols from Hetian Walnut Septa