金耳（Naematelia aurantialba）属真菌类，是一种腐生性食用菌[1-2]，野生金耳通常生长在木材上，尤其在枯木或腐木上[3]，广泛分布于亚洲的中国、日本、韩国，欧洲的法国、德国以及北美的美国、加拿大等地[4-5]，这种广泛的分布可能与金耳较强的环境适应能力有关。从形态学特征看，金耳子实体呈金黄色耳状或脑状，质地为胶质[6]，这种独特的形态特征使其在野生环境中易于辨认，也成为其商品价值的重要组成部分。近年来，金耳因其独特的营养价值和药用潜力，受到广泛关注。金耳营养丰富、味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、多糖、膳食纤维及维生素等多种营养成分，具有广泛的药用价值及食用价值，具有多种生物活性。金耳多糖能激活巨噬细胞，促进细胞因子分泌，增强机体免疫力；金耳中含有的多酚类物质能有效清除自由基，减轻氧化应激损伤，从而达到抗氧化功效；金耳可降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，从而降低血脂；金耳中的膳食纤维可促进益生菌生长，改善肠道微生态。由此可见，金耳在功能食品、保健品及医药领域具有很高的开发价值和广泛的应用前景[7-10]。特别是在当前大健康产业快速发展的背景下，金耳产品的开发受到越来越多的关注。近年来，随着市场需求的快速增长，金耳的人工种植技术逐渐成熟，目前广泛分布在云南、山东、河北等地，且主要采用椴木栽培及袋料栽培[11-12]。然而金耳的生产仍面临菌种退化、生产周期长、产量不稳定等问题，这些问题的解决亟需从基础研究入手。碳源和氮源作为微生物生长的最基本营养要素，直接影响菌丝的代谢活性、生物量积累和次级代谢产物合成。金耳对不同碳源、氮源的利用效率存在显著差异，这种差异往往决定了金耳菌丝的生长速率和形态特征。
近几十年，针对金耳的研究主要聚焦在金耳栽培技术优化、金耳液体发酵制种及金耳活性物质的提取与功能分析等方面[13-15]，而关于碳源、氮源对金耳菌丝生长的影响尚未见系统报道，碳源和氮源是影响真菌菌丝生长的关键因素。因此，本研究从氯霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基（chloramphenicol potato dextrose agar，cPDA）平板生长情况、菌丝生长速率、显微形态下菌丝分枝情况及气生菌丝直径入手，系统研究金耳菌丝对不同碳源、氮源的响应，以期为金耳菌种培养提供最优营养方案，助力解决产业中的菌种退化和生长缓慢问题，建立金耳菌丝生长的多指标评价体系，为金耳的高效培养及工业化生产等研究提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器
1.1.1 供试菌株与试剂
金耳菌株：国家食用菌种质资源库（黑龙江）。葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、D-阿拉伯糖、甘露醇、酵母粉、尿素、硫酸铵、蛋白胨、氯化铵、草酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司。
cPDA：称取200 g去皮的马铃薯块于沸水中煮30 min，取滤液，加入葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、琼脂20 g，用水补足至1 000 mL。
1.1.2 仪器与设备
GL85SA高压蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；C22-ID31苏泊尔电磁炉：浙江苏泊尔股份有限公司；BCV-3S1超净工作台：苏州佳宝净化工程设备有限公司；BSA223S电子分析天平：深圳市衡通伟业科技仪器有限公司；ZQTY-200恒温培养摇床：上海知楚仪器有限公司；BPC-250F生化培养箱：青岛精诚仪器仪表有限公司等；605A电子数显卡尺：哈尔滨量具刃具集团有限公司；BX53光学显微镜：日本奥林巴斯公司；XQ-256打孔器：日本Nobuo Tsuchiya公司。
1.2 试验方法
1.2.1 不同碳源条件对金耳菌丝生长的影响
碳源以葡萄糖为对照组（CK），以蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、D-阿拉伯糖及甘露醇为试验组制作不同碳源的培养基，将金耳菌株于cPDA平板上活化，将活化的菌株用直径1.0 cm的打孔器打成均匀小孔，接入不同碳源的培养基，于25 ℃恒温培养摇床中培养，每个处理3 个重复，观察不同处理下的菌株生长情况[16-17]。每隔24 h采用十字交叉法测量菌落直径，计算该菌株平均生长速率，每隔48 h平板正反面拍照1次，并在光学显微镜下用40倍物镜采用插片法观察金耳菌丝特征，包括气生菌丝直径、分叉情况等，并拍照记录[18-19]。
1.2.2 不同氮源条件对金耳菌丝生长的影响
氮源以无氮源添加为对照组（CK），以添加酵母粉、尿素、硫酸铵、蛋白胨、氯化铵、草酸铵为试验组制作不同氮源条件的培养基，将金耳菌株于cPDA平板上活化，将活化长满菌丝的平板用直径1.0 cm的打孔器打孔后接入不同氮源的培养基，于25 ℃恒温培养，每个处理3 个重复，观察不同氮源处理下的菌株生长情况[16-17]。每隔24 h采用十字交叉法测量菌落直径，计算该菌株平均生长速率，每隔48 h平板正反面拍照1 次，并于光学显微镜下用40倍物镜采用插片法显微观察金耳菌丝特征，包括气生菌丝直径、分叉情况等，并拍照记录[18-19]。
1.3 数据分析
作图采用Adobe Illustrator 2018及Adobe Photoshop 2020软件，每个样品3 个重复，数据采用SPSS 16.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同碳源条件对金耳菌丝的影响
2.1.1 不同碳源条件下金耳菌丝cPDA平板生长情况分析
碳源是维持生物生长的重要营养物质。不同碳源条件下金耳菌丝cPDA生长情况如图1、图2所示。
图1 不同碳源条件下金耳菌丝cPDA生长情况（正面）
Fig.1 cPDA growth of N. aurantialba mycelial with different carbon sources （front）
图2 不同碳源条件下金耳菌丝cPDA生长情况（反面）
Fig.2 cPDA growth of N. aurantialba mycelial with different carbon sources （back）
由图1可知，在不同碳源条件下，金耳菌丝均能生长，但金耳菌丝形态、菌丝色泽、菌丝致密程度受不同碳源条件的影响。从菌丝形态看，不同碳源下均呈绒毛状；从菌丝色泽看，碳源为蔗糖、乳糖及麦芽糖时，菌丝颜色较为洁白，当碳源为果糖、D-阿拉伯糖及甘露醇时，菌丝颜色为淡黄色，当碳源为葡萄糖时，菌丝颜色为黄色。从图2看，碳源为麦芽糖时最为洁白，碳源为葡萄糖时颜色最深，为黄色；从菌丝致密程度上看，当碳源为乳糖时，菌丝密度最为致密，其次为蔗糖，当碳源为甘露醇时，菌丝密度最为稀疏，可能是金耳菌丝不能良好地利用无机碳源。
2.1.2 不同碳源条件下金耳菌丝生长速率
不同碳源条件下金耳菌丝生长速率比较如表1所示。
表1 不同碳源下金耳菌丝生长速率比较
Table1 Comparison of N. aurantialba mycelial growth rates with different carbon sources
碳源菌丝生长速率/（mm/d）碳源菌丝生长速率/（mm/d）CK7.60±0.16e麦芽糖8.61±0.14c蔗糖9.61±0.11 a D-阿拉伯糖8.04±0.23 d乳糖7.58±0.11 e甘露醇7.01±0.21 f果糖8.99±0.43b
注：不同小写字母代表组间差异显著（P＜0.05）。
由表1可知，金耳菌丝在不同碳源培养基下的菌丝生长速率有显著差异，生长速率排序为蔗糖＞果糖＞麦芽糖＞D-阿拉伯糖＞CK（葡萄糖）＞乳糖＞甘露醇，与图1、图2的结果较为一致，其中，碳源为蔗糖时生长速率最快，为9.61 mm/d；碳源为甘露醇时生长速率最慢，为7.01 mm/d，二者差异显著（P＜0.05），可能是金耳菌丝对有机碳源和无机碳源的利用率不同。
2.1.3 不同碳源下金耳菌丝微观形态
不同碳源下的金耳菌丝微观形态如图3、表2所示。
表2 不同碳源下金耳菌株气生菌丝直径比较
Table2 Comparison of aerial mycelia diameters of N. aurantialba strain with different carbon sources
碳源气生菌丝直径/μm碳源气生菌丝直径/μm CK2.97±0.15 c麦芽糖3.22±0.11 b蔗糖4.62±0.49 aD-阿拉伯糖3.29±0.47 b乳糖3.13±0.17c甘露醇2.79±0.33d果糖2.97±0.05c
注：不同小写字母代表组间差异显著（P＜0.05）。
图3 不同碳源下金耳菌丝微观形态
Fig.3 Microscopic morphology of N. aurantialba mycelium with different carbon sources
由图3和表2可知，在不同碳源培养基下，微观形态亦有所差异。从分枝情况看，当碳源为蔗糖、麦芽糖、果糖及葡萄糖（CK）时，菌丝均有分枝，且在碳源为蔗糖时分枝较多；从气生菌丝直径看，直径大小排序为蔗糖＞D-阿拉伯糖＞麦芽糖＞乳糖＞果糖=CK（葡萄糖）＞甘露醇，其中蔗糖为碳源时气生菌丝直径最大，为4.62 μm，甘露醇为碳源时气生菌丝直径最小，为2.79 μm。
2.2 不同氮源条件对金耳菌丝的影响
2.2.1 不同氮源下金耳cPDA平板生长情况分析
氮源是构成生物体蛋白质、核酸等化合物的材料，是生物生长的重要组成部分。不同氮源下金耳菌丝cPDA生长情况如图4、图5所示。
图4 不同氮源下金耳菌丝cPDA生长情况（正面）
Fig.4 cPDA growth of N. aurantialba mycelial with different nitrogen sources （front）
图5 不同氮源下金耳菌丝cPDA生长情况（反面）
Fig.5 cPDA growth of N. aurantialba mycelial with different nitrogen sources （back）
由图4可知，在不同氮源条件下，除氮源为尿素时金耳菌丝均能生长，但金耳菌丝形态、菌丝色泽、菌丝致密程度受不同氮源的影响。在接种后3 d，能看出明显差异，氮源为尿素时，菌丝不萌发，当氮源为草酸铵时，菌丝明显比其他氮源生长慢，其次为氯化铵、硫酸铵。从菌丝形态看，不同氮源下均呈绒毛状；从菌丝色泽看，氮源为草酸铵的金耳菌丝颜色最浅，为白色，未加氮源的培养基颜色与氮源为蛋白胨的培养基颜色较为接近且颜色较浅，为淡黄色，氮源为硫酸铵及氯化铵时，颜色较为接近，当氮源为酵母粉时颜色最深，为黄色。由图5可知，氮源为草酸铵时最为洁白，为酵母粉时颜色最深，为黄色；从菌丝致密程度上看，当氮源为草酸铵时，菌丝密度最为致密，但其菌落面积最小，其次为蛋白胨、CK及酵母粉，当氮源为氯化铵时，菌丝密度最为稀疏，推测可能是因为金耳菌丝不能良好地利用氮源，尤其是无机氮源。
2.2.2 不同氮源下金耳菌丝生长速率
不同氮源下金耳菌丝生长速率比较如表3所示。
表3 不同氮源下金耳菌丝生长速率比较
Table3 Comparison of N. aurantialba mycelial growth rates with different nitrogen sources
氮源菌丝生长速率/（mm/d）氮源菌丝生长速率/（mm/d）氮源菌丝生长速率/（mm/d）CK7.60±0.16b蛋白胨8.46±0.11a氯化铵6.36±0.18c酵母粉7.84±0.14b草酸铵4.35±0.21d硫酸铵6.64±0.10c
注：不同小写字母代表组间差异显著（P＜0.05）。
由表3可知，金耳菌丝在不同氮源培养基下的菌丝生长速率有显著差异，生长速率排序为蛋白胨＞酵母粉＞CK（无氮源）＞硫酸铵＞氯化铵＞草酸铵＞尿素（未生长），与图4、图5结果较为一致，其中，氮源为蛋白胨时菌丝生长速率最快，为8.46 mm/d，除尿素外，草酸铵为氮源时菌丝生长速率最慢，为4.35 mm/d（P＜0.05）。
2.2.3 不同氮源下金耳菌丝微观形态
不同氮源下的金耳菌丝微观形态如图6、表4所示。
表4 不同氮源下金耳菌株气生菌丝直径比较
Table4 Comparison of mycelial tips of N. aurantialba strain with different nitrogen sources
氮源气生菌丝直径/μm氮源气生菌丝直径/μm CK2.97±0.15c氯化铵2.92±0.12c酵母粉3.40±0.28b硫酸铵2.38±0.21d蛋白胨4.60±0.47a尿素0.00±0.00e草酸铵2.21±0.28d
注：不同小写字母代表组间差异显著（P＜0.05）。
图6 不同氮源下金耳菌丝微观形态
Fig.6 Microscopic morphology of N. aurantialba mycelium with different nitrogen sources
由图6、表4可知，在不同氮源培养下，微观形态有显著差异。从分枝情况看，氮源为酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、草酸铵及CK（无氮源）时，均有分支，但氮源为蛋白胨时，明显分枝较多。气生菌丝直径大小排序为蛋白胨＞酵母粉＞CK（无氮源）＞氯化铵＞硫酸铵＞草酸铵＞尿素，其中氮源为蛋白胨时气生菌丝直径最大，为4.60 μm，除尿素外，氮源为草酸铵时气生菌丝直径最小，为2.21 μm，且在光学显微镜下，当氮源为蛋白胨时，菌丝尤为粗壮；氮源为草酸铵时，菌丝纤细虚弱。
3 结论与讨论
金耳的产量及品质受菌株长势及栽培条件等的影响较大，金耳菌株在菌丝体阶段表现出的生物学特性直接影响子实体的产量及品质，作为珍稀食药用菌，金耳人工栽培过程中，菌丝体的健壮程度直接决定子实体的形成效率和商品性状。因此，深入研究金耳菌丝生长的营养需求特性，对实现金耳的高效栽培具有重要的意义。碳源及氮源均为金耳菌丝生长所必需的营养因子，其种类的选择直接影响菌丝的生理代谢活动，筛选合适的营养因子可为金耳菌种质量提供保障，从而提高金耳生产质量及产量[20]。本研究通过系统比较不同碳源、氮源对金耳菌丝生长的影响，为金耳栽培基质的优化提供了理论依据。
在碳源筛选试验中，研究设置了6 种碳源和葡萄糖对照组，通过试验发现，金耳菌丝表现出较广的碳源适应性，虽然在不同碳源下金耳菌丝生长指标均有差异，但均能维持基本生长，这说明金耳菌丝可能具有较为灵活的碳代谢途径，能有效地利用单糖、双糖和多糖多种碳源。综合菌丝形态、菌丝生长速率及气生菌丝直径等多项指标，可以确定金耳菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，且当碳源为果糖、麦芽糖、乳糖及D-阿拉伯糖时生长情况均比对照组好。这说明补充适宜的碳源可以促进金耳菌丝的生长。
在氮源筛选试验中，设置了对照组和5 种氮源，通过试验发现，不同氮源下金耳菌丝生长差异明显比不同碳源下更为显著。金耳菌丝能利用有机氮源与无机氮源，但表现出了明显的偏好性，金耳菌丝生长的最佳氮源为蛋白胨。当氮源为尿素时，金耳菌丝不能生长，培养皿中未见到任何菌丝萌发，推测原因可能是因为尿素含氮量较高，过高的氮浓度可能破坏了菌丝细胞的渗透平衡，从而导致金耳菌丝不能生长；当氮源为草酸铵时，生长极其缓慢。相比之下，蛋白胨及酵母粉的有机氮处理表现出了明显优势，金耳菌丝的生长速率及气生菌丝直径大小等指标均高于对照组，推测原因可能是金耳菌丝对某些有机氮源的利用效果更佳，无机氮源可能对金耳菌丝的生长有抑制作用。也可能是因为有机氮源除提供氮元素外，还可能含有某些促进菌丝生长的生长因子或微量元素，需要后续研究加以验证。
本试验只对单因子的碳源及氮源进行了探究，明确了蔗糖为最佳碳源、蛋白胨为最佳氮源，并未对碳氮比、微量元素及生长因子等其他重要因素进行探究。在实际栽培中，各种营养因子之间存在复杂的交互作用，环境因素如温度、pH值、光照等也会调节菌丝对营养物质的利用效率，维生素类物质可能影响菌丝的次级代谢。因此，具体适合金耳菌丝生长的最佳配方还需通过正交试验及响应面试验等更为系统的试验方法进行优化，最后还需将试验所得结果扩大到实际栽培中进行验证，只有通过这样的系统研究，才能真正建立起科学完善的金耳栽培技术体系，为金耳产业的可持续发展提供技术支持。
综上，本研究证实了蔗糖是金耳菌丝生长的最适碳源，蛋白胨是金耳菌丝生长的最佳氮源，这为金耳菌种培养基的优化提供了重要参考，未来通过多因素优化试验，有望建立更高效的菌种培养方案，进而提升金耳栽培的经济效益。这些研究成果不仅适用于金耳的人工栽培，对其他珍稀食药用菌的开发利用也具有重要的借鉴意义。随着人们对健康食品需求的不断增加，金耳等药用真菌的市场前景极为广阔，相关基础研究的深入将有力推动产业的健康发展。
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