近年来，多糖-多酚共价复合物凭借其在降血糖、抗癌、抗菌、抗炎以及调节肠道菌群等方面的功能活性，已成为生物活性物质领域的研究热点之一[1]。该类复合物由多糖与多酚通过共价键结合形成，展现出协同增强的生物效应，具有广阔的应用前景[2-3]。目前，多糖-多酚复合物的研究仍多集中于其生物活性，而多糖和多酚在反应过程中的结合规律缺乏系统深入的研究。尤其在共价键合过程中，多糖的分子量、单糖组成、链构象等关键结构特征是否发生变化及变化如何进一步影响复合物的功能特性和生物活性，目前仍不明确。
阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）作为一类重要的膳食多糖，广泛存在于谷物麸皮中，约占小麦麸皮、米糠等谷物副产物干重的10%～26%[4]。从分类属性来看，AX属于中性多糖，以β-1，4糖苷键连接的木糖为主链，阿拉伯糖残基通过C（O）-2、C（O）-3单取代或通过C（O）-2，3双取代形成支链[5]。AX来源广泛，且具有良好的免疫调节、抗肿瘤和肠道益生等生物活性[5-6]，基于其优良特性，在2023年经批准为我国“三新食品”原料。茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶叶中的主要活性成分，同样来源广泛，具有显著的抗氧化能力，且在食品体系中易于添加，是理想的多酚类模型物质[6]。鉴于二者分别在多糖、多酚类物质中的代表性及独特优势，选择AX与TP作为两类物质的代表，研究二者形成的共价复合物，对于揭示多糖-多酚相互作用规律具有重要意义。
自由基催化法因其反应效率高、条件可控的优点，被广泛用于多糖-多酚复合物的制备[7]。本试验采用自由基催化法制备AX-TP共价复合物，系统探究在反应过程中AX的分子量分布、单糖组成及构象特征的变化规律[1，8]。在此基础上，选取TP的抗氧化活性和AX的肠道益生活性作为评价指标，深入分析TP的共价修饰对AX生物活性的影响。本研究旨在为多糖-多酚共价复合物的高效制备工艺优化及其在功能性食品中的精准应用提供理论依据和数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麦麸：三门峡中普农业科技有限公司；茶多酚（纯度99%）：北京太阳生物科技有限公司；乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、庚酸混合酸标准品、二乙基丁酸：德国Sigma-Aldrich公司；单糖标准品（甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖）：北京索莱宝科技有限公司；尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50由国家生物科学研究所（北京）赠予；超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；M9缓冲液：北京天净沙基因科技有限公司；2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯溶液（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：上海晅科生物科技有限公司；TIANamp Stool DNA Kit试剂盒：北京天根生化科技有限公司；线虫生长培养基：山东拓普生物工程有限公司；菊粉（纯度92%）：济南圣泉生物科技有限公司。除特殊标记外，其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
气相色谱-质谱联用仪（GC-MS-QP2010Ultral型）：日本岛津公司；多角度激光光散射检测器（DAWN HE-LEOS-II，MALLS型）、示差折射率检测器（Optilab T-Rex，RI型）：美国沃特世-怀雅特公司；差压粘度计检测器（ViscoStar III，DP型）：北京东方安诺生化科技有限公司；超声波细胞破碎仪（Scientz-II型）：宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温恒湿培养箱（HNY型）：天津市欧诺仪器仪表有限公司；荧光酶标仪（Infinite M200 PRO型）：瑞士Tecan公司；厌氧培养箱（YQX-II 型）：上海跃进医疗器械有限公司；热脱附气相色谱仪（TRACE 1600型）：上海赛默飞世尔科技有限公司；振荡摇床（Innova 43型）：广州艾卡仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 AX的提取及理化性质分析
采用碱提取法从麦麸中提取AX[9]，采用苯酚硫酸法[10]、间羟基联苯法[11]、双缩脲比色（bicinchoninic acid assay，BCA）法[12]和福林-酚法[13]分别测定AX的总糖、糖醛酸、蛋白质和酚类化合物含量。
1.3.2 AX-TP共价复合物的制备
采用Zhang等[8]报道的方法制备AX-TP共价复合物。将4.0 g AX在60 ℃下完全溶解于400 mL去离子水中，平均分成4 份，随后每份加入4 mL 1 mol/L H2O2水溶液（该H2O2溶液内含0.1 g抗坏血酸），并在N2保护下分别缓慢加入0、0.3、0.5、0.7 g TP，反应24 h。反应液置于截留分子量为3 500 Da的透析袋中，透析72 h，去除游离TP。透析后样品经冻干处理，获得AX-TP共价复合物，分别标记为空白、AX-TPL、AX-TPM和AX-TPH。以TP为标准品，采用福林-西奥卡特（Folin-Ciocalteu）法测定TP在AX分子中的取代度。
配制0、20、40、60、80、100 μg/mL一系列TP梯度标准溶液并显色，在765 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。将TP-AX复合物样品溶液按照相同显色体系处理并测定吸光值，根据标准曲线计算样品中结合态TP含量，最终代入公式计算得到复合物的取代度。
1.3.3 溶解度的测定
将100 mg样品溶解于10 mL去离子水中，在25 ℃下搅拌5 h。然后在室温下以12 000×g的离心速率离心25 min。将上清液和沉淀物分别冷冻干燥并称重。溶解度计算公式如下。
式中：S为溶解度，%；wi为样品总质量，mg；wp为沉淀质量，mg。
1.3.4 单糖组成测定
称取1 mg样品，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），于120 ℃下水解2 h。水解产物经50 ℃真空浓缩干燥后，加入0.5 mL甲醇并用N2吹干，反复3次。随后，向干燥物中加入5 mg盐酸羟胺、1 mg肌醇及0.5 mL吡啶，于90 ℃反应0.5 h。待反应物冷却至室温，加入0.5 mL醋酸酐，在90 ℃下反应0.5 h进行乙酰化。反应完成后用N2吹干，即获得AX及AX-TP共价复合物的糖腈乙酸酯衍生物。甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖和木糖标准品均按上述相同步骤进行处理和衍生化。将各衍生物溶解于1 mL二氯甲烷（CH2Cl2），使用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪进行分析[14]。
1.3.5 分子量分布和分子链构象测定
采用安捷伦1260 Infinity II HPLC系统分析样品的分子质量与构象参数，检测器包含多角度激光光散射检测器、差压粘度计检测器和示差折射率检测器。
色谱柱：OHpak SB-803 HQ柱（8.0 mm×300 mm，Shodex）与OHpak SB-805 HQ柱（8.0 mm×300 mm，Shodex）串联；进样量100 μL；流动相为0.2 mol/L NaNO3溶液，样品溶液使用该流动相配制，浓度2.0 mg/mL，经0.22 μm水系滤膜过滤后进样。
数据分析采用ASTRA 7.1.3软件（Wyatt Technology），设定折光指数增量（dn/dc）值为0.146 mL/g，分子量（数均分子量、重均分子量）、旋转半径及流体力学半径均由软件计算得出[9]。形状因子ρ为旋转半径与流体力学半径的比值。
1.3.6 抗氧化活性
1.3.6.1 秀丽隐杆线虫同期化和培养
采用线虫生长培养基（nematode growth medium，NGM），在培养基表面涂布尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50作为线虫唯一食物来源。空白组仅含OP50，实验组则将AX、TP及AX-TPM分别与OP50混匀，终浓度均为1 mg/mL，添加至NGM表面。所有平板置于20 ℃、恒温恒湿培养箱中培养，直至线虫发育至L4期用于后续实验[15]。
1.3.6.2 线虫体内抗氧化酶SOD和CAT活性测定
随机挑选同期化处理好的线虫，用M9缓冲液收集至离心管中，并清洗3次，清洗干净后去除多余的缓冲液，使用细胞破碎仪制备裂解液，按照试剂盒说明书测定裂解液中SOD和CAT活性[16]。
1.3.6.3 线虫体内活性氧（ROS）水平测定
随机挑选同期化处理好的线虫，转移到含有AX、TP和AX-TPM的NMG平板上，于20 ℃恒温培养72 h。培养结束后，进行温度胁迫处理：先置于30 ℃培养30 min，再转至35 ℃培养4 h。胁迫处理完成后放回20 ℃环境恢复培养30 min，收集各组线虫。使用M9缓冲液收集并清洗线虫，反复3次，清洗干净后去除多余的缓冲液，采用细胞破碎仪制备裂解液。在裂解液中加入50 μL浓度为100 μmol/L的DCFH-DA溶液，在20 ℃黑暗环境中孵育2 h，使用荧光酶标仪检测ROS含量（激发波长为485 nm，发射波长为530 nm）[15]。
1.3.7 体外模拟发酵实验
1.3.7.1 AX、TP及复合物的体外发酵
采用Ding等[14]的方法配制不含碳源的厌氧培养基。称取0.02 g AX、TP或AX-TPM样品，加入2 mL厌氧培养基，60 ℃加热搅拌至溶解。在厌氧培养箱中（80% N2，10% CO2和10% H2）称取0.2 g猪结肠内容物，将含有样品的厌氧培养基加入其中，并充分混合，将仅含猪结肠内容物与培养基的混合物设为空白组，以菊粉作为阳性对照。将各组混合物置于37 ℃，于250 r/min的振荡摇床上进行酵解。分别在发酵0、6、12、24 h时取样，于11 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清液，经0.22 μm水系膜过滤后，用于短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）测定；沉淀用于肠道菌群测定[17]。
1.3.7.2 SCFAs含量测定
使用热脱附气相色谱仪测定SCFAs含量。
色谱柱：NukolTM Fused Silica Capillary Column（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度200 ℃，火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）温度250 ℃；H2流速40 mL/min，空气流速400 mL/min，进样量1 μL。
以0.5 μL二乙基丁酸作为内标。采用乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、庚酸混合酸标准品溶液绘制标准曲线[11]。利用标准曲线方程计算样品中各短链脂肪酸的含量。
1.3.7.3 肠道菌群测定
采用16S rDNA扩增子测序对发酵后的沉淀物进行肠道微生物检测，研究不同样品对肠道菌群的影响。使用TIANamp Stool DNA Kit试剂盒提取总DNA。用338F/806R引物对样本中细菌16S rDNA基因的V3-V4区域进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。16S rDNA扩增子通过Illumina MiSeq平台进行测序，由百迈克生物科技有限公司完成。以J121～J123和K121～K123分别代表以菊粉和空白对照为底物、体外发酵12 h后的3个重复样本。
1.4 统计分析
利用SPSS 24.0软件进行数据统计分析，数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析数据的显著性差异，不同字母表示具有显著性差异（p＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 AX的理化性质
化学组成分析显示，碱提AX总糖含量为（86.13±5.36）g/100 g，不含糖醛酸。AX的蛋白质和酚类化合物含量分别为（2.61±0.06）g/100 g和（0.34±0.03）g/100 g。以上结果表明，本研究采用的碱提取法可获得较高纯度的AX。
2.2 AX-TP共价复合物的制备及理化性质分析
2.2.1 复合物的合成机理
AX与TP共价结合反应原理见图1。
图1 AX与TP共价结合反应原理示意图
Fig.1 Covalent binding reaction principle between AX and TP
如图1所示，在自由基催化反应中，TP结构中的邻苯二酚基团首先被氧化，生成高活性的酚氧自由基（TP-O·），这些自由基随后攻击AX多糖链上的活性氢位点（如木糖单元的C—H键），产生AX碳自由基（AX-C·）。两种自由基通过偶联反应形成两种共价连接方式：一种是AX链上的氧原子与TP酚羟基通过C—O醚键连接（主产物），另一种是AX碳原子直接与TP苯环碳原子通过C—C键连接（副产物）。该反应受pH值显著影响，在中性条件下优先形成稳定的C—O醚键（占比70%～80%），而在酸性条件下，C—C键的比例显著升高。
2.2.2 取代度和溶解度测定结果
AX及AX-TP共价复合物的取代度（degree of substitution， DS）和溶解度（solubility index，SI）测定结果见表1。
表1 AX及AX-TP共价复合物的取代度和溶解度测定
Table1 Determination of degree of substitution and solubility index of AX and AX-TP covalent complexes
样品TP/gSI/%DS/（mg TP/g）AX090.20±1.21a-空白091.32±1.34a-AX-TPL0.388.24±1.52b37.06±2.15 AX-TPM0.587.16±2.07b41.15±1.42 AX-TPH0.775.26±1.89c59.60±2.40
注：不同字母表示存在显著性差异（p＜0.05）。-为该样品未进行此项指标测定。
如表1所示，随着TP添加量的增加，AX分子中TP的取代度逐渐增加。但随着TP取代度的增加，AX分子中部分氢键被共价结合的TP占用，导致其溶解度有一定程度的降低，当TP的取代度达到（59.60±2.40）mg TP/g时，复合物AX-TPH的溶解度降至75.26%，这与Liu等[9]的研究结果一致，即当AX的羟基被溶解度较低的小分子化合物取代后，会导致AX的溶解度显著降低。
2.3 AX-TP共价复合物的结构表征
2.3.1 单糖组成分析
AX及AX-TP共价复合物的单糖组成见表2。
表2 AX及AX-TP共价复合物的单糖组成
Table2 Monosaccharide composition of AX and AX-TP covalent complexes
样品空白52.60±0.35 a47.40±0.39 ab单糖物质的量百分比/%木糖阿拉伯糖AX52.30±0.25a47.70±0.46ab AX-TPL51.40±0.12b48.60±0.42ab AX-TPM52.80±0.24a47.20±0.71b AX-TPH51.30±0.09b48.70±0.85a
注：同列不同字母表示存在显著差异（p＜0.05）。
如表2所示，AX主要由木糖（52.3%）和阿拉伯糖（47.7%）构成，较高的木糖比例表明其主链为木聚糖骨架，阿拉伯糖以密集侧链形式取代，该结构特征有助于其在水溶液中的溶解，该结果与Liu等[10]的报道一致。在与TP发生共价结合后，AX的单糖组成并未发生显著改变，表明自由基催化反应主要发生在多糖链的羟基等活性位点，而未断裂其主链或支链的糖苷键。这证明由自由基催化所驱动的亲核反应过程能够保持AX分子基本结构单元的完整性，其糖链骨架未被破坏。以上结果证明了自由基催化的共价结合过程是一种温和且高效的策略，能够用于制备多糖-多酚共价复合物。
2.3.2 AX分子量分布与链构象变化
AX与AX-TP共价复合物的洗脱曲线见图2。基于HPSEC-MALLS系统对AX和AX-TP偶联物的分子量和构象特性见表3。
表3 基于HPSEC-MALLS系统对AX和AX-TP偶联物的分子量和构象特性
Table3 Macromolecular and conformational characteristics of AX and AX-TP covalent complex as determined by HPSEC-MALLS
AXAX-TPLAX-TPMAX-TPH参数峰1峰2峰1峰2峰1峰2峰1峰2数均分子量/（g/mol）1.50×1061.00×1044.65×1061.03×1058.00×1061.12×1051.02×1071.32×105重均分子量/（g/mol）2.40×1061.64×1058.84×1061.72×1053.92×1071.82×1055.12×1071.85×105旋转半径/nm43.2136.1148.5045.8245.5445.5550.6149.43流体力学半径/nm44.0233.2748.5044.0044.6143.5449.7447.22形状因子0.981.041.001.041.021.041.011.05
图2 AX与AX-TP共价复合物的洗脱曲线
Fig.2 Elution profiles of AX and AX-TP covalent complex
由图2可知，AX中含有两个分子量不同的组分（峰1和峰2）。由图3可知，AX在共价结合TP后，其包含的两个组分的分子量均增加，且随着TP共价结合量的增加，AX-TP复合物的分子量也逐渐增加。各样品的形状因子均在1左右，表明AX及AX-TP复合物均为松散的高支化聚合物[17]。此外，尽管共价结合了TP，AX分子构象变化并不大，始终为高度支化结构，该结果与单糖组成分析测定结果一致。
图3 AX、AX-TPM和TP处理对线虫体内SOD、CAT活性及ROS水平的影响
Fig.3 Effects of AX，AX-TPM，and TP treatments on SOD，CAT activity，and ROS levels in C. elegans
2.4 AX及AX-TP共价复合物对线虫抗氧化能力的影响
细胞内源性抗氧化酶（如SOD和CAT）具有消除ROS功能，在生理条件下对抵御氧化应激至关重要。SOD作为关键酶，能将ROS的主要来源—超氧阴离子歧化为H2O2，随后CAT进一步将其转化为水，从而有效减轻ROS的毒性。
TP是茶叶中最重要的功能性成分之一，富含酚羟基，具有卓越的抗氧化能力。本研究中，AX-TPM具有较高的TP取代度和溶解度。因此，选择AX-TPM与AX、TP单体进行了体外抗氧化特性比较，结果见图3。
如图3所示，与空白组相比，AX、AX-TPM、TP组的SOD活性分别提高了6.4%、24.8%和35.5%，CAT活性分别增加了6.7%，19.0%和30.6%。TP单体由于其自身优异的抗氧化活性，对线虫体内抗氧化酶活性的促进效果最强。与AX单体相比，AX-TPM的抗氧化能力显著升高（p＜0.05）。这表明与AX共价结合后，TP仍保持了良好的抗氧化活性。
为验证抗氧化特性是否能直接降低细胞内ROS水平，本实验构建热应激诱导ROS升高的线虫模型，在此模型中进行了ROS水平检测。结果表明，AX-TPM和TP单体分别使线虫体内ROS水平显著降低42.9%和48.6%，此结果与SOD和CAT活性增强的趋势相符，表明TP的共价结合会提高线虫的抗氧化能力。
2.5 AX及AX-TP共价复合物的体外肠道酵解特性分析
2.5.1 酵解过程中SCFAs的测定
AX是谷物中主要的可溶性膳食纤维，可通过调节肠道菌群结构显著促进肠内有益代谢产物SCFAs的生成。乙酸、丙酸、丁酸作为肠道中重要的SCFAs，对人体健康具有多种益处。其中，丁酸是结肠上皮细胞的主要能量来源[18]，丙酸参与肝脏能量代谢，可促进益生菌生长，有助于维持肠道微生态平衡、调节血糖及胆固醇水平[19]；乙酸可以为心脏、肝脏等器官提供能量，增加结肠血流量，促进肠道蠕动[20]。本研究使用猪结肠消化物的体外模拟发酵实验比较了AX-TPM、AX和TP单体的结肠酵解特性，结果见图4。
图4 不同多糖样品组体外发酵过程中不同时间短链脂肪酸的变化
Fig.4 Changes in short chain fatty acids at different time during in vitro fermentation of different polysaccharide sample groups
如图4所示，在培养的24 h内，各样品组的乙酸、丙酸、丁酸和总SCFAs浓度随着培养时间的延长而明显增加，表明肠道菌群在持续分解利用培养基中的碳水化合物。相较于空白组，在相同的培养时间下，AX可显著促进乙酸[（12.25±3.13） mmol/L]、丙酸[（7.25±0.83） mmol/L]、丁酸[（2.99±0.85） mmol/L]和总SCFAs[（27.50±1.00） mmol/L]的产生，AX-TPM可显著促进乙酸[（9.25±3.50） mmol/L]、丁酸[（2.07±0.53） mmol/L]和总SCFAs[（22.50±1.90） mmol/L]的产生。而TP组与空白组未见显著差异。这表明AX具有良好的益生活性，而TP可能因其普遍抑菌特性而抑制SCFAs产生。与AX相比，AX-TPM组的乙酸[（9.25±3.50） mmol/L]、丙酸[（5.60±0.50） mmol/L]、丁酸[（2.07±0.53） mmol/L]和总SCFAs[（22.50±1.90） mmol/L]均显著低于AX组。上述结果表明，AX分子中共价结合的TP仍具有一定微生物抑制作用，从而降低了AX酵解肠道微生物的速率。Guo等[21]也报道了类似结论，即酚类化合物共价结合后，会降低AX在结肠中酵解的速率，降低肠道微生物产SCFAs的能力。
2.5.2 酵解过程中肠道微生物的测定
2.5.2.1 肠道菌群的α-多样性和β-多样性
α-多样性作为评估微生物群落结构的重要参数，其指数变化可反映菌群的丰富度和多样性特征。图5（a）～（d）和（e）～（h）分别展示了AX、TP、AX-TPM、菊粉及空白组在12 h和24 h发酵过程中肠道菌群α-多样性指数的变化情况，包括ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数4项关键指标。其中，Chao1和ACE指数表征物种丰富度，数值越高表明菌群包含的物种数量越多；Shannon指数与Simpson指数则分别从正反两个角度反映群落的多样性及均匀度：Shannon指数升高和Simpson指数降低均代表更高的物种多样性。
图5 不同样品组体外发酵12 h和24 h后肠道菌群的α-多样性指数变化
Fig.5 Changes in the alpha diversity index of gut microbiota after 12 and 24 hours of in vitro fermentation across different sample groups
实验数据显示，相较于空白组，AX、TP及AX-TPM组在两个时间点均表现出显著的α-多样性降低趋势，表明这些物质可能通过选择性促进特定菌群生长而重塑了微生物群落结构。β-多样性能够反映样本间群落的差异程度，可以通过主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）直观地比较不同样本间微生物组成的相似性，结果见图6。
图6 不同样品组体外发酵12 h和24 h后肠道菌群的β-多样性指数的PCoA评分二维图
Fig.6 Two-dimensional PCoA scores of beta diversity index of gut microbiota after 12 and 24 hours of in vitro fermentation for different sample groups
由图5和图6可知，在体外培养的24 h内，各组SCFAs含量逐渐升高，表明肠道微生物活跃度随时间逐渐增强，因此，本实验选择12 h和24 h两个时间点，对肠道微生物进行16S rDNA基因高通量测序，以初始猪结肠内容物作为空白组，以菊粉作为阳性对照，分析AX、TP和AX-TPM对肠道微生物群落组成和分布结构的影响。PCoA结果显示，AX组与AX-TPM组的样本点空间分布呈现部分重叠且距离相近，表明二者对肠道菌群的影响模式具有相似性。
2.5.2.2 肠道菌群物种相对丰度
发酵12 h及24 h后肠道菌群在门水平和属水平组成分析见图7。
图7 发酵12 h及24 h后肠道菌群在门水平和属水平组成分析
Fig.7 Composition analysis of gut microbiota at phylum level and genus level after 12 and 24 hours of in vitro fermentation
3 结论
猪结肠内容物微生物群落分析结果（图7）显示，在门水平上，其组成以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为主。属水平上的优势菌群则包括乳酸菌属（Lactobacillus）、大肠杆菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）、链球菌属（Streptococcus）、土包杆菌属（Terrisporobacter）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）、拟杆菌属（Bacteroides）、梭杆菌属（Fusobacterium）、副拟杆菌属（Parabacteroides）及双歧杆菌属（Bifidobacterium）。在体外发酵的12 h，AX、菊粉与AX-TPM均能促进Firmicutes和Actinobacteria的增殖，并抑制Proteobacteria、Fusobacteria与Bacteroidetes的丰度，其中AX与菊粉的效果略高于AX-TPM，而TP对Firmicutes与Actinobacteria的促进作用较弱；至发酵24 h，这一趋势得以延续。在属水平上，各处理组在两个时间点均能稳定促进Lactobacillus、Terrisporobacter、Clostridium_sensu_stricto_1及Bifidobacterium等有益菌的增殖，并抑制Escherichia-Shigella、Streptococcus与Fusobacterium等潜在致病菌的生长，其中AX、菊粉与AX-TPM的益生效能整体优于TP。已有研究指出，Lactobacillus与Bifidobacterium等菌属可通过产生SCFAs、降低肠道pH值、增强屏障功能等方式发挥益生作用[22-23]；而Escherichia-Shigella与Fusobacterium等则与肠道炎症、感染乃至结直肠癌的发生相关[23-24]。综上，尽管TP的共价结合可能在一定程度上弱化了AX原有的益生效应，但仍具有一定的肠道益生活性。
本研究通过自由基催化反应，成功制备了不同取代度的AX-TP共价复合物，并揭示了其结构-功能关系。随着TP添加量的提高，复合物的取代度呈上升趋势，当TP添加量为0.7 g时，取代度达到最高值59.60 mg TP/g。然而，由于共价结合的TP占据了AX分子中的部分氢键位点，导致复合物的溶解度有所下降，最高取代度样品（AX-TPH）的溶解度降至75.26%。结构分析表明，该反应未改变AX的单糖组成和溶液中的链构象，但由于分子中接枝TP，分子量有所增加。在生物活性方面，TP的共价结合显著增强了AX的抗氧化能力，具体表现为提升线虫体内的SOD和CAT活性，同时降低ROS水平。尽管TP单独作用时未见明显的体外肠道益生活性，但AX-TP复合物在肠道酵解过程中表现出良好的益生效应：不仅能促进乙酸、丁酸及总SCFAs的产生，还可选择性促进Lactobacillus和Bifidobacterium等有益菌的增殖，同时抑制Escherichia-Shigella、Fusobacterium和Streptococcus等潜在致病菌的生长。本研究的主要创新在于阐明了AX与TP在共价结合过程中的结构变化规律及其对复合物溶解性、抗氧化活性与益生功能的协同调控功能，为AX-酚类化合物的制备提供了实验参考，为其在功能性食品中的应用提供了潜在方向。但现有研究尚处于体外阶段，且复合物的长期稳定性和在实际应用中的效果仍需进一步验证。未来研究将通过动物和临床深入探究复合物的生物活性和相关机理，以期在食品和医药领域的应用提供相关理论支持。
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