婴幼儿期作为生命早期发育的关键窗口期，其消化系统的成熟与肠道菌群定植过程呈现显著的月龄依赖性[1]。不同月龄婴幼儿的吞咽协调能力、消化酶（如淀粉酶、脂肪酶）活性、胃肠蠕动节律及肠道微生态（菌群组成与代谢功能）等方面存在显著差异，这些生理差异直接影响其对营养素的消化效率、吸收速率及体内利用模式，从而影响其早期生长发育轨迹[2]。生命早期1 000天（即从受孕至出生后3年）被视为影响婴幼儿长期营养与健康结局的“关键机遇期”[3]。此阶段的营养供给与生理环境，不仅密切关联大脑神经发育、认知功能形成以及肠道免疫系统（尤其是黏膜免疫）的建立，也对消化、呼吸等系统功能成熟及远期肥胖、过敏等健康风险具有深远影响，因此成为婴幼儿营养研究的核心阶段[2-3]。
米粉作为婴幼儿从液体喂养向固体喂养过渡的“第一口辅食”，凭借其低致敏性、易消化吸收、口感温和及冲调浓度可控等优势，在婴幼儿辅食体系中占据重要地位[4]。然而，当前传统米粉产品普遍存在同质化严重、营养结构单一（如过度侧重宏量营养素，忽视功能性成分）等问题，难以精准适配不同月龄婴幼儿的动态生理需求和消化能力，无法充分满足个体化营养需要，因此亟需通过技术创新实现产品升级[5]。
生物酶法水解技术因其反应条件温和，可在精准调控淀粉结构的同时，最大限度地保留原料中热敏性与化学敏性营养素的生物活性及生物可利用性[6]。其中，α-淀粉酶可特异性水解淀粉链中的α-1，4-糖苷键，葡萄糖淀粉酶则进一步将寡糖降解为葡萄糖，二者协同可实现淀粉水解程度的精准控制[7]。本研究以葡萄糖当量（dextrose equivalent，DE）表示米粉的水解度，选取轻度酶解和深度酶解的米粉样品作为研究对象，构建了从淀粉结构微调（轻度酶解）到高度预制化（深度酶解）的梯度差异，旨在阐明酶解程度与米粉消化功能特性（如淀粉水解速率、易消化淀粉比例）之间的量效关系，为产品精准开发提供理论基础[8-9]。
基于婴幼儿消化生理与肠道菌群发育的阶段特征，本研究整合体外模拟消化与体外肠道发酵试验，建立从消化特性到肠道微生态响应的完整研究体系。通过体外消化试验定量评估不同DE值米粉的淀粉水解动力学参数与快消化淀粉含量，揭示酶解处理对消化过程的影响；利用体外发酵试验，阐明不同酶解程度米粉对6～9月龄及10～12月龄婴幼儿肠道菌群结构与功能的调节作用，旨在从机制层面探讨酶解米粉在促进营养利用与调节微生态方面的协同效应，也为开发契合月龄生理特点、兼具高效消化与肠道健康促进功能的“分阶营养”婴幼儿辅食提供科学依据与技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
有机大米：市售；α-淀粉酶（480 nku/g）、葡萄糖淀粉酶（1 100 AGU/g）：丹麦诺维信公司；胰酶（≥100 U/mg）：上海迈瑞尔化学技术有限公司；α-葡萄糖苷酶（≥100 U/mg）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；葡萄糖试剂盒：南京建成生物工程研究所；HiPure Stool/Soil DNA Mini Kit试剂盒：广州美根生物技术有限公司；2×TransStart® FastPfu PCR SuperMix试剂盒：北京全式金生物技术有限公司；NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5试剂盒：美国因美纳公司。
1.2 仪器与设备
水浴恒温振荡器（SHZ-C）：常州诺基仪器有限公司；离心机（G508010）：生工生物工程股份有限公司；酶标仪（Epoch）：美国佰腾仪器有限公司；高通量研磨仪（FastPrep-24）：美国MP生物医疗公司；高速冷冻离心机（5427R）、高速室温离心机（5424）：德国艾本德股份公司；金属浴（HH-100）：杭州佑宁仪器有限公司；聚合酶链式反应扩增仪（Thermal Cycler）、荧光定量仪（Quant 4.0）：美国赛默飞世尔科技公司；测序仪（Novaseq6000）：美国因美纳公司；高效液相色谱仪（2695）：美国沃特世公司；分级式超微粉碎机（WFJ-18）：常州新马干燥工程有限公司；立式高压蒸汽灭菌器（LDZX-50L-I）：上海申安医疗器械厂。
1.3 试验方法
1.3.1 酶解米粉的制备工艺
不同水解度米粉的制备工艺：有机大米→超微粉碎→加辅料调浆→酶解→预糊化→辊筒干燥→后混辅料→包装。将有机大米经过超微粉碎机磨碎后，加辅料调浆后，加入定量的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的复合酶制剂，升温至55 ℃，加入其他预混料后，分别反应30 min和60 min，经蒸汽辊筒干燥处理后，分别制得轻度酶解米粉与深度酶解米粉两种样品。
1.3.2 米粉DE值的测定
采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定酶解米粉中的还原糖含量，具体步骤参考GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》中的第一法[11]。测定的DE值（X，%）用于表征淀粉的水解程度，计算公式如下。
式中：C1为还原糖含量，mg；C2为总干物质含量，mg。
1.3.3 米粉体外消化特性的测定
参照Jang等[12]的方法并稍作改进，测定米粉的体外消化特性。具体步骤：取3 g胰酶分散于20 mL去离子水中，振荡混匀10 min，以4 000 r/min离心10 min，取15 mL上清液转移至离心管中，加入1.1 mL α-葡萄糖苷酶，配制成酶混合液。随后，在锥形瓶中加入0.2 g样品、20粒玻璃珠及18 mL醋酸钠缓冲液（pH5.2），于37 ℃水浴中预热平衡5 min，再加入0.5 mL酶混合液启动反应。将锥形瓶置于37 ℃恒温振荡水浴中孵育120 min，期间每隔20 min取样0.1 mL水解液，加入0.9 mL蒸馏水混匀，于沸水浴中加热5 min以终止酶活性。混合液经4 000 r/min离心10 min后，取上清液，使用葡萄糖试剂盒测定其中葡萄糖含量。以水解时间为横坐标、淀粉消化率为纵坐标，绘制淀粉体外消化动力学曲线。
式中：Y为消化率，%；At为t时的葡萄糖含量，mg；W为复合物的总质量，mg。
快消化淀粉（rapidly digestible starch，RDS）（在20 min内消化）、慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）（在20～120 min内消化）和抗性淀粉（resistant starch，RS）（120 min后未消化）的水解率计算公式如下。
式中：B为快消化淀粉水解率，%；C为慢消化淀粉水解率，%；D为抗性淀粉水解率，%；G0、G20和G120分别为在0、20和120 min时淀粉被α-葡萄糖苷酶和胰酶水解后水解液中的葡萄糖含量，mg；TS为米粉中的总淀粉含量，mg。
对不同酶解程度米粉进行消化动力学分析，淀粉消化的一阶动力学方程如下。
式中：Ct为水解过程中t时刻的水解产物占比，%；C∞为淀粉水解终点浓度，%；k为消化率常数；t为消化时间，min。
1.3.4 酶解米粉的低聚糖分子量分布
将未酶解和酶解米粉分别消化20 min和120 min的样本复溶成1%水溶液，经0.22 μm膜过滤后，收集滤液待测。采用高效液相色谱仪测定分子量分布，色谱柱为Ultrastyragel Linear柱，流动相为0.1 mol/L硝酸钠溶液，流速设定为0.5 mL/min。
1.3.5 酶解米粉的体外粪菌发酵试验
发酵培养基配制：将蛋白胨（2 g）、酵母提取物（2 g）、NaCl（0.1 g）、KH2PO4（0.04 g）、K2HPO4（0.04 g）、MgSO4·7H2O（0.01 g）、CaCl2（0.01 g）、NaHCO3（2 g）、吐温-80（2 mL）及胆汁盐（0.5 g）溶于1 L磷酸盐缓冲液（pH6.8），经121 ℃、15 min高压灭菌，冷却后添加血红素（0.02 g）、维生素K1溶液（10 mL，2 μg/mL）与半胱氨酸（0.5 g）。
人体伦理声明：本研究涉及婴幼儿粪便样本采集，已获江南大学伦理委员会审查批准（伦理批准号：JNU202209011RB17）。所有受试者均由其法定监护人签署书面知情同意书后纳入研究。样本以编码方式匿名化处理，仅用于本研究分析；样本采集与处理过程严格遵循伦理原则及本机构伦理管理规范。
粪便悬液的制备：采集6～9月龄及10～12月龄健康婴幼儿新鲜粪便各5例，纳入标准为近3 个月内未使用抗生素或益生菌。取每名婴幼儿粪便样本2 g置于50 mL无菌离心管中，加入10 mL无菌厌氧磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），涡旋振荡2 min，3 000 r/min离心5 min后收集上清液。向沉淀中再次加入10 mL无菌厌氧PBS，重复振荡与离心（1 000 r/min，5 min），合并两次所得上清液，充分混匀后即制得10%的粪便悬液。
米粉粪菌发酵试验：将粪便悬液与发酵培养基按1∶9（体积比）混合，其中含6～9月龄粪悬液的组别记为S1，含10～12月龄粪悬液的组别记为S2。再分别向混合培养基中加入经胃肠消化处理的轻度酶解米粉（DE3）和深度酶解米粉（DE8），添加量为0.2 g/10 mL，对应组别分别命名为DE3组与DE8组，并设立不添加米粉的对照组。所有体系于37 ℃厌氧条件下培养24 h，结束后以12 000 r/min离心10 min，分别收集上清与沉淀，于-80 ℃保存备用。
1.3.6 肠道菌群的检测分析
将发酵后的菌体沉淀送交上海宏序生物科技有限公司进行16S rRNA基因测序，以分析肠道菌群组成。采用针对细菌16S rRNA基因V3～V4区的通用引物进行扩增，正向引物为338F （5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG-3′），反向引物为806R （5′-GGACTACH-VGGGTWTCTAAT-3′）。基于测序结果，统计各样本在门、纲、目、科、属、种水平的菌群相对丰度，并进行α多样性分析、优势菌群分析以及物种差异分析。
1.4 数据处理
所有试验均独立重复3次，数据以平均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 27软件进行方差分析，以评估组间差异的显著性。图表使用Origin 2022绘制。
2 结果与分析
2.1 酶解处理对米粉消化特性及淀粉组成的影响
生物酶解工艺可用于生产针对不同月龄、具有特定水解度与消化特性的分阶型米粉产品[9]。不同酶解处理对米粉消化特性及淀粉组成的影响如图1所示。
图1 酶解处理对米粉消化特性及淀粉组成的影响
Fig.1 The effect of enzymatic hydrolysis on the digestive characteristics and starch composition of rice flour
从图1（A）可以看出，在模拟肠消化的前20 min内，3组样品的淀粉消化率均快速上升，随后消化曲线逐渐趋于平稳。与对照组相比，轻度酶解（DE3组）与深度酶解（DE8组）米粉的水解速率明显提升。在消化20 min时，与对照组相比，两者的消化率分别提高了7.26%与13.45%；至120 min时，仍分别提高了6.28%与7.95%，表明酶解处理明显增强了米粉的体外消化性能[13]。
根据消化过程中葡萄糖的释放速率，淀粉可分为快消化淀粉、慢消化淀粉与抗性淀粉[14]。从图1（B）可以看出，与轻度酶解米粉相比，深度酶解米粉中RDS含量高达85.4%，而RS含量仅为3.1%。这种淀粉组成特征使其能够更迅速地被婴幼儿肠道消化酶水解为葡萄糖，有利于高效吸收，并减轻消化负担[15]。上述结果从消化动力学与组分层面，系统揭示了不同DE值米粉的消化特性差异，为其在分阶营养辅食中的应用提供了关键依据。不同酶解特性米粉的淀粉水解动力学方程特征参数如表1所示。
表1 不同酶解特性米粉的淀粉水解动力学方程特征参数
Table1 Characteristic parameters of the starch hydrolysis kinetics equation for rice flour with different enzymatic hydrolysis characteristics
组别C∞/mgK/minR2对照组78.820.083 890.990 5 DE3组85.420.090 530.990 4 DE8组88.740.109 700.989 4
由表1可知，3组米粉淀粉水解曲线拟合度较高（R2＞0.98），与对照组相比，轻度酶解米粉和深度酶解米粉组的淀粉水解动力学速率K值分别上升了7.9%、30.8%，与淀粉消化率和消化淀粉含量的试验结果一致。
2.2 酶解处理对米粉中低聚糖分子量分布的影响
酶解处理对米粉中低聚糖分子量分布的影响如图2所示。
图2 酶解处理对米粉中低聚糖分子量分布的影响
Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis on the molecular weight distribution of oligosaccharides in rice flour
由图2（A）可知，消化20 min时，与未处理对照组相比，DE3组和DE8组中低分子低聚糖[分子量＜500 Da，聚合度（degree of polymerization，Dp）≤3]的相对含量分别显著提高14.8%和28.9%。其中，DE8组增幅更大，表明提高酶解程度可更高效促进消化初期大分子多糖的解聚反应，增强底物可及性，从而在相同时间内生成更多低分子组分（Dp≤3）。由图2（B）可知，当消化时间延长至120 min时，两种酶解处理组中低分子量低聚糖（Dp≤3）的相对含量均达到95%以上，且深度酶解组仍高于轻度酶解组。上述结果表明，在婴幼儿消化早期，酶解处理可促进低分子低聚糖的持续生成与积累，且较高酶解程度有助于进一步加快其形成过程。消化持续2 h后，不同酶解程度的米粉均可实现大分子多糖向低分子组分的高效转化。发酵阶段中，这些低聚糖组分可作为更丰富且利用效率更高的碳源，为后续肠道发酵提供底物支持，并为肠道菌群结构与功能的重塑奠定物质基础。
2.3 不同酶解处理米粉对6～9月龄婴幼儿肠道菌群的影响
2.3.1 α多样性分析
通过Chao1、Shannon和Pielou指数评估微生物群落的丰富度、多样性和均匀度，结果如图3所示。
图3 α多样性分析
Fig.3 α diversity analysis
由图3可知，与对照组相比，DE3组和DE8组的Chao1指数均有所上升。在多样性方面，对照组与DE3组的Shannon指数和Pielou指数较为接近，而DE8组的这两项指数则呈下降趋势，提示深度酶解处理后的米粉发酵降低了菌群的均匀度[16]。上述结果表明，深度酶解干预下的菌群结构可能正处于动态演替阶段，细菌间竞争加剧，并逐渐向以特定优势类群为主的结构过渡。
2.3.2 门水平的菌群结构分析
体外发酵后3组样本在门水平上的肠道菌群相对丰度如图4所示。
图4 门水平的肠道菌群相对丰度
Fig.4 Relative abundance of gut microbiota at the phylum level
由图4可知，肠道菌群中主要包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）。各组样本中变形菌门、厚壁菌门与放线菌门的相对丰度之和均超过97%。与对照组相比，DE8组中厚壁菌门与放线菌门的相对丰度分别从5.76%和1.37%上升至10.26%和4.96%，而变形菌门则从90.05%下降至84.77%[17]。
2.3.3 属水平的菌群结构分析
属水平的肠道菌群相对丰度分析如图5所示。
图5 属水平的肠道菌群相对丰度
Fig.5 Relative abundance of gut microbiota at the genus level
由图5可知，在属水平上，埃希氏菌属（Escherichia-Shigella）在所有组中均占主导地位。克氏杆菌属（Klebsiella）、肠球菌属（Enterococcus）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）在各组中呈现较高比例。拟杆菌属（Bacteroides）、副梭菌属（Paraclostridium）和摩根菌属（Morganella）则主要存在于对照组中。与对照组相比，经轻度酶解和深度酶解米粉发酵后，双歧杆菌属的丰度均显著上升。双歧杆菌是公认的“婴儿友好型”益生菌，在增强免疫、维护肠道屏障、促进营养代谢及维持微生态稳定方面具有重要作用[18]。与此同时，DE3组和DE8组中多种潜在致病菌（如消化链球菌科、柠檬酸杆菌属、副梭菌属）的丰度有所降低，这可能意味着与肠道炎症、心血管疾病或系统性感染相关的疾病风险相应下降。上述菌群结构的整体改善，共同反映出酶解干预对肠道微生态健康的积极调节作用。
2.3.4 物种分类差异分析
采用线性判别分析显著性演变（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析方法，通过线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应量可整合不同分类层级的群落数据，从而识别组间具有显著差异的物种。肠道菌群的物种差异分析如图6所示。
图6 肠道菌群的物种差异分析
Fig.6 Analysis of species differences in gut microbiota
由图6可知，将LDA阈值设定为2时，3组间共鉴定出15 个差异显著的生物标志物，其中，对照组、DE3组和DE8组分别富集了8、6、1 个标志物。对照组中富集的菌群主要隶属于变形菌门（Proteobacteria）、变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacterales）及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）；DE3组富集的菌群主要属于厚壁菌门（Firmicutes）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、肠球菌科（Enterococcaceae）和肠球菌属（Enterococcus），其中包含物种如粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；DE8组中富集的菌群则主要分布于乳杆菌科（Lactobacillaceae）。
通过比较不同酶解程度的米粉对微生物群落的影响发现，与对照组和DE3组相比，DE8组的米粉发酵处理能显著促进有益菌科乳杆菌科（Lactobacillaceae）的富集，同时降低潜在有害菌属肠球菌属（Enterococcus）的相对丰度（图6）。因此，深度酶解米粉（DE8组）更适用于S1阶段（6～9月龄）的婴幼儿。
2.4 不同酶解处理米粉对10～12月龄婴幼儿肠道菌群的影响
2.4.1 α多样性分析
α多样性分析如图7所示。
图7 α多样性分析
Fig.7 α diversity analysis
由图7可知，对于10～12月龄婴幼儿粪菌发酵体系，与对照组相比，DE3组和DE8组的Chao1指数显著降低，而Pielou指数显著升高，表明酶解米粉处理降低了肠道菌群的物种丰富度，同时提高了群落均匀度[19]。DE3组与DE8组间上述指数无显著差异。然而，该变化趋势与6～9月龄组结果相反，提示酶解米粉干预可能对不同月龄婴幼儿肠道菌群具有差异化的调节作用。这种结构变化可能通过抑制部分稀有或条件致病菌的增殖，促进原本占比偏低菌群的生长，从而推动肠道菌群向更稳定、更成熟的方向重构[20]。此外，3 组样本的Shannon指数均约为1.25，组间未见显著差异。
2.4.2 门水平的菌群结构分析
门水平的肠道菌群相对丰度分析如图8所示。
图8 门水平的肠道菌群相对丰度分析
Fig.8 Analysis of the relative abundance of gut microbiota at the phylum level
从图8中可以看出，在门水平上，3组发酵液中的绝对优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota），三者合计相对丰度约占99%。与对照组相比，DE3和DE8干预组中厚壁菌门、放线菌门的相对丰度有所升高，而变形菌门和拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度有所下降[21]。
2.4.3 属水平的菌群结构分析
属水平的肠道菌群相对丰度分析如图9所示。
图9 属水平的肠道菌群相对丰度分析
Fig.9 Analysis of the relative abundance of gut microbiota at the genus level
从图9中可以看出，属水平分析显示组间菌群结构差异显著。埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）在3组中均占主导地位，克雷伯氏菌属（Klebsiella）也亦保持较高丰度。此外，链球菌属（Streptococcus）、粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）和肠球菌属（Enterococcus）在DE3组和DE8组中的丰度较高。
与对照组相比，DE3组与DE8组的肠道菌群结构呈现积极变化。具体表现为乳杆菌目相对丰度显著上升，其代谢产物乳酸可抑制念珠菌等有害菌的生长，有助于维持肠道稳态，改善乳糖不耐受、便秘及腹泻等症状；埃希氏菌-志贺氏菌属的相对丰度显著下降，提示与腹泻、出血性肠炎、细菌性痢疾相关的感染风险可能下降；在DE3组中，克雷伯氏菌属丰度显著降低，反映肠道炎症及感染风险减轻，菌群结构趋于健康，DE8组中该菌属丰度亦呈下降趋势，但未达显著水平；具有明确益生功能的粘液乳杆菌属在两组中丰度均有所增加，其良好的肠道定植能力与免疫调节特性进一步支持肠道健康；此外，链球菌属丰度的上升可能反映了部分参与早期肠道定植与免疫调节的菌株增殖，对宿主发育与免疫平衡具有潜在积极意义。
2.4.4 物种分类差异分析
肠道菌群的物种差异分析如图10所示。
图10 肠道菌群的物种差异分析
Fig.10 Analysis of species differences in gut microbiota
从图10中可以看出，LEfSe分析在10～12月龄组的3组间共鉴定出48 个差异显著的生物标志物。对照组中富集的菌群主要隶属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacterales）、变形菌门（Proteobacteria）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。DE3组中富集的标志物则主要分布在乳杆菌目（Lactobacillales）、芽孢杆菌纲（Bacilli）和厚壁菌门（Firmicutes）。
研究表明，酶解处理可显著调节10～12月龄婴幼儿的肠道菌群结构[22]，促使其由肠杆菌科（如埃希氏菌属-志贺氏菌属）占优势的相对单一状态，向乳杆菌目、链球菌属和粘液乳杆菌属等有益菌协同共生的微生态模式，从而推动肠道菌群结构向更稳定、更成熟的方向发展[23-24]。其中，与深度酶解（DE8组）相比，轻度酶解（DE3组）处理能更有效地促进乳杆菌目的增殖。乳杆菌目的富集对于提升消化吸收功能、推动肠道菌群成熟及巩固肠道屏障具有重要意义。因此，轻度酶解米粉更适用于S2阶段（10～12月龄）婴幼儿的营养支持。
3 结论
本研究聚焦婴幼儿肠道健康的核心需求，系统阐明了生物酶解技术通过定向调控米粉辅食消化特性，进而影响其营养可利用性与肠道微生态响应的作用机制。结果表明，酶解处理可显著影响米粉的消化动力学特征与底物组成，且其对肠道微生态的调节效应呈现明确的月龄阶段性差异。深度酶解米粉更有利于乳杆菌科的增殖，并抑制肠球菌属等潜在致病菌的定植，为6～9月龄婴幼儿肠道免疫耐受和肠道微生态的初步建立提供支撑。轻度酶解米粉则显著促进乳杆菌目的富集，加速菌群结构向成熟态演进，并增强肠道屏障功能，以适配10～12月龄婴幼儿消化能力提升、肠道发育趋于成熟的生理特点。
综上，分阶酶解作为婴幼儿米粉精准营养设计的关键工艺策略，通过定向调控底物可利用性（小分子低聚糖的生成）及肠道微生物效应，实现米粉辅食与婴幼儿不同发育阶段生理需求的精准营养动态适配。本研究不仅为分龄化、功能化婴幼儿辅食的理性设计提供了可重复、可验证的实验依据与标准化工艺路径，也为推动婴幼儿营养研究从经验导向迈向机制驱动与精准干预提供重要科学支撑。
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