酶是一种对底物具有高度特异性的生物催化剂，能促进生物体内的各种反应，参与生物体生长发育以及个体繁殖等新陈代谢过程。大量研究表明，人体许多疾病都与体内生物酶调节作用相关[1-2]，如黄嘌呤氧化酶是尿酸代谢过程中一种重要的酶，黄嘌呤氧化酶抑制剂可以被用来治疗高尿酸血症以及痛风[3]；β-分泌酶抑制剂可用作治疗阿尔茨海默病[4]；脂肪酶参与脂代谢途径，胰腺脂肪酶抑制作用是减肥药物发现和筛选研究最为广泛的作用模式[5-6]；血管紧张素转换酶抑制剂可以有效防止器官纤维化，作为临床上五大类降压药之一，用于高血压的初始或维持治疗[7]。目前上市药物中，以酶为靶点的占比高达22%[8]。因此，酶作为一类非常重要的药物靶点，酶活性的测定及酶抑制研究在临床诊断中的应用十分广泛[9-11]。
随着物质生活条件的提升，糖尿病患病人数逐年上升，2017年中国糖尿病患者已达1.14 亿人，位居全球第一[12]。控制餐后血糖水平有助于减轻对胰岛B细胞的刺激，是预防及治疗糖尿病的一种有效手段[13]，而餐后血糖水平主要取决于碳水化合物被消化的速度及程度。α-葡萄糖苷酶作为一种重要的碳水化合物水解酶，通过水解α-（1，4）糖苷键释放游离的葡萄糖分子，对餐后血糖水平的高低起着关键作用，α-葡萄糖苷酶已成为预防和治疗糖尿病的主要靶酶之一，抑制其活性被认为是控制餐后血糖水平的有效方法[14]。目前，一些α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖、伏格列波糖等已经在医学上被用于治疗糖尿病。
中药及天然产物一直都是开发酶抑制剂新药和功能食品的重要来源之一[15-16]。玉米须具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、抗抑郁等多种生理活性，在食品工业中越来越受关注[17-18]，目前，已开发出一些玉米须功能性食品[19]。葛根作为药食同源物质，在古代就是治疗糖尿病的主要药材之一[20-21]。因此，玉须葛根复合茶可能是一种具有潜力的降血糖功能性食品，但对其具体的降血糖效果鲜有报道。
本文以α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为检测指标，测定玉须葛根复合茶及5 种单一组分提取物（玉米须、葛根、黄芪、苦瓜、栀子）对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，并结合动物实验，探究其降血糖机制和效果，以期为后续降血糖物质的筛选和功能食品的开发提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
α-葡萄糖苷酶（酶活50 U/mg）：美国Sigma 公司；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，pNPG）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、淀粉、链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、阿卡波糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米须、葛根、黄芪、苦瓜、栀子：山西振东制药股份有限公司。所用化学试剂均为分析纯。
8 周龄雄性小鼠：济南北检检测有限公司，[2024]伦审字（BJ20240109802）号，实验动物使用许可证为SYXK（鲁）20223 0032，实验动物生产许可证为SCXK（鲁） 2022 0006。
1.2 主要仪器与设备
ATY 224电子天平：日本岛津公司；HH-1电热恒温水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；TU-1900 紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；ST-3100酸度计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪：济南海诺实验仪器有限公司；114B摇摆式粉碎机：瑞安市永历制药机械有限公司；DZTW调温电热套：北京市永光明医疗仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 玉须葛根复合茶的制备
将玉米须、葛根、黄芪、苦瓜按质量比4∶2∶3∶1混合，混合均匀后进行粉碎，栀子单独粉碎。取10～50 目之间的物料，对混合均匀的玉米须、葛根、黄芪和苦瓜粉碎后的物料进行压缩，压缩后的物料在50 ℃干燥15～30 min，粉碎后过筛。取10～50 目之间的物料，称量后按5%质量分数加入栀子，混合均匀，即得成品。称取5.0 g成品置于无纺布中，封口，得到玉须葛根复合茶茶包（后文简称茶包）。
1.3.2 提取液制备
参照文献[22]的方法，用粉碎机将各单一组分中药（玉米须、葛根、黄芪、苦瓜、栀子）分别粉碎（茶包无需粉碎），精确称取5.0 g，按照料液比1∶15 （g/mL）加蒸馏水混合，索氏提取法回流煮沸1.5 h，冷却后抽滤，使用旋转蒸发仪蒸发至20 mL，得到茶包提取液和各组分提取液，置于4 ℃备用。
1.3.3 α-葡萄糖苷酶显色反应条件优化
α-葡萄糖苷酶可催化底物pNPG生成黄色产物对硝基苯酚，同时在405 nm处有最大吸收。通过单一变量法改变α-葡萄糖苷酶浓度或底物pNPG浓度，确定合适的显色反应条件。
酶浓度的优化：将不同体积（50、100、150、200 μL）浓度为1 U/mL的 α-葡萄糖苷酶溶液与100 μL 浓度为20 mmol/L 的pNPG溶液混合均匀，然后加PBS至4 mL，混合液中酶的最终浓度分别为0.012 5、0.025 0、0.037 5、0.050 0 U/mL。测量波长设置为405 nm，37 ℃反应30 min，每间隔2 min记录一次吸光度。
底物浓度的优化：将150 μL浓度为1 U/mL的 α-葡萄糖苷酶溶液与不同体积（20、50、100、150、200 μL） 浓度为20 mmol/L 的pNPG溶液混合均匀，然后加PBS至4 mL，得到的混合液中底物浓度分别为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L，37 ℃反应10 min，405 nm处测定吸光度。
1.3.4 α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定
参照文献[23]的方法并略有改动。用0.1 mol/L pH6.8的PBS作为缓冲液，配制1 U/mL α-葡萄糖苷酶和20 mmol/L pNPG溶液备用。将100 μL提取液与同体积α-葡萄糖苷酶溶液混合均匀，37 ℃ 孵育15 min后加入100 μL pNPG溶液，最后加PBS至4 mL，37 ℃反应10 min，测定405 nm处的吸光度。通过测定有提取液和无提取液时405 nm 处的吸光度，表征α-葡萄糖苷酶的活性，依据以下公式计算茶包提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（I，%）。
1.3.5 抑制类型分析
通过测定不同酶浓度下有抑制剂和无抑制剂时的反应速度，并绘制反应速率-酶浓度图，确定其可逆性。无抑制剂反应体系：200 μL 浓度为20 mmol/L的pNPG与不同体积1 U/mL α-葡萄糖苷酶混合，加PBS至4 mL，37 ℃反应10 min后测定吸光度；有抑制剂反应体系：将100 μL茶包提取液与α-葡萄糖苷酶溶液混合均匀，37 ℃ 孵育15 min，加入200 μL 20 mmol/L的pNPG溶液和PBS至4 mL，37 ℃反应10 min并测定其吸光度。
分别在有抑制剂和无抑制剂时的体系中，保持α-葡萄糖苷酶浓度不变，改变pNPG浓度（S），测定反应速率（V），绘制1/V-1/S双倒数曲线，根据交点位置和直线斜率确定其动力学特征及抑制类型。
1.3.6 动物实验
30只雄性小鼠，每6只为一组，随机分为5组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、茶包提取液高剂量组、茶包提取液低剂量组，适应性喂养7 d，除空白组外，其余各组使用STZ按 150 mg/kg单次腹腔注射，进行1型糖尿病建模，空白组注射生理盐水作为对照，连续注射7 d后进行空腹血糖测定，空腹血糖值大于11.1 mmol/L即为造模成功，不合格的小鼠补注射1次50 mg/kg STZ。
成功造模后进行灌胃给药，空白组与模型组使用蒸馏水灌胃，阳性对照组使用150 mg/kg 阿卡波糖灌胃进行给药，茶包提取液低剂量组灌胃200 mg/kg 茶包提取液，茶包提取液高剂量组灌胃400 mg/kg 茶包提取液。连续灌胃给药7 d。第7天灌胃前测空腹血糖值，灌胃15 min 后各组经口给予7.5%的淀粉水溶液，采用尾端取血方法，测定所有小鼠餐后 0（空腹）、1、2 h的血糖值。
1.4 数据处理
使用 Origin8.0 进行数据处理及绘图，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 α-葡萄糖苷酶显色反应条件优化结果
不同酶浓度下溶液吸光度随反应时间的变化见图1。
图1 不同酶浓度下溶液吸光度随反应时间的变化
Fig.1 The variation of absorbance with reaction time at different enzyme concentrations
由图1可知，反应10 min以内，酶浓度越大，单位时间内吸光度增大的幅度越大，即反应速率越大，当酶浓度达到0.037 5 U/mL时，反应在10 min之内基本完成。综合考虑反应速度和酶消耗量，选择酶浓度为0.037 5 U/mL。
溶液吸光度随底物浓度的变化见图2。
图2 溶液吸光度随底物浓度的变化
Fig.2 The variation of absorbance with substrate concentration
图2显示，随着底物pNPG浓度的增大，吸光度先增大后趋于平缓，pNPG浓度超过0.75 mmol/L时吸光度几乎不随底物浓度增大而增大，因此最终选择pNPG浓度为0.75 mmol/L。
2.2 抑制率测定结果
茶包提取液浓度对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率见图3。
图3 不同浓度茶包提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率
Fig.3 The inhibitory rate of α-glucosidase by different concentrations extract of teabag
图3显示，茶包提取液浓度对α-葡萄糖苷酶活性表现出一定的抑制作用，且抑制率随茶包提取液浓度的增大而逐渐升高。当抑制率达50%时所对应浓度即为半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），茶包提取液及5 种组分提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率及IC50值见表1。
表1 不同提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率及半数抑制浓度
Table1 The inhibitory rate and half inhibitory concentration of different extracts on α-glucosidase
项目茶包玉米须葛根黄芪栀子苦瓜抑制率/%50.2245.5480.3827.9779.7614.14 IC 50值/（mg/mL）6.556.781.8712.591.3220.46
从表1可以看出，5 种组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率大小顺序为葛根＞栀子＞玉米须＞黄芪＞苦瓜。进一步以抑制率对lg（提取液浓度）作图，通过线性拟合得到IC50值。从表1得出，葛根提取液和栀子提取液的IC50值较小，分别为1.87 mg/mL和1.32 mg/mL，说明其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最强。
茶包提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率虽然没有葛根和栀子单一成分高，但是中药往往是多途径、多靶点调节，除抑制酶活性外，也可能通过其他作用机制发挥降血糖作用。如黄芪多糖可升高胰岛素敏感指数，黄芪甲苷IV通过抑制脂质氧化来增加神经中谷胱甘肽过氧化物酶的活性，抑制红细胞中醛糖还原酶的激活，减少神经和红细胞中晚期糖基化终产物的积累，从而达到降血糖的目的[24-25]；玉米须黄酮能明显提高病鼠超氧化物歧化酶活力，增强胰岛的分泌功能，从而减轻高血糖反应[26]。玉须葛根复合茶中5 种组分进行配比后，可通过多途径发挥作用，实现协同降血糖功效。
2.3 酶促反应动力学分析
以反应速率对酶浓度作图，可以得到茶包提取液作为抑制剂时对α-葡萄糖苷酶活性的抑制类型，不同酶浓度下的反应速率见图4。
图4 反应速率随酶浓度变化
Fig.4 Reaction rates varies with enzyme concentration
由图4可知，以反应速率对酶浓度作图，得到两条近似通过原点的直线，且有抑制剂组直线的斜率低于无抑制剂组，说明茶包提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制为可逆抑制，即没有减少可用酶的数量，而是通过非共价键作用降低其活性。
为了进一步考察茶包提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制类型，以底物浓度倒数1/S为横坐标，反应速率的倒数1/V为纵坐标，1/V-1/S双倒数图见图5。
图5 不同浓度茶包提取液对α-葡萄糖苷酶酶促反应 Lineweaver-Burk 方程的影响
Fig.5 Effects of the different concentration puerarin extracts on α-glucosidase enzymatic reaction Lineweaver-Burk equation
如图5所示，在不同浓度提取液下，酶促反应的Lineweaver-Burk方程曲线相交于第3象限，斜率随着提取液浓度增大而增大，根据酶促反应Lineweaver-Burk方程的斜率和截距，可以计算出动力学常数米氏常数（michaelis constant，Km）和最大反应速率（maximum reaction velocity，Vmax）。
茶包提取液对α-葡萄糖苷酶酶促反应动力学常数的影响见表2。
表2 茶包提取液对α-葡萄糖苷酶酶促反应动力学常数的影响
Table2 Effects of extracts on kinetic constants of α-glucosidase enzymatic reaction
浓度/（mg/mL）斜率截距R2[mol/（L·min）]（mmol/L）茶包提取液线性拟合方程Vmax/Km/079.3338.400.9930.026 02.0660.3109.4660.730.9970.016 51.8020.6124.5573.270.9940.013 61.699
如表2所示，随着茶包提取液浓度的增大，酶促反应的Km由2.066 mmol/L减小至1.699 mmol/L，Vmax由0.026 0 mol/（L·min）减小至0.013 6 mol/（L·min），结合图5可知，茶包提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为可逆的竞争性混合抑制[23]。
2.4 降血糖效果
各组小鼠灌胃前后血糖值见表3。
表3 各组小鼠灌胃前后血糖值
Table3 Blood glucose values of mice in each group before and after gavage
血糖值/（mmol/L）项目空白组模型组阳性对照组茶包提取液高剂量组茶包提取液低剂量组灌胃前空腹5.4±1.213.8±2.414.0±2.413.8±1.913.6±1.5灌胃后空腹5.9±1.413.0±2.49.9±1.210.4±2.511.0±3.1餐后1 h6.2±1.315.7±2.88.7±1.012.7±4.713.7±4.0餐后2 h6.6±1.217.1±3.410.4±2.312.8±3.914.1±4.2
从表3可以看出，给药7 d后，阳性对照组和茶包提取液高、低剂量组空腹血糖值均有所下降，分别下降29.3%、24.6%、19.1%。茶包提取液高、低剂量组的餐后1 h和餐后2 h血糖值均低于模型组，说明玉须葛根复合茶在一定程度上可以起到降血糖作用。
3 结论
本研究表明玉须葛根复合茶及其单一组分对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，其中葛根和栀子的抑制率最高，抑制作用最为显著。进一步研究发现，茶包提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为可逆混合型抑制。动物实验表明，灌胃后高、低剂量组空腹血糖值分别下降24.6%和19.1%，说明玉须葛根复合茶在一定程度上可以起到降血糖作用。中药往往是多途径、多靶点调节，除抑制酶活性外，也可能通过其他作用机制发挥降血糖作用，如调控葡萄糖转运通路、刺激胰岛素分泌、调节自由基机制、调节肠道群落等。未来的研究可以进一步探究各组分之间的协同降血糖作用，将传统复配理论与现代手段相结合，进行多途径、多指标的综合研究，以期为功能食品的开发和糖尿病的治疗提供更多的参考和支持。
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