乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一种革兰氏阳性菌，是厚壁菌门的一部分，主要分为6个不同的科：乳酸杆菌科、链球菌科、明串珠菌科、肠球菌科、肉杆菌科和牛球菌科。LAB在代谢过程中可以产生多种有益的代谢产物，包括短链脂肪酸、细菌素、维生素和胞外多糖等[1]。由于其代谢产物的多功能性，LAB在食品和医疗等领域具有广泛的应用。在食品工业中，LAB可以将营养底物在发酵过程中转化为丰富的风味化合物或营养因子，并产生一些天然防腐剂，如有机酸，包括乳酸和乙酸等，有助于产生丰富的风味特征，提高最终产品的安全性并缩短发酵时间[2]。在医疗领域，LAB主要通过调节肠道菌群平衡、增强免疫功能和产生有益代谢产物来发挥作用。它们能缓解抗生素相关性腹泻、炎症性肠病、肠易激综合征等，并通过竞争性抑制病原菌维护肠道健康。此外，某些菌株可调节免疫反应，辅助治疗过敏和呼吸道感染[3]。
然而，在LAB产品的生产、加工、运输过程中，一些外界胁迫环境（渗透压、酸度、温度、氧化、胆盐等）会对菌体产生不良影响，造成细菌机械损伤、蛋白质变性和DNA损伤等，导致菌体活性降低甚至失活[4]。研究表明，生物膜能够为微生物细胞提供有效保护，使其免受有毒化合物和环境胁迫的损伤。这种特殊的生存模式显著增强了微生物在恶劣环境中的适应性和生存能力[5-6]。作为功能性复杂的微生物群落，生物膜可以附着在由多糖、蛋白质、DNA和脂质等多边聚集体形成的生物或非生物表面上，并通过胞外基质的动态组装构建三维立体结构，实现代谢产物交换、群体感应信号传递及环境胁迫抗性的协同增强等[7-8]。因此，深入研究LAB生物膜提高菌体抵抗外界环境胁迫的作用机制，对于优化食品加工工艺、提升发酵食品品质以及开发功能性益生菌制剂等具有重要意义。
本文综述生物膜在LAB环境胁迫响应中的机制，详细解析生物膜的结构组成（如胞外多糖、细胞外DNA和蛋白质）及其形成过程，深入探讨生物膜通过群体感应（quorum sensing，QS）和信号传导网络调控LAB抗胁迫能力的分子机制。此外，对促进LAB生物膜形成的策略（如碳源优化、封装技术和微生物共培养）进行总结，以期为其在食品发酵、益生菌制剂及生物医药等领域的实际应用提供参考。
生物膜是指细菌在生物或非生物体表面附着且生长繁殖，并被自身所产胞外多聚物包裹而形成的有膜状结构的菌落聚集体，包括细菌细胞（占干重的10%）和细胞外基质（占干重的90%）。细胞外基质主要包括胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）、细胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、蛋白质等，这些聚合物间存在的各种相互作用力（如静电力、表面疏水性和范德华力等）能够帮助生物膜细胞黏附在表面并稳定生物膜的三维结构，此外，生物膜表面还附着有大量的细胞碎片以及各种代谢物等[9]。
EPS是生物膜基质的主要成分，主要通过4种途径合成：翻转酶Wzx/聚合酶Wzy依赖途径、三磷酸腺苷结合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）转运蛋白依赖性途径、合成酶依赖性途径和细胞外合成途径[10]。LAB产生的胞外多糖按照组成成分可以分为两类，第一类是只包含同一种单糖组成的同多糖（homopolysaccharide，HoPS）；第二种是由多种类型单糖组成的杂多糖（heteropolysaccharide，HePS）。HoPS和HePS不仅在组成亚基上可能有所不同，而且它们的结构、链长、分支程度和糖键也可能有所不同[11]。LAB仅使用细胞外合成途径合成HoPS，此过程包含以下两个步骤。首先，聚合过程通过果聚糖酶、蔗糖酶和葡聚糖酶等的辅助，允许特定底物中的单糖转移到多糖链上，然后，聚合的HoPS链直接释放到细胞外环境。而主要通过Wzx/Wzy依赖性途径合成的HePS（LAB产生的大多数多糖）就更为复杂，并且涉及更多的酶和相互作用位点，在结构上显示出更大的可变性。EPS通常充当支架并将生物膜细胞固定在一起，赋予生物膜内聚力和黏弹性，促进细菌细胞附着在生物和非生物表面等[12]。此外，LAB产生的EPS还具有抗肿瘤、抗氧化、肠道屏障修复、抗菌、抗病毒和降低胆固醇等生物活性[13]。
eDNA是一种细胞外的核酸生物聚合物，是生物膜的主要成分，负责维持生物膜的结构。eDNA从生物膜的初始形成到解体都发挥着作用。eDNA可以借助EPS编织成絮状且不可分割的结构，还可以通过限制生物膜结构顶部细菌的外部流动来维持生物膜的细胞外基质特性[14]。在生物膜中，eDNA在细胞、载体、蛋白质和EPS之间的相互连接中起着重要作用。而且，eDNA通过细胞裂解、膜囊泡介导的释放、噬菌体诱导等机制释放。一旦释放到细胞外基质中，就会与EPS相互作用，增强基质的稳定性、结构的凝聚力和完整性[15]。此外，eDNA在生物膜形成、细胞黏附、细胞信号转导中发挥着重要作用，它通过维持生物膜基质结构的稳定性来稳定电荷、提供结构刚性，并保护生物膜基质免受宿主防御反应的影响[16]。
此外，蛋白质也是生物膜不可或缺的主要成分。细胞外蛋白的分子量为10～200 kDa，含有疏水性氨基酸。EPS基质的蛋白质成分通过与EPS和eDNA相互作用，帮助生物膜细胞黏附在表面并稳定生物膜的三维结构，还通过酶促反应降解多糖和蛋白质来帮助溶解细胞外基质[17]。
细菌生物膜的形成是一个多阶段级联过程，主要包括初始表面附着（含可逆吸附与不可逆附着两个阶段）、胞外基质分泌与生物膜成熟以及生物膜解离3个核心阶段[9]。在第一阶段，浮游细胞可逆和不可逆地附着在活体或非活体表面上，并转变为无柄状态。在可逆黏附阶段，细菌通过鞭毛、菌毛及少量的胞外多聚物或疏水作用等临时黏附于基质表面，由吸引力和排斥力调节，此时细菌与基质表面的结合并不牢固，很容易脱离基质表面，由黏附态转变为浮游态。随着胞外多聚物分泌量的增加，细菌向不可逆阶段发展，并且与基质表面的黏附将与表面建立永久结合，此时菌体与基质表面的结合变得十分牢固，形成一个有利于其生存和增殖的微生态位，附着在表面上的二维微菌落的存在代表了生物膜形成过程的早期阶段[8]。第二阶段是基质分泌和细胞膜的成熟。细菌开始产生EPS、eDNA和相关蛋白质进行自我保护，细菌黏附到基质表面后，胞外多聚物的分泌可黏结单个细菌形成微菌落[18]。大量的微菌落使生物膜变得紧密而厚实，在此阶段，生物膜的发育受基因以及信号分子（如环二聚体鸟苷3′，5′-单磷酸、环状腺苷3′，5′-单磷酸和环状二聚体腺苷3′，5′-单磷酸等）的调控。在此阶段，通过细菌增殖，形成细菌微克隆，细菌生物膜从不可逆附着的二维单层发展为成体生物膜的三维结构[19]。第三阶段是生物膜拆解。生物膜由于营养物质的消耗和外部环境的压力而分散，无基质包裹的生物膜细胞转变为浮游细菌，先前内化的细胞被释放出来，完成生物膜生命周期的循环，并可能在新位点启动新的生物膜形成。
LAB在食品发酵、工业生物技术、医学等领域应用广泛，使LAB保持较高的活性至关重要。而在整个生产、加工、运输、储藏过程中，乳酸菌经过分离、离心、冷冻或喷雾干燥等过程会面临许多环境胁迫（渗透压胁迫、酸胁迫、氧化胁迫、温度胁迫、胆盐胁迫等），从而对菌体本身造成损伤，导致活性降低[20]。例如，细菌暴露于高渗溶液会触发细胞脱水，导致膨胀压力降低，细胞体积和胞内离子浓度变化，原生质体与细菌细胞壁的分离，细胞膜上的磷脂分子数量发生变化，可能导致蛋白质间的相互作用改变[21]。另外，LAB的生长伴随着有机酸的持续积累，这通常会降低菌株活力，过量的H+会使细胞质酸化、DNA和蛋白质损伤、代谢紊乱等，最终导致细胞死亡[22]。同时，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生也通常发生在乳酸菌发酵的食品中，高氧水平会导致ROS的形成，当ROS积累时，会引起氧化应激[23]。此外，在实际生产过程中，由于产品的冷冻保藏、低温发酵产品的冷藏和原料巴氏杀菌等，使LAB不得不置于远远低于或高于最适生长温度的环境中，导致细胞稳态被破坏[24]。当LAB进入胃肠道时还会面临胆盐胁迫，胆盐会损伤膜蛋白、脂肪酸和细胞膜中磷脂，破坏细胞膜的完整性和大分子的稳定性，使蛋白质错误折叠或变性，导致LAB死亡[25]。值得注意的是，在食品发酵过程中，各种环境应激可能通过扰乱LAB生物膜结构和功能，对LAB的生长和代谢产生负面和致命的影响。
一般来说，生物膜的完整性在保护微生物免受各种应激条件的影响方面起关键作用。因此，维持生物膜的完整性与LAB的抗逆性密切相关。群体感应（QS）、环二聚鸟苷单磷酸（cyclic dimeric guanosine monophosphate，c-di-GMP）和环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）等信号通路是LAB生物膜对环境胁迫响应的核心调控网络，通过协调基因表达、代谢重编程及胞外基质合成等，动态调节生物膜的形成与功能[26]。
QS是生物膜形成过程中的一个重要双组分系统，是LAB生物膜响应环境胁迫的关键机制，主要通过自诱导剂调节菌体密度进行通信，从而显著影响生物膜特性[27]。一旦细菌附着在生物或非生物表面上，不同菌种之间会通过QS进行细胞间通讯。QS控制多种性状，例如附着在惰性或活性底物上、调节细胞外基质成分的产生、参与生物膜形成等，实现微生物相互作用中生物膜形成的调控，有助于群体的建立和维持[28]。QS是细菌细胞之间相互交流并协调对周围环境变化的一种通信机制，依赖于细菌细胞密度的基因表达调控系统，主要表现为信号分子的积累。其中自诱导剂（autoinducer-2，AI-2）是重要的信号分子，使细菌能够感知何时达到细胞阈值，从而触发整个微生物群落的协同生理功能[29]。AI-2被认为是一种“通用”的信号分子，用于不同物种之间的交流。在代谢过程中使用S-（5′-腺苷）-L-蛋氨酸作为甲基供体，产生中间产物S-腺苷同型半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH），该物质通过5′-甲基硫代腺苷/ S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（5′-methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase，Pfs）水解为S-核糖基同型半胱氨酸和腺嘌呤。S-核糖基高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteine lyase，LuxS）作为QS的关键酶，催化SRH分解为4，5-二羟基-2，3-戊二酮，进一步合成AI-2[30]。
AI-2信号传导是控制生物膜产生和适应环境应激的重要机制，提升了LAB的细胞存活率及膜转运系统功能，同时有助于促进LAB菌株的定殖、生物膜发育，调节细胞密度和改善细菌内聚力，从而增强菌株的抗胁迫性能[31]。有研究发现，外源添加AI-2后，植物乳植杆菌（Lɑctobɑcillus plɑntɑrum）细胞表面变得更加光滑，AI-2能够通过增加EPS的产量来促进细菌的生长和生物膜的形成。同时，lɑmC和ftsH基因表达的变化表明，多糖水解过程的调控发生了改变，也暗示了生物膜形成的潜力增强，显著提高Lɑctobɑcillus plɑntɑrum对胆盐的耐受性[32]。还有研究发现，在菌体生长过程中添加0.05 g/L尿嘧啶可以促进细菌代谢中生物膜的形成，AI-2信号分子强度和AI-2合成基因相对表达量显著增加，通过QS增强抗应变性，使乳酸片球菌（Pediococcus ɑcidilɑctici）和乳酸乳球菌（Lɑctococcus lɑctis）冻干存活率分别为99.04%和94.92%[33]。此外，有研究通过在植物乳植杆菌R（Lɑctobɑcillus plɑntɑrum R）中异源表达pfs和luxS来产生信号分子AI-2，旨在调节细胞膜结构并改善细菌乙醇耐药性。结果显示，在梯度乙醇浓度胁迫下，外源AI-2可显著改善Lɑctobɑcillus plɑntɑrum R的生长性能。进一步研究表明，磷酸转移酶系统的葡萄糖转运组分crr基因表达显著上调，进而提高菌体对乙醇胁迫的响应能力，最终显著促进生物膜的形成。同时，半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径的差异代谢物进一步证实了QS在增强Lɑctobɑcillus plɑntɑrum R对乙醇的耐受性方面的作用[34]。
碳水化合物作为主要的能量物质和细胞结构材料，在细菌生长和生态适应性中起关键作用，通过在培养基中外源添加碳水化合物，促进菌体细胞膜的产生、增强细菌的环境耐受性，并优化其代谢效率，从而显著提升生物量积累和工业应用潜力。研究发现，添加2%海藻糖促进了植物乳植杆菌LIP-1（L. plɑntɑrum LIP-1）中L-谷氨酸和半胱氨酸的代谢，进而促进谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成水平。GSH作为重要的非蛋白巯基化合物，它可以减轻羟基自由基对细胞膜上不饱和脂肪酸造成的氧化损伤，并能保护细胞膜的完整性，从而提高细胞干燥处理后的存活率。随着细胞内GSH含量的增加，自由基清除能力增强，通过海藻糖的代谢维持较低的活性氧水平，降低了试验组细胞膜中不饱和脂肪酸的氧化程度，从而提高了细胞对喷雾和冷冻干燥处理的抵抗力[35]。Yao等[6]在培养基中添加蔗糖，研究嗜盐四联球菌NZ9000（Tetrɑgenococcus hɑlophilus NZ9000）相关基因sɑcA和gɑlE的外源表达对Tetrɑgenococcus hɑlophilus NZ9000生物膜形成的影响。结果表明，在培养基中添加蔗糖改善了生物膜的形成、提高了生物膜细胞对冻干胁迫的抵抗力，并增加了Tetrɑgenococcus hɑlophilus NZ9000生物膜中EPS和eDNA的含量。还有研究使用低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）和蔗糖作为细菌真空干燥过程中的保护剂，发现非脱水细胞和糖保护细菌（均使用FOS或蔗糖）呈现凝胶状态（典型的高广义极化值），还通过拉曼光谱揭示了DNA构象变化，DNA构象与未脱水或糖保护的细菌相关，表明FOS和蔗糖作为保护性化合物，不仅在膜组织水平上起作用，而且还能够防止细胞内结构的构象改变[36]。
封装技术能够将活的LAB包裹在涂层材料的基质中，从而形成微米范围内的微胶囊或微球，微胶囊壁材可以作为物理屏障，为包裹的细胞提供一定的保护[37]。细菌细胞有两种形式：单（浮游）细胞和生物膜细胞。生物膜细胞为细菌提供了对多种环境胁迫更强的抵抗力，且与浮游细胞相比，封装的LAB生物膜产量更高，在食品加工、运输、储存中提高了菌体的活力[38]。例如，有研究将发酵乳杆菌UCO-979C（Lɑctobɑcillus fermentum UCO-979C）包埋在由海藻酸钠-葡聚糖组成的混合物中，在含有钙的MRS肉汤中培养12 h，促进生物膜的产生，将细菌暴露于盐水溶液60 d后，含有生物膜的细菌活菌计数高于浮游细菌[39]。此外，有研究成功在海藻酸盐凝胶珠中原位培养了戊糖片球菌（Pediococcus pentosɑceus）生物膜，形成生物膜的菌体在胃肠道环境（50%～74%）、冰箱储存（88.6%）以及pH2（30.7%）条件下的存活率都显著提高[40]。还有研究用富含鼠李糖半乳糖醛酸I（rhamnogalacturonan I，RG-I）的果胶对植物乳植杆菌GDMCC 1.140（Lɑctiplɑntibɑcillus plɑntɑrum GDMCC 1.140）和鼠李糖乳杆菌（Lɑctobɑcillus rhɑmnosus）进行封装，结果表明，富含RG-I的果胶微囊对益生菌的包埋率更高，并呈规则的球形。添加富含RG-I的果胶微囊表现出优于游离益生菌的效果，且生物膜的形成显著提高了微胶囊在各种环境胁迫中的抵抗力[41]。
在食品工业中，生物膜的形成使它们能够承受恶劣的环境条件，增加生物量并提高发酵食品的品质[42]。其中，细菌之间的竞争、合作或相互作用通常会影响生物膜的形成、结构、作用机制以及对不利环境压力的耐受性[43]。多种细菌经常在同一环境中共存，具有共代谢、共聚、水平基因转移、群体传感等模式，在大多数情况下，主要观察到生物膜中细菌之间的协同相互作用，这种相互作用关系改善了微生物群的整体功能、生理状态和共生环境，提高菌群对环境胁迫的耐受性[44]。有研究发现，植物乳植杆菌（L. plɑntɑrum）和发酵粘液乳杆菌（Limosilɑctobɑcillus fermentum）的协同相互作用促进了细菌的生长，形成了具有独特结构和功能特性的稳健双物种生物膜。此外，双物种生物膜在结构（如EPS组成、生物量和平均厚度）、代谢活性、表面覆盖率以及对胃肠液的消化抗性等方面均表现出独特性[45]。还有研究发现，马克斯克鲁维酵母G-Y4（Kluyveromyces mɑrxiɑnus G-Y4）、副干酪乳杆菌GL1（Lɑcticɑseibɑcillus pɑrɑcɑsei GL1）和瑞士乳杆菌SNA12（Lɑctobɑcillus helveticus SNA12）共培养可以增强菌体的生物膜形成能力，延缓发酵乳储存过程中活菌数量的下降，还能增加代谢产物（乳酸、乙醇和氨基氮）的释放，而且细菌共培养还促进了信号分子AI-2的释放，增强与生物膜形成相关的luxS基因的表达[46]。
本文系统阐述LAB生物膜的结构组成（EPS、eDNA、蛋白质）、动态形成过程（附着、成熟、解离）及其在胁迫保护中的分子机制，重点揭示了QS信号分子通过调控基因表达与代谢重编程提高LAB抗胁迫能力的核心作用，为靶向提升LAB的环境适应性奠定了基础。此外，还总结了碳源优化、封装技术与共培养策略在促进生物膜形成中的应用潜力。未来研究可聚焦于LAB菌株特异性生物膜调控网络的解析及合成生物学技术的应用，进一步推动LAB生物膜在食品发酵稳定性提升及益生菌功能强化中的重要作用。
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