肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一。目前，治疗该疾病的主要方法包括手术治疗和非手术治疗[1]。手术治疗虽然可以改善患者的生活品质、延长生存时间，但往往会复发和恶化。目前的疗效还不足以满足临床患者的要求[2-3]。因此，迫切需要开发一种更有效的低毒药物及其食源性功能活性物质，以改善肝癌患者的生活品质。
生物活性肽包含2～20 个氨基酸，毒性低、活性高、消化吸收容易，针对生物活性肽的研究也受到广泛关注[4]。食物蛋白质来源的食源性生物活性肽在降血压[5]、降尿酸[6]、抗炎[7]、抗菌[8]、降低胆固醇[6]、抗肿瘤[9]等疾病防治中具有显著功效。
汉麻是一种古老的一年生植物，起源于中亚，在欧洲许多地区作为纤维来源或纤维、种子双用途作物被广泛种植[10-11]。由于汉麻籽含有优质蛋白质和油脂，目前越来越受到广泛的关注[12-13]。在营养组成上，汉麻籽含有20%～25% 蛋白质、20%～30% 碳水化合物、25%～35% 油、10%～15% 的纤维和矿物质（如磷、钾、镁、硫、钙、铁和锌）。汉麻籽油含有大量的多不饱和脂肪酸及大量其他生物活性的成分，如生育酚、多酚和植物甾醇，具有降低胆固醇和血压等功效，甚至可预防心血管疾病和癌症[14-15]。汉麻籽油含有超过80%的不饱和脂肪酸，富含ω-6 和ω-3 必需脂肪酸（essential fatty acids，EFA），最佳质量比为2∶1～3∶1，符合人体吸收黄金比例[16]。汉麻籽蛋白中含有大量的精氨酸（一氧化氮的代谢前体）是正常调节血压所必需的化学物质。同时，富含硫的蛋白可以作为丰富的硫醇资源来配制营养丰富的食物，以提高人体抗氧化能力[17-24]。汉麻籽蛋白也是生物活性肽的优质资源，然而，目前关于汉麻籽多肽体内抗肝癌细胞作用的研究鲜见。
斑马鱼的繁殖周期短，产卵数量高，与人类基因组相比具有较高的基因组同质性，已被用作许多人类疾病的模型[25]。本研究通过建立肝癌Hep3B 细胞斑马鱼体内移植瘤模型，研究汉麻肽对斑马鱼体内肿瘤的生长抑制、肿瘤新生血管情况及其肿瘤病理切片变化，探究汉麻多肽的体内抗肝癌细胞作用，以期为应用于功能食品及特医食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
汉麻籽粕：黑龙江省科学院大庆分院功能食品实验室自制；木瓜蛋白酶（酶活力8×105 U/g）、中性蛋白酶（酶活力1.3×105 U/g）：无锡市雪梅酶制剂科技有限公司；Hep3B 细胞：美国模式培养物集存库；斑马鱼：南京新环检测科技有限公司；顺铂：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；T25 培养瓶：中国Nest Biotech 公司；六孔板：浙江贝兰伯生物技术有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素-链霉素双抗：美国Gibco公司。
1.2 仪器与设备
4800 Plus 飞行时间质谱仪：美国AB SCIEX 公司；SZX7 解剖显微镜、CKX53 倒置显微镜：日本OLYMPUS 公司；CP214 精密电子天平：美国OHAUS 公司；IM-300 显微注射仪、PC-10 拉针仪：日本Narishige 公司；AZ100 电动聚焦连续变倍荧光显微镜、A1R 共聚焦显微镜：日本Nikon 公司；VertA1CCD 相机：上海土森视觉科技有限公司；ST8 台式离心机、3111 CO2 培养箱：美国Thermo Scientific 公司；SW-CJ-215KS 双人单面净化工作台：上海苏净实业有限公司；KD2258 切片机：金华科迪医疗器械有限公司；L-8900 氨基酸自动分析仪：日本日立公司。
1.3 方法
1.3.1 汉麻多肽的制备与分离
采用3.0% 中性蛋白酶和0.4% 木瓜蛋白酶水解汉麻粕[料液比1∶5 （g/mL）、pH5.0、温度70 ℃、时间3 h]，制备汉麻多肽，酶解后95 ℃水浴灭酶15 min，离心（12 000 r/min、15 min），取上清液。采用截留相对分子量为1 000 Da 的膜过滤系统，将汉麻粕酶解液分离纯化，收集相对分子量小于1 000 Da 的汉麻多肽，真空冷冻干燥，-20 ℃冻存。
1.3.2 汉麻多肽的相对分子量分布及氨基酸组成测定
采用飞行时间质谱仪测定汉麻多肽的相对分子量分布范围，采用正离子、反射模式，取1 μL 汉麻多肽样品点至样品靶上，待自然干燥后，再取1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酰胺基酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，然后用相同方法在样品靶位的相邻靶位上点校准标准品。采用氨基酸自动分析仪测定汉麻多肽的氨基酸组成。
1.3.3 斑马鱼的饲养
斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水（电导率450～550 μS/cm、pH6.5～8.5、硬度50～100 mg/L CaCO3）中，由杭州环特生物科技股份有限公司繁殖，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2022-0004，饲养管理符合国际实验动物评估和认可委员会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC）（认证编号：001458）要求。
1.3.4 汉麻多肽对斑马鱼的最大耐受量测定
随机选取受精后3 d 的野生型AB 品系斑马鱼于六孔板中，30 尾/孔，容量为3 mL。除正常对照组外，其余各浓度组均给予汉麻多肽，35 ℃处理2 d，测定汉麻多肽对斑马鱼的最大耐受量（maximal tolerable dose，MTD）。
1.3.5 汉麻多肽对斑马鱼体内肝癌Hep3B 细胞生长抑制作用测定
建立野生型AB 品系斑马鱼肝癌Hep3B 细胞肿瘤移植模型，35 ℃培养至受精后3 d，挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，于6 孔板中饲养，每孔30 尾。给予不同浓度汉麻多肽（15.6、31.2、62.5 μg/mL），阳性对照组给予顺铂15.0 μg/mL，同时设置模型对照组，每孔容量为3 mL，35 ℃处理2 d 后，将斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用NIS-Elements D 3.20 高级图像处理软件采集数据，分析肝癌Hep3B 细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价汉麻多肽抗肿瘤生长功效。
1.3.6 汉麻多肽对斑马鱼肿瘤移植模型肠下血管新生抑制作用测定
采用显微注射的方式将CM-DiI 标记的人肝癌Hep3B 细胞移植到受精后2 d 的转基因血管绿色荧光Fli-1 品系斑马鱼卵黄囊内，建立人肝癌Hep3B 细胞斑马鱼肿瘤移植模型，35 ℃培养至受精后3 d，挑选移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，随机分配至6 孔板中，每孔30 尾。给予不同浓度汉麻多肽（15.6、31.2、62.5 μg/mL），阳性对照组给予顺铂15.0 μg/mL，每孔容量为3 mL，同时设置正常对照组和模型对照组。35 ℃处理1 d 后，将斑马鱼置于共聚焦显微镜下拍照，采集数据，分析肠下血管出芽率，评价汉麻多肽对肠下血管新生的抑制作用。
1.3.7 汉麻多肽对斑马鱼肿瘤模型组织病理结构的影响
建立野生型AB 品系斑马鱼肝癌Hep3B 细胞肿瘤移植模型，35 ℃培养至受精后3 d，挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，于6 孔板中饲养，30 尾/孔。给予汉麻多肽（15.6、31.2、62.5 μg/mL），阳性对照组给予顺铂15.0 μg/mL，每孔容量为3 mL，同时设置正常对照组和模型对照组，35 ℃处理2 d 后，对斑马鱼进行组织病理学苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.4 数据处理与分析
采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，统计学处理结果采用平均值±标准差表示。p＜0.05 表明差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 汉麻多肽相对分子质量分布
汉麻多肽的相对分子量分布结果如图1 所示。
图1 汉麻多肽的相对分子量分布
Fig.1 Relative molecular weight distribution of hemp peptides
由图1 可知，汉麻多肽中丰度较高的肽相对分子质量分布在600 以下，通过峰面积百分比计算不同肽段含量，高峰值序列肽分别占比14.80%（171.24）、8.21%（189.37）、1.59%（233.50）、2.89%（334.85）、9.46%（378.91），表明获得的汉麻多肽主要是由2～3 个氨基酸残基组成的寡肽。研究表明，寡肽更容易穿透小肠黏膜被人体吸收利用。因此，本研究制备的汉麻多肽可能会被人体有效吸收，从而发挥其生物活性功能。
2.2 汉麻多肽氨基酸组成
汉麻多肽的氨基酸测定结果如表1 所示。
表1 汉麻多肽氨基酸组成
Table 1 Amino acid composition of hemp peptides
保留时间/min 4.560 5.193 5.760 6.387 7.087 9.340 9.907 11.080氨基酸天冬氨酸（Asp）苏氨酸（Thr）丝氨酸（Ser）谷氨酸（Glu）脯氨酸（Pro）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）峰面积7 312 405 2 525 067 4 366 871 11 719 733 1 456 669 5 298 618 3 059 012 270 253总氨基酸中占比/%10.57 5.03 0.37 20.87 3.37 4.29 4.09 0.37
续表1 汉麻多肽氨基酸组成
Continue table 1 Amino acid composition of hemp peptides
保留时间/min 11.773 12.953 15.193 16.247 17.473 18.740 21.260 23.393 27.293氨基酸半胱氨酸（Cys）蛋氨酸（Met）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）组氨酸（His）精氨酸（Arg）峰面积4 153 649 1 097 237 2 505 951 5 514 783 1 525 531 4 100 644 2 397 470 1 568 089 7 630 290总氨基酸中占比/%5.20 1.34 3.52 7.58 3.08 4.39 4.00 2.34 13.18
由表1 可知，汉麻多肽中含量最高的氨基酸为谷氨酸（Glu）（20.87%），其次为精氨酸（Arg）（13.18%）、天冬氨酸（Asp）（10.57%）。混合肽中支链氨基酸（Val、Ile、Leu）含量为11.47%。
2.3 汉麻多肽对斑马鱼的最大耐受量
汉麻多肽对斑马鱼的最大耐受量结果如表2 所示。
表2 汉麻多肽对斑马鱼的最大耐受量结果
Table 2 Maximum tolerance of hemp peptides to zebrafish
注：-表示此剂量下斑马鱼死亡。
组别正常对照组汉麻多肽浓度/（μg/mL）0 62.5 125.0 250.0 500.0 1 000.0死亡数/尾0 0 3 30 30 30死亡率/%0 0 10 100 100 100表型未见明显异常与正常对照组状态相似其余较正常对照组状态差---
由表2 可知，汉麻多肽浓度在62.5 μg/mL 及以下时，对斑马鱼生长无毒副作用，因此选取15.6、31.2、62.5 μg/mL 汉麻多肽进行抗肿瘤评价实验。
2.4 汉麻多肽对斑马鱼体内肝癌Hep3B 细胞生长抑制作用结果分析
通过荧光显微镜观察汉麻多肽对肝癌Hep3B 细胞的生长抑制作用，如图2、图3 所示。
图2 汉麻多肽处理后斑马鱼人肝癌Hep3B 细胞荧光强度典型图
Fig.2 Typical fluorescence intensity of human liver cancer Hep3B cells in zebrafish treated with hemp peptides
图3 汉麻多肽处理后斑马鱼人肝癌Hep3B 细胞荧光强度
Fig.3 Fluorescence intensity of human liver cancer Hep3B cells in zebrafish treated with hemp peptides
与模型对照组相比，*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极显著（p＜0.01）。
由图2、图3 可知，与模型对照组相比，阳性对照组、汉麻多肽低剂量组（15.6 μg/mL）、汉麻多肽中剂量组（31.2 μg/mL）和汉麻多肽高剂量组（62.5 μg/mL）均对移植瘤具有抑制作用，其中阳性对照组、汉麻多肽中、高剂量组的抑制作用显著（p＜0.05、p＜0.01），阳性对照组、汉麻多肽低、中、高剂量组的抑制率分别为37.94%、19.10%、27.35%和34.25%。说明肝癌Hep3B细胞具有较强的肿瘤形成能力，汉麻多肽能显著抑制斑马鱼肝癌异种移植瘤的生长。
2.5 汉麻多肽对斑马鱼肿瘤模型肠下血管新生抑制作用结果分析
汉麻多肽对斑马鱼肿瘤模型肠下血管新生抑制作用结果如图4、图5 所示。
图4 汉麻多肽处理后斑马鱼肠下血管典型图
Fig.4 Typical subintestinal blood vessels of zebrafish treated with hemp peptides
箭头所指为血管出芽。
图5 汉麻多肽处理后斑马鱼肠下血管出芽率
Fig.5 Budding rate of subintestinal vessels in zebrafish treated with hemp peptides
由图4、图5 可知，斑马鱼的肠血管轮廓通常呈篮子状，没有额外的血管芽。新血管发芽主要由肿瘤引起。模型对照组的肠血管结构紊乱，肠血管直径增厚，肠下血管出芽发生数为21，肠下出芽率为70%。表明移植瘤斑马鱼诱导了肠道新生血管的形成，并成功地建立了该模型。与模型对照组相比，阳性对照组斑马鱼肠道血管结构和直径恢复，肠下血管出芽发生数为4，明显减少，说明顺铂对移植瘤斑马鱼肠道血管生成有明显抑制作用。汉麻多肽组与模型对照组相比，血管系统正常，直径更薄。汉麻多肽组的肠下出芽发生数分别为6、3、2，与模型对照组相比明显减少，肠下血管出芽率分别为20%、10%和7%。结果表明，汉麻多肽对肝癌Hep3B 移植瘤斑马鱼模型中的肿瘤新生血管有明显的抑制作用。
2.6 汉麻多肽对斑马鱼肿瘤模型组织病理结构的影响
汉麻多肽对斑马鱼肿瘤模型组织病理结构的影响如图6～图8 所示。
图6 斑马鱼整体HE 染色切片（100 ×）
Fig.6 Whole zebrafish HE stained slices （100 ×）
方框为局部放大部位，即肿瘤细胞移植部位。
图7 斑马鱼局部HE 染色切片（400 ×）
Fig.7 Local zebrafish HE stained slices （400 ×）
箭头所指为肿瘤细胞。
图8 斑马鱼局部HE 染色切片（局部放大）
Fig.8 Local HE zebrafish stained slices（ local amplification）
由图6～图8 可知，从整体组织结构上分析，正常对照组、模型对照组、阳性对照组和汉麻多肽组斑马鱼组织结构均发育正常，腹腔内见肝脏、肠和鱼鳔，未发现肿瘤转移和脏器的癌前病变。从细胞结构分析，斑马鱼模型组显示腹腔内肿瘤细胞较多。模型对照组肿瘤细胞多形性增加、核/细胞质比增加、病理性核分裂、印戒细胞均增加，具有侵袭性高、复发转移倾向、预后差的特点。阳性对照组在异种移植瘤斑马鱼腹腔内可见少量肿瘤细胞，肿瘤细胞体积和细胞核/细胞质比均增加。汉麻多肽组斑马鱼腹腔肿瘤细胞较少，肿瘤细胞核/细胞质比例增加，病理核分裂增加。结果表明，汉麻多肽可以明显减少腹腔内肿瘤细胞的数量，改善肿瘤细胞的异常形态。
3 结论
本研究通过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解工艺制备汉麻多肽，采用膜分离技术进行分离纯化，利用飞行时间质谱仪测定了汉麻多肽的相对分子量分布，主要分布在600 Da 以下。通过构建肝癌Hep3B 细胞斑马鱼肿瘤模型，研究汉麻多肽的抗肿瘤作用，结果表明汉麻多肽能够抑制斑马鱼体内肿瘤细胞生长，抑制肠下新生血管生成，病理组织切片显示汉麻多肽可以明显减少腹腔内肿瘤细胞的数量，改善肿瘤细胞的异常形态。
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