不同益生元对乳杆菌益生特性的影响

益生菌是肠道中的一种有益菌，主要包括乳杆菌和双歧杆菌[1]。乳杆菌可以调节和维护人和动物的肠道健康，其代谢物可为宿主提供营养物质，促进机体的生长，还可保护肠道细胞免受病原微生物的侵害，缓解血压、血脂升高，调节免疫功能等[2]。乳杆菌因具有优良的益生作用而被广泛应用在医药、食品等行业[3]。

益生菌只有在机体肠道中达到一定数量时才可以正常地发挥益生活性，从而对宿主产生一定的有益功效[4]。可溶性大豆多糖具有良好的抗淀粉老化、抗淀粉黏结、乳化和乳化稳定性、蛋白质稳定性、成膜性等优异的食品加工特性，同时还具有降血糖、降血脂、抗氧化和防癌等生理功能，在食品、医药、保健等行业有着广泛的应用[5]。菊苣中糖类成分菊粉和低聚果糖具有“膳食纤维”和“益生元”的双重属性，皆可作用于肠道调控脂质代谢，发挥降血脂、降血糖、调节肠道菌群、促进矿物质吸收等作用，二者在食品和保健品行业中有广泛应用[6]。大豆低聚糖是一种新型的低聚糖，是天然的健康营养素。大豆低聚糖难以被人体消化吸收，但能有效降低血脂水平，促进人体肠道中益生菌的快速生长，因此食用大豆低聚糖可以更好地帮助脂质代谢[7]。β-葡聚糖来源广泛，由葡聚糖单体构成，具有多种结构，因其侧链残基种类和数量的不同而具有多种生物学功能，如通过降低炎症相关基因表达及提高免疫因子的表达发挥调节免疫的作用[8]。

不同益生元对不同益生菌生长速度、益生特性的影响都会有差别。目前，关于特定益生元与益生菌之间的最佳匹配关系，相关研究仍较为有限。本文选择5种益生元（可溶性大豆多糖、低聚果糖、β-葡聚糖、天然菊粉、大豆低聚糖），利用高加索乳杆菌和嗜酸乳杆菌两种乳杆菌，研究不同益生元对不同乳杆菌增殖能力和益生特性的影响，以期对开发功效更好的益生菌和益生元复配产品提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

可溶性大豆多糖、低聚果糖、β-葡聚糖、大豆低聚糖、天然菊粉：河南万邦华工科技有限公司；嗜酸乳杆菌（ATCC 4356）、高加索乳杆菌（BNCC 190565）：北京创联生物技术有限公司；肠侵袭性大肠杆菌（ATCC 43893）、鼠伤寒沙门氏菌（CMCC 50013）：江南大学食品学院提供；三氯甲烷、硝酸钾、二甲苯、无水氯化锂（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

超净工作台（SW-CJ-2F）：苏州净化设备有限公司；恒温培养箱（THZ-032）：北京博彩生物科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS）：上海申安医疗器械厂；低速离心机（DT5-4B）：北京时代北利离心机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的活化与传代

MRS 培养基和LB 培养基的配制参考文献[9-10]。

乳杆菌的活化：将纯化的乳杆菌接种于MRS 固体培养基， 37 ℃培养48 h 后，选取单个菌落接种于MRS液体培养基中培养18 h，以2%（体积分数）的比例再次转接于MRS 液体培养基，继续培养18 h，备用。

试验用病原菌的活化：将纯化的病原菌接种于LB 固体培养基， 37 ℃培养48 h。挑取单菌落于LB液体培养基中继续培养18 h，以2%（体积分数）的比例再次转接于LB 液体培养基，使用摇床培养18 h（37 ℃，160 r/min），备用。

1.3.2 添加益生元培养基的配制

将5 种益生元分别以2% 的比例添加至MRS 液体培养基中，并另取一组MRS 液体培养基作为空白对照（MRS）。

1.3.3 产酸能力测定

以2%（体积分数）的比例将活化后的两株乳杆菌分别接种于MRS 液体培养基中，培养18 h（37 ℃，160 r/min），获取种子液，调菌液OD600=0.05±0.01，并按接种量1%接种于pH6.20 的6 种培养基，使其振荡培养18 h（37 ℃，160 r/min）后测定其pH 值[11]。

1.3.4 菌株生长曲线的测定

按1.3.2 方法培养菌株20 h，选取原MRS 液体培养基作为空白对照，每2 h 测定菌液的OD600 值[12]。

1.3.5 乳杆菌表面疏水性的测定

根据Fonseca 等[13]的方法略作改动。将活化后的两株乳杆菌分别按接种量1% 接种于1.3.2 中的6 种培养基，使用摇床培养18 h（37 ℃，160 r/min），离心（4 500 r/min，4 ℃，5 min）收集菌体。0.01 mol/L 无菌磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤两次，重悬于0.1 mol/L KNO3 溶液（pH6.20），调整菌悬液吸光值（600 nm）至0.50±0.01，记录此吸光值为 A0。取1 mL 二甲苯于试管中加入3 mL 菌悬液，静置10 min，旋涡2 min，室温静置20 min。倒入梨形分液漏斗进行分液，取出水相后测定其在600 nm 处吸光值，记为A1。以0.1 mol/L KNO3 溶液为空白对照组。疏水率（S，%）计算公式如下。

1.3.6 乳杆菌表面电荷的测定

根据Kos 等[14]的方法略作改动。将活化后的两株乳杆菌分别按接种量1% 接种于6 种培养基，在摇床（37 ℃、160 r/min）培养18 h，离心（4 500 r/min，4 ℃，5 min）收集菌体。0.01 mol/L 无菌PBS 洗涤两次，重悬于0.1 mol/L KNO3 溶液（pH6.20），调整菌悬液吸光值（600 nm）至0.50 ± 0.01，记录此吸光值为A0。取1 mL三氯甲烷于试管中，加入3 mL 菌悬液，静置10 min，旋涡振荡2 min，静置20 min。倒入梨形分液漏斗进行分液，将水相分离，测定其在600 nm 处吸光值。记为A1。以0.1 mol/L KNO3 溶液为空白对照组。三氯甲烷吸附率（R，%）计算公式如下。

1.3.7 乳杆菌自动聚集能力的测定

根据熊世进等[15]的方法略作改动。将活化后的两株试验乳杆菌分别按接种量1% 接种于6 种培养基，在摇床（37 ℃、160 r/min）培养18 h，离心（4 500 r/min，4 ℃，5 min）收集菌体。0.01 mol/L 无菌PBS 洗涤两次，重悬于无菌PBS，调整菌悬液吸光值（600 nm）至0.50±0.01，记录此吸光值为A₀。混匀菌悬液静置4 h，测定上清液在600 nm 波长处吸光值，记为A₄，以无菌PBS为空白对照。自动聚集率（Z，%）计算公式如下。

1.3.8 乳杆菌与两株致病菌的共聚集能力的测定

根据Xu 等[16]的方法略作改动。将活化后的两株试验乳杆菌分别按接种量1% 接种于6 种培养基，在摇床（37 ℃、160 r/min）培养18 h，同时将活化后的大肠杆菌和沙门氏菌在37 ℃恒温摇床培养18 h，离心（4 500 r/min，4 ℃，5 min）收集菌体。0.01 mol/L 无菌PBS 洗涤两次，重悬于无菌PBS，调整菌悬液吸光值（600 nm）至0.50±0.01，取2 mL 乳杆菌菌悬液分别与两株致病菌悬液等量混匀后，静置4 h，测定600 nm 下吸光值，记为A₂。同时分别取4 mL 致病菌悬液作为对照组，静置4 h，测定600 nm 波长处吸光值，分别记为A₀和A₁。共聚集率（G，%）计算公式如下。

1.4 数据处理

所有数据均3 次或以上平均试验计算得出平均值，使用SPSS 25 和Origin 2018 进行数据分析处理以及绘图，使用Duncan 法进行显著性分析，p＜0.05 时认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同益生元对乳杆菌产酸的影响

不同益生元对高加索乳杆菌及嗜酸乳杆菌产酸的影响见图1。

由图1（a）可知，5 种益生元的加入没有提升高加索乳杆菌的产酸能力，发酵20 h 时，对照组pH 值最低，为3.7。由图1（b）可知，低聚果糖、天然菊粉、β-葡聚糖均对嗜酸乳杆菌的产酸能力有明显的促进作用，发酵前14 h 时，β-葡聚糖的促进效果最强；发酵20 h时，低聚果糖促进产酸的效果最明显，最低pH 值为4.65；可溶性大豆多糖和大豆低聚糖未表现出促进产酸的促进作用。因此并不是每一种益生元都可以促进所有的乳杆菌产酸，不同的益生元对不同的益生菌促进作用也有很大的差别。吴领风等[17]发现在发酵过程中，添加低聚果糖显著提高了植物乳杆菌A33 的产酸能力，提高了酸角汁中的活菌数，提升了发酵酸角汁的风味。

2.2 不同益生元对乳杆菌增殖能力的影响

不同益生元对高加索乳杆菌及嗜酸乳杆菌生长速率的影响见图2。

由图2（a）可知，与对照组（MRS 培养基）相比，低聚果糖和天然菊粉对高加索乳杆菌未表现出明显的促进生长的效果，而且β-葡聚糖、可溶性大豆多糖和大豆低聚糖对高加索乳杆菌的生长还表现出了抑制作用。由图2（b）可知，在培养18 h 后，只有低聚果糖对嗜酸乳杆菌的增殖表现出了明显的促进作用，β-葡聚糖、可溶性大豆多糖和大豆低聚糖对嗜酸乳杆菌的生长均表现出一定的抑制作用。江耀伦等[18]研究结果表明低聚果糖在体外可以抑制大肠杆菌的生长，促进嗜酸乳杆菌的生长，适宜浓度为30 g/L。

综上，本试验中5 种益生元对高加索乳杆菌的产酸能力和增殖能力均没有促进作用，推测这株高加索乳杆菌不适合与益生元复配使用。低聚果糖对嗜酸乳杆菌的产酸和增殖能力都有明显的促进作用，说明与其他益生元相比，嗜酸乳杆菌更适合与低聚果糖复配使用。

2.3 不同益生元对乳杆菌表面疏水性的影响

乳杆菌表面的疏水作用力在非特异性黏附中发挥着关键的作用。黏附性较好的菌株其疏水性都较高[19]。不同益生元对乳杆菌表面疏水性的影响见表1。

由表1 可知，可溶性大豆多糖、低聚果糖和天然菊粉对嗜酸乳杆菌的表面疏水性都有一定的促进作用，其中低聚果糖的促进作用最强；β-葡聚糖对嗜酸乳杆菌的表面疏水性表现出较强的抑制作用。可溶性大豆多糖、大豆低聚糖、天然菊粉、β-葡聚糖对高加索乳杆菌的表面疏水性均未表现出明显的促进效果，而低聚果糖对高加索乳杆菌表现出显著的促进效果。不同益生元对不同乳杆菌表面疏水性的影响各有不同，受多种因素影响。综上所述，低聚果糖对两株乳杆菌的表面疏水性有显著促进效果。赵维俊等[20]研究发现影响菌体表面疏水性的因素有时间、温度、pH 值、浓度、离子和酶等，同样也影响菌体黏附能力，表面疏水率高的菌株一般具有较强的黏附能力。本试验发现，低聚果糖能促进乳杆菌的表面疏水性，可能有利于益生菌在肠道表面黏附和维持肠道菌群平衡[21]。

2.4 不同益生元对乳杆菌表面电荷的影响

乳杆菌的表面静电作用对乳杆菌的非特异性黏附极其重要。表面电荷强的乳杆菌对肠道黏膜也会具有较强的黏附能力[22]。不同益生元对乳杆菌表面电荷的影响见表2。

由表2 可知，经MRS 培养的两株乳杆菌对三氯甲烷都表现出了很高的吸附能力，吸附率在80% 左右。益生元加入后，大豆低聚糖、天然菊粉和β-葡聚糖对两株乳杆菌的表面电荷均表现出降低效果；可溶性大豆多糖对两株试验乳杆菌的表面电荷没有显著的影响。

2.5 不同益生元对乳杆菌自动聚集能力的影响

菌体的自动聚集即菌体自发聚集成团的现象。乳杆菌的自动聚集能力同其黏附能力和发挥益生作用是休戚相关的，乳杆菌只有通过自动聚集至足够多的数量才能最大化地发挥其益生功能[23]。不同益生元对乳杆菌自动聚集率的影响见表3。

由表3 可知，可溶性大豆多糖、大豆低聚糖、天然菊粉和β-葡聚糖对嗜酸乳杆菌的自动聚集能力均表现出促进作用，低聚果糖表现出很强的抑制效果。大豆低聚糖和β-葡聚糖对高加索乳杆菌自动聚集能力均有促进效果，可溶性大豆多糖和天然菊粉表现出抑制效果。

2.6 不同益生元对乳杆菌与致病菌共聚集能力的影响

乳杆菌与致病菌的共聚集是乳杆菌抵抗病原菌的重要机制之一，其共同形成的屏障可抑制病原菌的定殖，可使得机体加快对病原菌的清除，而减少胃肠道的负担[24-25]。不同益生元对乳杆菌与沙门氏菌共聚集能力的影响见表4。

由表4 可知，可溶性大豆多糖对嗜酸乳杆菌与鼠伤寒沙门氏菌的共聚集有很强的抑制效果，天然菊粉和β-葡聚糖有显著的促进效果[26]。可溶性大豆多糖对高加索乳杆菌与鼠伤寒沙氏门菌的共聚集有较强促进作用。

不同益生元对乳杆菌与大肠杆菌共聚集能力的影响见表5。

由表5 可知，β-葡聚糖对嗜酸乳杆菌与大肠杆菌的共聚集有促进效果，而可溶性大豆多糖和大豆低聚糖则表现出了抑制作用；可溶性大豆多糖、大豆低聚糖、β-葡聚糖而对高加索乳杆菌与大肠杆菌的共聚集表现出一定的促进作用，其中可溶性大豆多糖的促进作用最佳；低聚果糖表现出抑制作用[27]。综上所述，可溶性大豆多糖对高加索乳杆菌与致病菌的共聚集均有显著促进作用，而β-葡聚糖对嗜酸乳杆菌与致病菌的共聚集有显著的促进作用。

3 结论

本研究发现，在5 种益生元中，只有低聚果糖对嗜酸乳杆菌产酸、增殖能力以及表面疏水性均有显著促进效果，而均对两株乳杆菌的表面电荷没有促进作用。大豆低聚糖和β-葡聚糖对两株乳杆菌的自动聚集能力均表现出较强的促进作用。β-葡聚糖对嗜酸乳杆菌与鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌的共聚集均有显著促进效果。可溶性大豆多糖对高加索乳杆菌与鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌的共聚集均有显著促进效果。综合来看，5 种益生元对嗜酸乳杆菌和高加索乳杆菌的增殖能力和益生特性均不能起到全面正向促进的作用，但对单项指标的影响中各有所长。

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