发酵蔬菜是一种传统发酵制品,种类多样,风味独特,通常采用自然发酵的方法制成。经过发酵后,不仅能够延长蔬菜的保存时间,还能赋予蔬菜独特的风味和口感[1]。因做法简单,原料易得,许多国家都有传统发酵蔬菜,如德国酸菜、韩国泡菜、酸橄榄等。我国幅员辽阔,蔬菜原料种类多,气候差异大,不同地域的发酵蔬菜食品各具特色,代表性的有四川泡菜、东北酸菜、贵州酸汤等,这些发酵蔬菜成为了不同地域饮食文化的重要组成部分[2]。
随着对发酵食品的深入研究,人们发现发酵蔬菜的风味、质地等特征是在多种微生物的共同作用下形成的。微生物代谢消耗了蔬菜中的碳水化合物,产生多种代谢产物及风味物质,改变了蔬菜原有的风味及质地[3],使蔬菜具有爽口解腻、易于消化以及抗氧化等多种功效[4]。然而,目前大多数发酵蔬菜的生产采用粗放的作坊式生产,由此带来的发酵条件不稳定、杂菌污染等因素影响着产品的品质稳定及食品安全[5]。基于此,本文综述不同地区传统发酵蔬菜中微生物多样性情况,并对研究方法、优势微生物等情况进行分析,以期为传统发酵蔬菜品质提升提供参考。
传统培养法是通过选用合适的培养基对样品中可培养的微生物进行分离和培养,根据菌落和菌株形态特征、生理生化指标等对微生物进行归类,再对照伯杰氏手册、真菌鉴定手册等确定微生物种类的方法。采用传统培养法鉴定微生物,首先需要选择合适的培养基对样品进行稀释涂布,再将培养基置于适宜条件下培养,待长出菌落后,挑取不同形态的菌落进行平板划线纯化培养,直至获得纯培养物。得到纯种培养物后,通过革兰氏染色法,对菌株形态进行观察,通过革兰氏染色结果及细胞形态,可大致确定菌株类型。最后再经糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、伏普试验(V-P试验)等一系列生理生化试验,对照伯杰细菌鉴定手册等鉴定书籍确定微生物的种类[6]。
传统培养法原理简单,成本较低,可以获得目标菌株的纯培养物,已被广泛应用于微生物的分离鉴定。但其存在耗时较长、工作量大等缺点[7],且对生理生化试验的现象观察不够精确,可能引起误判。随着聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术等分子生物学技术的应用,可通过鉴定和比对,精准地确定微生物的种类。通过稀释涂布及平板划线获得纯培养物后,提取菌株DNA,采用对应引物对DNA 进行扩增,再对其进行测序可得到待测微生物的基因序列,在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库经生物大分子序列比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)对比后,即可得出待测菌株的种属信息。
黎蓓蓓等[8]采用传统培养法从果菜类蔬菜混合发酵样品中分离出31 株可培养的菌株,通过形态学鉴定,初步筛选得到乳酸菌、酵母菌等,应用分子生物学方法(细菌16S rRNA 和真菌ITS 序列分析)进行鉴定,通过BLAST 同源性对比,构建系统发育树,得到了链格孢菌(Alternaria alternata)、阿根廷乳酸杆菌(Lactiplantibacillus argentoratensis)、假酵母菌(Pseudozyma sp.)等菌株,且筛选得到的菌株均具有较好的发酵蔬菜应用潜力。徐素云等[9]以民间传统发酵茶饮料红茶菌为研究对象,通过传统分离培养技术,对红茶菌发酵液中可培养微生物进行分离鉴定。经过16S rDNA 测序,分离得到的优势菌包括木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)、腐烂苹果醋酸杆菌1480(Acetobacter malorum 1480)等7 株醋酸菌,拜耳接合酵母1482(Zygosaccharomyces bailii 1482)、布鲁塞尔德克酒香酵母1486(Dekkera bruxellensis 1486)等3 株酵母菌以及1株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
在传统培养法的基础上,PCR 技术的发展大大简化了传统培养的操作步骤,且使鉴定结果更加准确。然而,研究对象中并非所有微生物都能在人工条件下进行培养,因此,仅通过传统培养法的基本原理无法满足研究需要及人们对微生物群落的深入认识。
近年来,分子生物学在食品中的应用日渐广泛。高通量测序、转录组学、宏基因组学等技术的发展极大促进了人们对食品中微生物多样性的研究。高通量测序(high throughput sequencing,HTS)是一种非培养微生物分析技术,能在短时间内对几十万到几百万条微生物基因进行测序,并分析出微生物群落结构[10]。与传统培养法相比,高通量测序技术具有灵敏度高、读数长和效率高的特点,并且能同时检测可培养和不可培养微生物,已广泛用于白酒、陈醋、发酵茶等食品中微生物群落的组成和变化分析[11]。Yang 等[12]采用高通量测序技术分析不同陈化时间的铁观音中微生物群落的组成和演替,并通过相关性分析确定陈香物质与微生物群落的关系。研究发现陈化铁观音中细菌的丰富度和多样性整体水平高于真菌;且陈化0~23 年,随着陈化时间的延长,细菌群落的丰富度和多样性整体趋于增加,而真菌群落的丰富度和多样性整体趋于降低。通过对陈化过程中微生物多样性及陈香物质变化的研究发现,微生物的改变是茶叶陈香形成的关键因素。王云等[13]通过高通量测序技术解析米香型白酒的微生物群落多样性和演替规律,分别得出白酒在糖化、发酵过程中的微生物菌落结构和演替规律,并结合PICURSt2 预测得出各微生物群落的潜在功能。通过高通量测序在短时间内得出大量数据,结合生物信息分析工具,更好地明晰了白酒复杂的发酵过程及风味形成机理。何猛超等[14]运用高通量测序技术检测南洲大曲和茅台大曲的细菌多样性,经生物信息学分析,比较两者细菌群落结构的差异。结果表明,在门水平上,茅台大曲和南洲大曲中的优势菌门基本一致,然而细菌丰度存在较大不同。在属水平上,南洲大曲和茅台大曲的绝对优势菌属均为芽孢杆菌属(Bacillus),但两种大曲在细菌属水平上存在较大差异,南洲大曲的细菌群落多样性较高。除用于单一食品发酵过程分析外,高通量测序技术还广泛应用于两种及以上研究对象之间的差异分析,并可以此为依据指导产品生产及改良。
宏基因组学测序技术则是通过获取样品中全部基因序列解析微生物群落信息的方法,可以准确获取大量信息数据,已成为研究微生物多样性和群落特征的重要手段[15]。相比于高通量测序技术,宏基因组测序技术可以更全面地挖掘出微生物基因组信息,便于探究菌群的生物多样性、群落结构与产品特性的相互关系。王国峥等[16]基于宏基因组技术解析了3 个不同轮次高温大曲的微生物群落结构,挖掘不同轮次生产用曲的微生物多样性信息,并对其结构和功能之间的差异进行了分析,结果表明不同轮次大曲组成与发酵过程中碳水化合物及氨基酸的代谢过程密切相关。Yao等[17]通过元基因组学和气相色谱-质谱联用技术(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析康普茶自然发酵过程中微生物群与风味的关系。通过对发酵过程中挥发性化合物的测定及DNA 测序、基因功能注释等,发现康普茶的酸类、酯类和萜烯类等主要挥发性风味物质与驹形杆菌属(Komagataeibacter)、酵母菌属(Saccharomyces)、醋杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)等微生物密切相关。宏基因组技术的应用扩展了对微生物研究的范围,将微生物与发酵过程中物质变化联系起来,使由微生物带来的产品特性变化更加清晰。
酸菜是我国重要传统发酵蔬菜之一,主要流行于东北地区,食用历史悠久。东北酸菜的制作方法较为简单,以当季新鲜大白菜为原料,加入适量盐水,经过30 d 左右的自然发酵即可食用。因其口味酸,口感好,近年来在全国范围内均备受欢迎。研究表明,酸菜具有的降胆固醇、抗氧化、开胃促消化等功能与其中的微生物及其代谢产物息息相关。
酸菜主要依赖由容器、原料等带入的微生物自然发酵而成,受原料产地、品种等因素的影响,不同酸菜的菌群组成具有一定差异。植物内生菌(plant endophyte)是指在植物体内度过部分或全部生命周期且不会对宿主产生病害的一类微生物[18]。马明昊等[19]分析了大白菜中的内生菌多样性。测序结果显示,白菜内生菌共有299 个菌属,其中乳杆菌属(Lactobacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、发光杆菌属(Photobacterium)为优势菌属;于LB 培养基上可分离培养的菌属占16.7%。据此可推测,东北酸菜发酵过程中的乳酸菌主要来源于白菜内生菌。
Wang 等[20]采集了黑龙江省的27 个传统发酵酸菜样品,通过高通量测序,探究其微生物组成及与风味标志物的情况。结果表明,27 个东北酸菜样品中,乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属为主要优势微生物,酯类和酸类物质为主要挥发性化合物,且乳酸含量最高,挥发性化合物的产生与乳酸杆菌属、片球菌属(Pediococcus)和乳球菌属呈显著正相关。刘长根[21]研究了55份采自我国东北地区的酸菜样品,对每份样品的理化性质、可培养乳酸菌分离情况及微生物多样性进行了系统的分析。酸菜中共分离出28 种乳酸菌,共337 株,其中植物乳杆菌、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、小片球菌(Pediococcus parvulus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、乳酸杆菌亚种(Lactobacillus sp.)和朝鲜乳杆菌(Lactobacillus koreensis)为优势乳酸菌。各地区酸菜的菌群丰度及多样性均有差异,测序结果显示,属水平上,乳酸杆菌、片球菌和寡养单胞菌(Stenotrophomonas)是主要的菌属;在种水平,类短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)、棒状乳杆菌、小片球菌和戊糖乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)是东北酸菜中的主要优势菌,该结果与分离培养结果基本一致。桑建等[22]采集长春市10 户居民自制的酸菜样品,利用MRS-CaCO3 选择培养基分离乳酸菌菌株,经革兰氏染色、过氧化氢酶活性测定、16S rDNA 序列分析进行菌种鉴定,得到19 株乳酸菌,从中筛选了5 株产酸能力较强的菌株,经鉴定均为植物乳杆菌。Wang 等[23]重点研究了东北酸菜中的真菌组成情况。高通量测序结果显示,酸菜中的优势真菌为德巴利酵母(Debaryomyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia),其中假丝酵母是最重要的功能性真菌,与东北酸菜的安全性和品质特性呈正相关。贾晶晶等[24]制备了食盐含量分别为8% 和12% 的酸菜样品,研究不同食盐浓度下微生物种类及数量的差异。结果显示,食盐浓度与产品的微生物多样性具有相关关系,且8%食盐浓度下,酸菜样品中微生物多样性高。
目前已有许多酸菜发酵剂制备的研究,多采用分离自酸菜样品中的乳酸菌制成,如植物乳杆菌、明串珠菌等。搭配真菌制备的研究较少,而真菌在酸菜品质形成中同样扮演重要角色,因此将优势真菌用作发酵剂进行酸菜的规模化生产是未来的研究方向之一。
四川泡菜是我国著名发酵蔬菜之一,有“川菜之骨”的称号[25]。相比于东北酸菜,四川泡菜的原料更为多样,发酵时间更短,仅需5~7 d 即可将萝卜、豇豆等蔬菜原料加工成泡菜。成品鲜香,滋味独特,具有开胃、降低胆固醇和促进肠道菌群平衡等功效[26]。泡菜的制作多采用自然发酵、接种发酵和母水发酵3 种方式。
母水是泡菜发酵成熟后取出泡菜剩下的液体,以母水作为发酵剂循环使用的方式称为母水发酵。母水中不仅存在多种微生物,且含有微生物的代谢产物,因此采用母水发酵制成的泡菜具有更好的风味和口感。胡此海等[27]采集了30 份一年以上的泡菜母水,通过高通量测序技术分析不同母水样品中的微生物群落结构,并进行多样性分析。结果表明,在属分类水平上,泡菜母水中的细菌菌属主要是乳杆菌属和片球菌属。属水平上,真菌菌属主要是毕赤酵母及哈克斯坦酵母(Kazachstania)。这些优势菌与泡菜的有机酸含量、风味物质含量等理化指标显著相关。
除温度、盐浓度、季节等条件导致的泡菜微生物菌群结构的不同外,泡菜中的微生物多样性与蔬菜原料种类也有很大关系。钱杨等[28]选取萝卜、豇豆、辣椒以及3 种蔬菜混合制作4 种不同的四川泡菜,并利用高通量测序技术分析比较不同蔬菜原料四川泡菜中微生物多样性差异。结果显示,乳酸菌属是4 种泡菜中主要的细菌属,辣椒泡菜中微生物种类最为丰富,共检测到234 个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU);豇豆泡菜中微生物种类最少,检测到134 个OTUs。由于微生物多样性的差异,也导致4 种泡菜风味及pH 值的不同。随着川菜产业的快速发展,小规模泡菜生产已不能满足市场需求,大规模工业化生产已成为目前四川泡菜生产的主流。植物乳杆菌是目前工业化泡菜中使用最普遍的细菌,然而不同工厂生产的泡菜风味存在差异。Wang 等[29]采用培养法和非培养法分析泡菜中的优势菌。结果表明,泡菜发酵中的优势菌大多是可培养的。发酵初期泡菜中存在的优势菌有肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)及魏斯氏菌(Weissella);发酵中期出现植物乳杆菌、短乳杆菌等菌属;发酵后期泡菜中优势菌以植物乳杆菌为主。唐丽等[30]分析了四川地区2 个不同工厂的工业萝卜泡菜发酵过程中真菌群落多样性。工业化泡菜发酵过程中,随着总酸浓度不断增加,pH 值和草酸含量逐渐下降,盐度先逐渐升高后缓慢降低。高通量测序结果显示,泡菜中亚硝酸盐、乙酸、乳酸、pH 值等差异与发酵过程中真菌群落的演替呈正相关。属水平上,假丝酵母属在两厂发酵过程中相对丰度均先减后增,毕赤酵母属是工厂A 发酵初始的特有优势真菌属,梗孢酵母属(Sterigmatomyces)是工厂B 发酵初始的特有优势真菌属。Cao 等[31]基于单分子实时测序(single-molecule real-time sequencing technology,SMRT)技术对不同酸度的四川泡菜盐水中细菌和乳酸菌构成进行解析,结果表明,泡菜盐水样品的酸度指标(pH 值、总酸、乳酸和乙酸含量)与其优势菌种之间具有显著相关性。总酸与耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)呈正相关,乳酸含量与布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)呈显著正相关(P<0.01),且酸度越大,盐水中细菌多样性越低。
酸汤是贵州少数民族地区的一种传统发酵食品,具有解油腻、清热解暑、预防消化道疾病、降低胆固醇等功能。常见的酸汤主要分为红酸汤和白酸汤两种,红酸汤是以番茄、辣椒等为主要原料,经自然发酵而成的;白酸汤则是以米汤为主要原料,加入“老酸汤”发酵而成[32]。二者滋味不同但都深受当地人民喜爱,可用于酸汤鱼、酸汤牛肉、火锅底料等多种食品的制作。红酸汤的发酵分为两轮,第一轮发酵是将当地野生西红柿、辣椒等原料自然发酵1~3 个月左右制成半成品;将该半成品与传统老酸汤按一定比例混合发酵即为第二轮发酵。近年来对贵州酸汤的研究逐年增多,研究表明,红酸汤富含多种有机酸、矿物质、维生素、氨基酸等物质,又保留了原料中番茄红素、辣椒素、多酚等功能活性物质[33],具有多种保健功能。与酸菜、泡菜相比,酸汤的发酵时间较长,耗时1~12 个月,这一因素导致酸汤的生产存在杂菌污染、生产效率低、产品品质不稳定等问题。
陆敏等[34]从企业采集6 份未添加防腐剂的发酵8~9 个月的成熟红酸汤半成品(只经过一轮发酵),对其进行pH 值、总酸、可溶性固形物含量等理化指标的检测,并利用Illumina MiSeq 高通量测序技术解析红酸汤样品的菌群多样性。科水平上,6 个红酸汤样品共检测出193 个细菌科、132 个真菌科,乳杆菌科(Lactobacteriaceae)的乳酸杆菌是发酵红酸汤中的主要优势细菌;丛赤壳科(Nectriaceae)、曲霉科(Aspergillaceae)、线虫草科(Ophiocordycipitaceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)和酵母科(Saccharomycodaceae)为丰度前5 的主要优势真菌。Wang 等[35]对成品贵州酸汤的菌群结构进行分析发现,属水平上,所有样品的优势菌属均为乳酸杆菌;优势真菌有毕赤酵母、假丝酵母、哈克斯坦酵母。通过对风味物质的分析发现,乳酸杆菌过量会抑制某些风味物质的形成。李娟[36]探究了红酸汤发酵不同阶段的微生物多样性。结果表明,在细菌属水平上,乳杆菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、普罗维登斯菌属(Providencia)为一轮发酵的优势菌属;二轮发酵中,乳杆菌属丰度显著上升,由28.67% 升高至50.11%。在真菌属水平上,传统红酸汤一轮发酵优势真菌属为毕赤酵母(65.89%)、地丝菌属(Geotrichum,30.56%),二轮发酵优势菌属丰度发生变化,地丝菌属丰度降低,酒香酵母属(Brettanomyces)出现,成为二轮发酵的特有真菌属。通过双向正交偏最小二乘法分析鉴定了产生风味的功能核心菌群包括11 个细菌属和18 个真菌属,乳酸菌作为传统红酸汤中最主要的细菌属,与11 种关键挥发性风味物质呈显著正相关,并与部分刺激性气味的挥发性风味物质呈显著负相关;优势真菌属毕赤酵母、Geotrichum 与14 种关键风味物质呈显著正相关,进一步验证了优势菌对挥发性风味物质形成的重要性,也说明红酸汤发酵及风味形成是乳酸杆菌和酵母菌共同发酵的结果。肖甜甜等[37]以白酸汤为研究对象,采用Illumina MiSeq 高通量测序分析白酸汤中微生物的群落组成及多样性,并结合传统可培养技术对白酸汤中优势微生物进行筛选。结果表明,白酸汤与红酸汤的中主要优势微生物略有差异。白酸汤的优势菌属为乳酸杆菌属、醋酸杆菌属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。
酸笋是以大头笋、麻竹笋等新鲜竹笋为原料,浸泡于山泉水、清水或低浓度盐水中,经自然发酵得到的一种传统发酵蔬菜。经发酵处理的酸笋不仅风味多样,而且口感爽、脆、酸、嫩,微生物资源也更为丰富,产品品质得到显著提高,感官体验也更优[38]。酸笋作为广西特色食品螺蛳粉的主要配料,近年来随着预包装食品产业的发展而闻名全国,并出口至全球20 多个国家和地区[39]。
Xu 等[40]研究了自然发酵酸笋中的微生物群落变化及其与酸笋品质的相关性。结果表明,酸笋中的优势细菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria);属水平上,优势微生物主要是细菌,包括乳酸菌属、魏斯氏菌属、乳球菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属(Serratia)等。发酵过程中酸笋的理化性质和主要挥发性化合物与微生物群落的数量和类型密切相关。Chen 等[41]研究了酸笋发酵液中的微生物组成,研究结果与Xu 等[40]相似,主要菌属为乳杆菌属、魏斯氏菌属和乳球菌属。Guan 等[42]利用Illumina MiSeq 测序得出在酸笋发酵过程中,厚壁菌门丰度持续增长,相对丰度最高为98.97%,其中乳杆菌属持续为优势菌种。而在发酵后期,乳球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc genus)、肠杆菌属和魏斯氏菌属的丰度普遍降低。钟源等[43]采用传统培养法分离酸笋的优势乳酸菌并开发了广西酸笋的纯种发酵工艺。从3 种酸笋样品中分离得到40株乳酸菌,包括老面乳杆菌(Lactobacillus zymae)、斯比氏乳杆菌(Lactobacillus spicheri)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、植物乳杆菌等。筛选出具有亚硝酸盐降解能力及产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能力的3 株菌复配作为纯种发酵菌株,可在保留酸笋独特风味的基础上,研制出低亚硝酸盐且富含GABA 的酸笋产品,既可以提高酸笋的食用价值和营养价值,又符合当前大健康的时代理念。
不同发酵蔬菜中优势微生物种类如表1 所示。
表1 不同发酵蔬菜中优势微生物种类
Table 1 Dominant microbial species in different fermented vegetables
注:-表示文献中未记载。
发酵蔬菜种类酸菜产地东北优势真菌德巴利酵母(Debaryomyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia)优势细菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、小片球菌(Pediococcus parvulus)、戊糖乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、魏斯氏菌(Weissella)乳杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、普罗维登斯菌属(Providencia)、醋酸杆菌属(Acetobacter)参考文献[20-23]泡菜四川毕赤酵母(Pichia)、哈克斯坦酵母(Kazachstania)、梗孢酵母属(Sterigmatomyces)[27-31]酸汤贵州[34-37]酸笋广西魏斯氏菌(Weissella)、乳球菌(Lactococcus)、肠杆菌(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、老面乳杆菌(Lactobacillus zymae)、斯比氏乳杆菌(Lactobacillus spicheri)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、植物乳杆菌毕赤酵母(Pichia)、哈克斯坦酵母(Kazachstania)、假丝酵母(Candida)、地丝菌属(Geotrichum)、酒香酵母属(Brettanomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)-[40-43]
传统发酵蔬菜作为我国各地传统美食的重要组成部分,不仅是延长蔬菜保存期、开发新产品的重要加工方式,更是我国微生物研究的宝贵菌种库。发酵能赋予蔬菜原料独特的风味口感,还能为人体健康带来一定好处。然而,目前发酵蔬菜的作坊式生产方式已无法适应饮食文化和行业的发展。现阶段的研究表明,直投式发酵剂发酵等方式有助于减少自然发酵带来的不确定因素,减少杂菌污染,并能在很大程度上控制产品品质,确保其稳定。但与自然发酵蔬菜产品相比,采用纯种发酵的方法制作发酵蔬菜无法完全还原其感官品质。基于此,未来可在蔬菜发酵过程中微生物群落演替、发酵蔬菜优势微生物与产品风味及质地等重要品质指标之间的关系、复合发酵剂优化、发酵蔬菜产品标准化等方面对传统发酵蔬菜进行深入探究,从而进一步提升产品品质,完善质量管理体系,促进发酵蔬菜行业高质量发展。
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Research Progress on Microbial Diversity in Traditional Chinese Fermented Vegetables