糖皮质激素是机体内极为重要的调节分子,它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能起着重要调节作用,是临床上使用最为广泛且有效的抗炎和免疫抑制剂,也是食品中兴奋剂残留的主要来源之一[1-5],这些残留的药物给运动员们带来了食源性兴奋剂的潜在风险。
世界反兴奋剂机构（World Anti-Doping Agency,WADA）发布的《世界反兴奋剂条例》中的禁用清单明确规定了九大类具有镇静、抑制或掩蔽功能的禁用药物,包括16 种糖皮质激素。欧盟、日本以及国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission,CAC）都制定了食品中部分糖皮质激素残留的限量标准[6-7]；GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》指出地塞米松在牛、猪、马的肌肉、肝、肾以及牛奶中的最大残留限量分别为肌肉1.0 μg/kg,肝2.0 μg/kg,肾1.0 μg/kg,牛奶0.3 μg/kg。目前,我国相关的检测标准有农业部1031 号公告—2—2008《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法》、GB/T 21981—2008《动物源性食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》等,但对比WADA 禁用清单中列出的糖皮质激素类兴奋剂,现有检测标准覆盖面不全,尚未制定如地夫可特、氟尼缩松、氟氢缩松、泼尼卡酯、哈西奈德、安西奈德、地索奈德等物质在食品中的限量和检测标准。因此建立食品中糖皮质激素类兴奋剂药物残留的方法尤为重要,不仅能为体育赛事食品安全保障提供技术支持,而且能降低食源性兴奋剂残留的风险。
糖皮质激素的主要检测方法有酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法[8]、高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis,HPCE）法[9-10]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法[11-12]、超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF MS）法[13]、超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography coupled with high resolution time-of-flight mass spectrometry,UPLC/HRTOF MS）法[14-15]、液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（liquid chromatography quadrupole electrostatic field orbital trap high solution mass spectrometry,LC-Q Orbitrap HRMS）法[16]、液相色谱-串联质谱法[17-21]等。ELISA 法操作简单快速、灵敏度高,但易出现假阳性,需要采用液相色谱-串联质谱法进行确证；HPCE 法操作简便、成本较低,但灵敏度低、易受基质干扰、不能满足实际检测需求；HPLC 法很难实现分子结构相似糖皮质激素的完全分离,且会受基质影响出现假阳性；UPLC-Q-TOF MS、UPLC/HRTOF MS 和LC-Q Orbitrap HRMS 分辨率更高、采集速率快,适用于高通量筛选检测痕量物质,但仪器价格昂贵,不能大范围普及使用；超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）法具有灵敏度高、选择性好、定性定量准确的优点,能同时检测多种目标化合物,适用于复杂基质中的痕量物质分析。为了降低基质干扰、保证仪器的稳定性,需要选择净化效果良好的前处理方法。传统的固相萃取前处理方法过程复杂、操作费时,QuEChERS 法具有快速、操作简单、成本低廉的优势,能同时净化多种化合物,溶剂使用量少、回收率和准确度较好,已成为广泛使用的样品前处理方法[22-27]。QuEChERS 法的净化剂有较大的选择和探究空间,通过改变净化剂的配比可有效降低基质效应且不会对目标化合物产生明显吸附[28-29],QuEChERS 结合UPLCMS/MS 法高效省时、普适性强,能够有效解决食品基质复杂的问题,满足食品中糖皮质激素类兴奋剂的检测需求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
地夫可特（纯度99.6%）、氟尼缩松（纯度99.1%）、哈西奈德（纯度99.5%）、地索奈德（纯度98.3%）标准品：上海安谱实验科技股份有限公司；氟氢缩松（纯度99.85%）、泼尼卡酯（纯度99.3%）、安西奈德（纯度98.9%）标准品：德国Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：德国默克公司；乙酸乙酯、乙醚、正己烷、氯化钠（均为分析纯）：广州化学试剂厂；甲酸（色谱纯）：美国Sigma 公司；QuEChERS 盐包A（6 g无水硫酸镁+1.5 g 醋酸钠）、QuEChERS 盐包B（4 g 无水硫酸镁+1 g 氯化钠+1 g 柠檬酸钠+0.5 g 柠檬酸氢二钠）、QuEChERS 净化管A[900 mg 无水硫酸镁+150 mg N-丙基乙二胺（primary-secondary amine,PSA）]、QuECh-ERS 净化管C（1 200 mg 无水硫酸镁+400 mg PSA+400 mg C18）、陶瓷均质子：美国Agilent 公司；QuECh-ERS 净化管B（900 mg 无水硫酸镁+150 mg PSA）：广州太玮生物科技有限公司；0.22 μm 有机系滤膜：天津津腾实验设备有限公司；Accucore C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.6 μm）、Accucore Biphenyl 色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.6 μm）、Accucore PFP 色 谱 柱（100 mm×3.0 mm,2.6 μm）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
猪肉、牛奶、牛肉、鸡肉、猪肾、鱼肉、鸡蛋、蜂蜜和蛋白粉：市售。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱-质谱联用仪（Triple Quad 5500+）：美国AB SCIEX 公司；MS3 数显型漩涡混合器：德国IKA 公司；Direct Pure UP10 型超纯水机：中国重庆艾科浦科技有限公司；KDC-1044 型低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；Tnc5200 样品粉碎机：美国Vitamix 公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
分别称取10 mg 7 种糖皮质激素（地夫可特、氟尼缩松、哈西奈德、地索奈德、氟氢缩松、泼尼卡酯、安西奈德）标准品于10 mL 容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,配制成1 000 mg/L 的标准储备液；分别移取各糖皮质激素标准储备液100.0 μL 至10 mL 容量瓶,用甲醇稀释定容至刻度,得到浓度为10.0 mg/L 的7 种糖皮质激素混合标准中间液,保存温度为-18 ℃以下。
将上述7 种糖皮质激素混合标准中间液按比例用乙腈稀释成混合标准工作液,浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100.0 μg/L,现用现配。
1.3.2 样品前处理
取猪肉、牛肉、鸡肉、猪肾、鱼肉、鸡蛋、牛奶、蜂蜜和蛋白粉样品可食部分,固体和半固体样品均质、液体样品摇匀,液体样品称取10 g、肉类样品称取5 g、固体粉末样品称取1 g（精确至0.01 g）于50 mL 塑料离心管中,并加入一颗陶瓷均质子,肉类样品加入5 mL 水,固体粉末样品加入10 mL 水,涡旋混匀。加入20 mL乙腈,涡旋振荡5 min,加入QuEChERS 盐包,涡旋振荡5 min,于3 500 r/min 离心2 min。移取上清液6 mL至QuEChERS 净化管,涡旋5 min,静置5 min 后取上清液过0.22 μm 有机系滤膜待测。
1.3.3 液相色谱条件
色 谱 柱：Accucore Biphenyl 色 谱 柱（100 mm×2.1 mm,2.6 μm）；柱温：30 ℃；流动相：A 相为0.1% 甲酸水,B 相为0.1%甲酸乙腈；流速：0.3 mL/min；进样体积：10 μL；梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure
时间/min 0.0 6.0 6.5 7.0 7.5 0.1%甲酸水/%95 15 15 95 95 0.1%甲酸乙腈/%5 85 85 55
1.3.4 质谱条件
电喷雾离子源（electron spray ionization,ESI）,正离子模式扫描,多反应监测模式（multiple responese monitoring,MRM）检测；离子源电压5 500 V；离子源温度550 ℃；7 种糖皮质激素的扫描离子对、去簇电压、碰撞电压等质谱参数见表2。
表2 7 种糖皮质激素的质谱参数
Table 2 Mass spectrum parameters for seven glucocorticoids
注：*为定量离子。
化合物地夫可特氟尼缩松氟氢缩松泼尼卡酯哈西奈德安西奈德地索奈德母离子（m/z）442.2 435.2 437.2 489.2 455.2 503.2 417.2子离子（m/z）141.9*,123.9 321.2*,391.0 361.0*,285.2 380.9*,114.8 121.0*,104.9 338.9*,321.0 323.3*,225.1去簇电压/V 100 100 100 100 100 100 100碰撞电压/V 40,40 20,16 26,30 13,25 38,63 22,23 17,30
1.4 数据处理
利用液相色谱-串联质谱仪软件（SCIEX Analyst Software 1.7.1）和WPS 2019 软件对试验数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 前处理条件优化
2.1.1 提取条件优化
由于糖皮质激素易溶于有机溶剂[15],提取溶剂选择乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、正己烷对比效果,回收率结果见图1。
图1 不同提取溶剂对回收率的影响
Fig.1 Effect of different solvents on recovery
由图1 可知,用乙腈提取时7 种目标物的回收率为90.4%～108%,提取效果最好,且乙腈提取的蛋白质、脂肪等杂质较少,能够降低基质干扰；乙酸乙酯提取的回收率为80.8%～106%,但涡旋提取时样品呈团状,检测阳性样品时可能会有目标物被包裹导致萃取效果下降；甲醇提取时容易乳化,甲醇与乙醚的提取回收率均低于80%,正己烷几乎未提取出目标物。
乙腈中加入适量甲酸有利于沉淀蛋白提高萃取效率[20],试验配制了0.1%～2.0%（体积分数）的甲酸乙腈溶液以及纯乙腈对比提取效果,结果如图2 所示。
图2 不同浓度酸化乙腈对回收率的影响
Fig.2 Effect of acidified acetonitrile at different concentrations on recovery
由图2 可知,乙腈和0.1% 甲酸乙腈提取效果接近,且乙腈对7 种糖皮质激素的回收率比较平均,2.0%甲酸乙腈的回收率较低,1.0% 甲酸乙腈的回收率最低。从试验现象来看,不同体积分数甲酸乙腈对蛋白质的沉淀效果都较好,提取液都呈澄清状态,结合操作便利性考虑最终选择乙腈作为提取溶剂。
牛奶、饮料样品含有较多水分,可以直接加提取溶剂提取,而肉类样品直接加入乙腈提取会使表面蛋白快速变性,导致分散性变差,试验对比了肉类样品不加水直接萃取和加水混匀后萃取的效果,结果如图3 所示。
图3 加水对回收率的影响
Fig.3 Effect of water addition on recovery
由图3 可知,肉类样品加入适量超纯水涡旋混匀后的分散性更好,下层呈细腻流体状,回收率也比较稳定,不加水萃取时个别物质回收率偏低,最终确定采用肉类样品加入5 mL 水、固体粉末样品加入10 mL 水溶解后再加乙腈萃取的条件。
2.1.2 盐析条件优化
试验对不同盐析方式进行了比较,包括氯化钠、QuEChERS 盐包A（6 g 无水硫酸镁+1.5 g 醋酸钠）、QuEChERS 盐包B（4 g 无水硫酸镁+1 g 氯化钠+1 g 柠檬酸钠+0.5 g 柠檬酸氢二钠）,结果见图4。
图4 盐析方式对回收率的影响
Fig.4 Effect of salting-out method on recovery
由图4 可知,加氯化钠盐析的回收率偏高,而两种配方的盐包提取效果接近,盐包B 的回收率更接近100%,最终确定盐析条件为4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠。
2.1.3 净化条件优化
QuEChERS 法常用净化剂有十八烷基键合硅胶（octadecylsilane,C18）、PSA、石墨化炭黑（graphitized carbon black,GCB）。C18 主要去除样品中的脂肪、甾醇和其他非极性干扰物；PSA 主要去除柠檬酸共萃取物、脂肪酸、色素和极性干扰物；GCB 主要去除色素,用于颜色深的样品。根据本研究的基质特性,需要去除的杂质主要为脂肪、蛋白质,因此选取了包含C18 和PSA的净化管作为对比条件。
试验对比不同品牌、不同净化材料配比的净化管以及正己烷除脂的净化效果,净化管A、B 为不同品牌、相同配比,包含900 mg 无水硫酸镁和150 mg PSA,净化管C 包含1 200 mg 无水硫酸镁、400 mg PSA 和400 mg C18,结果见图5。
图5 不同净化条件对回收率的影响
Fig.5 Effect of different clean-up conditions on recovery
净化管A、B 均有良好的净化效果和回收率,两个品牌没有差异,而净化管C 对不同基质各物质的回收率不稳定,正己烷除脂的回收率偏高,因此选择900 mg 无水硫酸镁和150 mg PSA 作为净化剂。
2.2 仪器条件优化
2.2.1 色谱柱选择
试验对比了Accucore C18（100 mm×2.1 mm,2.6 μm）、Accucore Biphenyl（100 mm×2.1 mm,2.6 μm）、Accucore PFP（100 mm×3.0 mm,2.6 μm）3 种键合相的色谱柱在同一洗脱程序下的分离效果,发现使用Biphenyl 色谱柱时7 种糖皮质激素的保留时间提前,且分离效果和峰形优于其他两种色谱柱,因此选择Biphenyl 色谱柱进行分离,7 种糖皮质激素的总离子流色谱图见图6。
图6 7 种糖皮质激素总离子流色谱图
Fig.6 Total ion chromatogram of seven glucocorticoids
1.地索奈德；2.氟尼缩松；3.氟氢缩松；4.地夫可特；5.哈西奈德；6.安西奈德；7.泼尼卡酯。
2.2.2 质谱参数确定
分别将浓度为1 mg/L 的糖皮质激素标准液以7 μL/min 的流速注入质谱仪,进行正离子模式和负离子模式全扫描。发现在正离子模式下的[M+H]+离子峰响应强度更高,因此确定扫描模式,并确定各化合物的母离子和子离子,选择响应强度更高的子离子作为定量离子。使用MRM 模式优化去簇电压和碰撞电压等参数,使仪器灵敏度处于最佳状态。
2.3 基质效应
基质效应（matrix effect,ME）是指色谱分离时共流出的物质与目标物竞争电离对信号的影响,表现为基质增强或基质抑制。当基质效应影响大时会降低方法的灵敏度和定量的准确性,应考虑使用基质标准溶液进行校正。将基质标准点峰面积（S1）与溶剂标准点ME（ME,%）峰面积（S2）相比增加或减少的百分比用来衡量基质效应,计算公式为ME=（S1/S2-1）×100[30-31]。选择牛奶、猪肉、鸡蛋等加标回收试验的9 种不同基质,经前处理获得的空白基质溶液与溶剂分别配制浓度为10 μg/L 的标准点进样分析。结果表明,地夫可特的ME 值为0%～8.37%,存在微弱的基质增强效应；其他6 种糖皮质激素在以上几种基质中均存在基质抑制效应,但ME 的绝对值<20%,基质效应不明显。
2.4 方法学验证
2.4.1 线性范围与检出限
选取猪肉空白基质,配制浓度范围0.1～100 μg/L的7 种糖皮质激素混合标准工作液,在优化后的仪器条件下进行分析。以浓度为横坐标（X,μg/L）,峰面积为纵坐标（Y）,绘制标准曲线并得到线性回归方程,7 种糖皮质激素的相关系数（r）均大于0.999,在该浓度范围内线性良好。以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）响应对应的浓度确定检出限（limits of detection,LODs）和定量限（limits of quantity,LOQs）,结果见表3。
表3 7 种糖皮质激素的线性方程、相关系数、检出限和定量限
Table 3 Linear equations，correlation coefficients，LODs，and LOQs for seven glucocorticoids
地索奈德Y=33 400X-46.8 0.999 10.3071.02
2.4.2 方法回收率和精密度
按优化后的前处理方法和仪器条件,在不同基质中添加3 个浓度水平的7 种糖皮质激素标准物质进行加标回收试验,每个水平重复测试6 次,计算平均回收率和精密度,结果见表4。
表4 不同样品的回收率和精密度
Table 4 Recoveries and precisions of different samples
化合物地夫可特氟尼缩松氟氢缩松泼尼卡酯添加水平/（μg/kg）20 50 200 20 50 200 20 50 200 20 50 200猪肉回收率/%95.9 92.7 97.7 95.6 99.1 96.7 94.9 98.0 95.6 94.5 101 102精密度/%5.1 1.9 1.7 8.8 2.9 2.7 6.4 7.0 3.0 5.0 6.3 5.5牛奶回收率/%100.1 95.7 97.9 96.0 93.3 97.6 96.5 100 97.0 90.6 95.7 105.3精密度/%3.6 3.3 2.0 2.6 1.6 3.2 4.9 3.9 1.2 10.1 4.4 3.8牛肉回收率/%88.8 85.6 89.0 100.7 98.8 97.4 98.0 105 103 87.3 89.2 100.3精密度/%2.6 2.3 4.5 4.7 2.1 3.1 2.2 4.5 1.7 6.9 3.3 2.5鸡肉回收率/%95.5 96.1 94.1 97.2 97.9 99.0 92.8 100.4 96.2 90.7 105.5 107.7精密度/%6.0 1.4 2.6 6.5 3.1 3.3 2.0 5.1 3.1 4.9 3.8 8.3猪肾回收率/%92.8 88.4 91.2 98.1 95.7 97.1 98.9 93.2 101.0 78.1 88.5 90.2精密度/%5.1 2.0 0.6 4.4 4.0 4.0 2.6 7.1 2.4 1.8 5.0 3.5鱼肉回收率/%96.7 105.3 100.4 89.4 95.7 96.3 97.3 94.7 102.0 109.1 106.4 99.9精密度/%4.8 3.9 2.4 7.7 5.2 1.8 5.0 6.1 3.1 2.0 9.7 3.5鸡蛋回收率/%100.6 100.1 101.0 98.8 96.1 96.8 97.6 99.0 100.4 116.0 118.5 115.3精密度/%3.1 3.0 1.7 3.0 2.8 3.5 5.0 3.9 3.6 5.6 10.9 4.5蜂蜜回收率/%99.7 102.8 102.8 97.7 97.1 98.0 92.0 98.4 100.3 100.7 101.5 105.2精密度/%6.2 3.9 1.6 2.6 2.3 1.9 6.5 3.7 2.8 4.8 7.2 7.2蛋白粉回收率/%95.4 93.7 104.8 107.3 93.0 101.0 100.3 98.0 104.9 92.5 91.0 108.3精密度/%9.5 9.1 5.2 3.8 10.1 4.8 8.2 4.0 14.7 10.7 6.3 3.5
续表4 不同样品的回收率和精密度
Continue table 4 Recoveries and precisions of different samples
化合物哈西奈德安西奈德地索奈德添加水平/（μg/kg）20 50 200 20 50 200 20 50 200猪肉回收率/%94.5 94.5 93.1 91.3 105.5 109.6 82.2 88.9 89.4精密度/%9.7 9.3 6.0 9.0 4.4 6.6 6.8 4.0 2.5牛奶回收率/%91.7 84.5 87.3 94.7 97.4 99.2 92.3 87.3 87.8精密度/%11.2 4.6 4.5 3.9 6.1 6.1 3.9 3.2 2.2牛肉回收率/%89.9 86.5 89.0 87.4 96.3 85.2 89.0 87.9 88.1精密度/%7.7 5.2 5.6 9.0 9.6 7.5 6.2 3.4 3.4鸡肉回收率/%94.5 92.1 93.0 97.6 101.7 98.7 91.5 88.0 88.8精密度/%9.1 10.4 2.8 5.9 2.4 3.3 6.8 4.9 1.3猪肾回收率/%88.8 83.3 87.7 79.9 79.6 85.0 83.9 88.7 87.9精密度/%6.1 2.5 6.2 9.6 5.4 2.3 7.1 3.0 3.3鱼肉回收率/%88.7 91.7 89.3 94.5 100.7 100.8 80.8 88.9 83.5精密度/%6.8 4.8 2.6 5.0 7.3 6.3 5.9 3.0 1.8鸡蛋回收率/%83.2 91.2 92.9 109.4 105.5 109.0 89.2 92.9 86.3精密度/%11.9 5.5 3.7 6.7 4.4 2.1 1.8 2.4 3.1蜂蜜回收率/%86.0 90.0 91.4 96.2 109.2 102.9 87.0 92.4 92.7精密度/%4.8 3.7 6.5 1.4 6.6 6.4 3.5 1.1 1.6蛋白粉回收率/%104.9 83.8 98.2 93.6 102.2 117.8 92.5 88.1 93.0精密度/%6.9 3.6 4.2 12.9 6.9 2.6 9.2 6.4 6.2
2.5 实际样品测定
采用本研究建立的方法对采购的50 批次样品进行检测,包括猪肉、牛肉、鸡肉、牛奶、鸡蛋、鱼肉,均未检出本方法包含的7 种糖皮质激素。
3 结论
本研究建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中7 种糖皮质激素兴奋剂类药物残留的分析方法。通过优化前处理条件和色谱条件,实现了世界反兴奋剂组织禁用、但国内没有检测标准的7 种糖皮质激素在动物源性食品中的提取、净化和分离,操作简单省时,并具有良好的回收率和精密度,可以为相关研究提供参考。糖皮质激素包括大量结构相似、药理作用相似的衍生物,因此扩大检测方法覆盖目标物范围具有重要意义,也是糖皮质激素检测技术研究的重要发展方向。
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