小米多酚是一种天然的营养物质,具有多种保健功效并已经被证明在预防和治疗一系列疾病中具有很强的生物活性。抗氧化是其中最为突出的一项功能,可以帮助减少细胞损伤和老化、预防心血管疾病、减少肠道炎症等慢性疾病的发生。多酚还具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功效,可以增强免疫力,促进身体健康。现有研究报道,多酚物质具备很强的抗氧化活性及降血糖、降胆固醇、预防溃疡等功效[1-2]。多酚物质的稳定性容易受到环境中各种因素（光照、温度、水、pH 值、金属离子等）的影响而变得不稳定且易降解。
微胶囊是具有聚合物或无机物外壁的微型容器或包装物,它可以有效减少活性物质与外界环境因素的反应、减少芯材向环境的扩散和蒸发、控制芯材的释放以及改变芯材的物理性质和化学性质[3]。因此,采用微胶囊技术可以有效提高多酚物质的耐受性,使其不易失活,并提高其稳定性,选择合适的壁材是影响微胶囊性能的重要因素之一[4]。海藻酸钠是一种天然无毒的可降解材料,具备很好的生物相容性,成胶机制也较为简单,价格低廉,而且有很好的控制释放性能,因此海藻酸钠广泛应用于微胶囊制备中[5]。壳聚糖也具有与海藻酸钠几乎相同的优势。因此,本研究以壳聚糖和海藻酸钠作为壁材,采用复凝聚法制备小米多酚微胶囊,以期提高小米多酚的生物利用度和稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米（东方亮1 号）：市售；石油醚、无水乙醇（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；无水碳酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；果胶酶（5 万U/g）、纤维素酶（10 万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；没食子酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；海藻酸钠（高级纯）：合肥博美生物科技有限公司；壳聚糖（中高黏度）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器设备
7 号一次性无菌注射器、UV-1100 型可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；SC-3610 型低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；HGPF-270型隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；BSC-1100ⅡB2 型生物安全柜：苏州安泰空气技术有限公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FD-1A-50 型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；ST2100 型pH 计：奥豪斯仪器（常州）有限公司；LS-75HD 型立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗器械有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 小米多酚提取物制备
采用复合酶法[6]提取小米多酚,制备流程：小米→粉碎→过筛→脱脂干燥→加酶→调节pH 值→水浴→冷却→离心取上清液I→取滤渣加入乙醇→水浴→离心取上清液Ⅱ→合并上清液I 和上清液Ⅱ→蒸发浓缩。
1.3.2 小米多酚微胶囊制备
称取一定质量的海藻酸钠,加入磷酸缓冲液中,调节pH 值为3.0,将混合溶液放置在恒温磁力搅拌器中并升温至60 ℃,充分搅拌溶解海藻酸钠。待海藻酸钠完全溶解后,取出溶液并静置冷却至室温。根据质量分数配比加入一定量的小米多酚粗提液,搅拌均匀后静置片刻,待气泡消散后,用7 号注射器针管,采用滴注法将海藻酸钠多酚溶液逐滴滴入一定质量分数配比的氯化钙-壳聚糖溶液中,液滴迅速包裹形成胶珠,反应一段时间（即包埋时间）后将胶珠过滤,用蒸馏水清洗数遍,于冷冻干燥机中干燥得小米多酚微胶囊,待用[7]。
1.3.2.1 单因素试验
以小米多酚微胶囊包埋率作为考察指标,通过单一因素控制变量法进行微胶囊包埋试验。试验组设置：不同海藻酸钠质量分数（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、不同氯化钙质量分数（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）、不同壳聚糖质量分数（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、不同包埋时间（30、40、50、60、70 min）、不同小米多酚质量分数（0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）。
1.3.2.2 正交试验
在单因素试验的基础上,选取海藻酸钠、壳聚糖和小米多酚的质量分数作为3 个因素,采用L9（34）正交设计方法进行试验。以小米多酚微胶囊的包埋率作为评价指标,确定最优的制备工艺。正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of the orthogonal design
因素水平123 A 海藻酸钠质量分数/%2.0 2.5 3.0 B 小米多酚质量分数/%0.20 0.25 0.30 C 壳聚糖质量分数/%1.0 1.5 2.0
1.3.3 小米多酚微胶囊包埋率的测定
用分析天平称取5 g 小米多酚微胶囊,参照胡顺强等[8]的方法测定样品吸光度,计算表面（未包埋）多酚含量及总多酚含量。按照以下公式计算包埋率（X,%）。
式中：m 为未包埋多酚含量,mg；M 为总多酚含量,mg。
1.3.4 小米多酚微胶囊稳定性的研究
1.3.4.1 光照对小米多酚微胶囊稳定性的影响
将小米多酚与微胶囊分别置于避光、室内、室外3 种光照条件下,放置5 h,每隔1 h 测定同一光照条件下多酚的含量,每组设3 个平行,计算多酚的保留率,比较光照对小米多酚微胶囊稳定性的影响。
1.3.4.2 温度对小米多酚微胶囊稳定性的影响
将小米多酚和微胶囊分别置于4、25、50、80 ℃条件下,避光放置5 h,在同一温度下,每隔1 h 测定多酚的含量,每组设3 个平行,计算多酚的保留率,比较温度对小米多酚微胶囊稳定性的影响。
1.3.4.3 pH 值对小米多酚微胶囊稳定性的影响
将小米多酚与小米多酚微胶囊分别置于pH 值为2、4、6、8 的缓冲液中,避光放置5 h,在各个pH 值下,每隔1 h 测定多酚含量,每组设3 个平行,计算多酚的保留率,比较pH 值对小米多酚微胶囊稳定性的影响。
1.3.4.4 氧化剂对小米多酚微胶囊稳定性的影响
将小米多酚和小米多酚微胶囊分别放入0%、1%、2%的H2O2 溶液中,避光放置5 h,在各个浓度H2O2 条件下,每隔1 h 测定多酚含量,每组设3 个平行,计算多酚的保留率,比较不同浓度H2O2 对小米多酚微胶囊稳定性的影响。
1.3.4.5 还原剂对小米多酚微胶囊稳定性的作用
将小米多酚和小米多酚微胶囊分别放入0%、0.1%、0.2%的Na2SO3 溶液中,避光放置5 h,在各个浓度Na2SO3 条件下,每隔1 h 测定多酚含量,每组设3 个平行,计算多酚的保留率,比较不同浓度Na2SO3 对小米多酚微胶囊稳定性的影响。
1.3.5 多酚保留率的测定
分别称取处理和未处理的小米多酚及小米多酚微胶囊,测定其多酚含量,按照以下公式计算多酚保留率（R,%）。
式中：A 为处理后多酚含量,mg/g；B 为处理前多酚含量,mg/g。
1.3.6 小米多酚微胶囊的抑菌作用
采用滤纸片法测量抑菌圈直径,对抑菌作用进行判断。取斜面保藏好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株,在经3 次倒平板活化后,将其稀释成浓度为10-6 CFU/mL 的菌悬液。于无菌操作台中进行操作,分别取菌悬液0.1 mL,使用涂布器将菌悬液均匀涂布于营养琼脂培养基上。将已经灭菌的直径为6 mm 圆形滤纸片于小米多酚提取液和破碎后的小米多酚微胶囊溶液中各浸泡30 s 后取出,用灭菌后的镊子把含无水乙醇、小米多酚和小米多酚微胶囊溶液的滤纸片贴在带有细菌的平板上[9],每皿放置3 片,进行3 次平行试验,将处理好的带菌培养皿置于专用的恒温培养箱内,37 ℃恒温培养24 h,测量培养皿上抑菌圈的直径,根据其大小判断小米多酚微胶囊的抑菌性。
1.4 数据处理
使用 Origin8.0 进行数据处理及绘图,试验结果为平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 小米多酚微胶囊制备条件优化
2.1.1 单因素试验
2.1.1.1 海藻酸钠质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
海藻酸钠质量分数对微胶囊包埋率的影响见图1。
图1 海藻酸钠质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
Fig.1 Effect of mass fraction of sodium alginate on embedding rate of millet polyphenol microcapsules
由图1 可知,随着海藻酸钠质量分数的增加,小米多酚微胶囊包埋率逐渐上升,在海藻酸钠质量分数为2.5%时,微胶囊包埋率达到最大。当海藻酸钠质量分数超过2.5%时,小米多酚微胶囊包埋率出现下降的趋势。这种现象发生的原因可能是海藻酸钠溶液和氯化钙溶液中的金属离子形成了一种致密的网状凝胶结构,这能提高多酚物质的包埋率。但是当海藻酸钠质量分数达到一定程度时,溶液中的键合度会饱和,无法再形成这种致密的网状结构[10]。此外,随着海藻酸钠质量分数的提高,使得溶液过于黏稠会出现部分海藻酸钠不溶的情况,导致溶液在针管中结成凝胶堵塞针头,不能从针管中滴出,也就出现不易包埋成微胶囊或完全包埋不了的情况出现,导致包埋效果的降低。因此,最佳海藻酸钠质量分数为2.5%。
2.1.1.2 氯化钙质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
氯化钙质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响见图2。
图2 氯化钙质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
Fig.2 Effect of calcium chloride mass fraction on the embedding rate of millet polyphenol microcapsules
从图2 可看出,氯化钙质量分数为2.0%～4.0%时,小米多酚微胶囊包埋率先增大后减小,在氯化钙质量分数为3.0% 时小米多酚微胶囊包埋率达到最高。此后,包埋率开始降低。多出的Ca2+会与海藻酸钠上的G 分子链键合,建立起一种紧密的网状结构。一定浓度的Ca2+有助于提高微胶囊的包埋承载量；然而当钙离子浓度过高时,形成的网状结构过于紧密,会导致包埋承载量受到限制,从而使得包埋率下降[11]。因此,最佳氯化钙的质量浓度为3.0%。
2.1.1.3 壳聚糖质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
壳聚糖质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响见图3。
图3 壳聚糖质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
Fig.3 Effect of chitosan mass fraction on the embedding rate of millet polyphenol microcapsules
从图3 可看出,壳聚糖质量分数为1.0%～3.0%时,小米多酚微胶囊包埋率随着壳聚糖质量分数的增加,呈先升高后降低趋势。当壳聚糖质量分数达到1.5%时,小米多酚微胶囊包埋率达到最大。这是由于壳聚糖在稀醋酸中溶解,生成大量的伯氨基带有正电荷[12]。而海藻酸钠溶液中含有的大量羧基带负电荷,两者反应会在海藻酸钠的胶体的表面在形成一层胶层[13],且壳聚糖本身带有黏稠性,能够有效地阻止多酚从微胶囊中流出,提高包埋率。但当壳聚糖质量分数过高时,其溶液黏度增大,使得海藻酸钠溶液难以形成液滴,不利于多酚微胶囊包埋,从而包埋率会下降。因此,最佳壳聚糖的质量浓度为1.5%。
2.1.1.4 包埋时间对小米多酚微胶囊包埋率的影响
包埋时间对小米多酚微胶囊包埋率的影响见图4。
图4 包埋时间对小米多酚微胶囊包埋率的影响
Fig.4 Effect of encapsulation time on the embedding rate of millet polyphenol microcapsules
由图4 可知,包埋时间为30～70 min 时,包埋率呈先升高后降低趋势,包埋40 min 时小米多酚包埋率达到最高。包埋时间太长或太短,包埋率都明显低于40 min 时的包埋率,包埋效果不好。如果包埋时间过短,微胶囊的囊层会变得过厚,导致包埋率提高,但是多酚活性的保护效果会降低。如果包埋时间过长,微胶囊的芯材会逐渐渗透到囊壁中,导致包埋率下降,从而无法有效保护多酚活性。因此,在制备小米多酚微胶囊时,需要选择合适的包埋时间,使其实现最佳保护效果。因此,最佳包埋时间为40 min。
2.1.1.5 小米多酚质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
小米多酚质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响见图5。
图5 小米多酚质量分数对小米多酚微胶囊包埋率的影响
Fig.5 Effect of millet polyphenol mass fraction on the embedding rate of millet polyphenol microcapsules
由图5 可知,多酚质量分数为0.2%～0.4% 时,小米多酚微胶囊包埋率随着多酚添加量的增加呈现先升高后降低的趋势,在多酚质量分数为0.25%时包埋率最高,之后随着多酚质量分数的增加,包埋率逐渐下降。多酚质量分数过低时,微胶囊表面多酚含量差别不大,总包埋量不多,包埋率会低一些；多酚质量分数过高时,可能是由于添加了过多的多酚,导致芯材没有被充分包埋,从而导致包埋率下降。因此在进行微胶囊制备时要控制好多酚的质量分数,过低不利于包埋效率,过高则会浪费芯材壁材原料,包埋效果不佳。因此,最佳多酚质量分数为0.25%。
2.1.2 正交试验
根据单因素试验结果进行三因素三水平正交试验,试验结果如表2 所示。
表2 正交试验设计与结果
Table 2 Design and results of orthogonal test
试验号A 海藻酸钠质量分数B 小米多酚质量分数C 壳聚糖质量分数空列1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 2 1 3 2 1 3 2 1 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 84.31±1.14 86.27±1.23 90.34±0.94 84.35±0.82 89.18±0.72 87.45±1.16 84.76±0.63 83.03±0.98 88.25±1.06 84.93 86.29 88.09 3.16 87.24 86.16 85.9 1.34 84.47 86.16 88.68 4.21 86.97 86.99 85.35 1.64 k2 k3 R包埋率/%
由表2 可知,影响小米多酚微胶囊制备因素的主次顺序为小米多酚质量分数>壳聚糖质量分数>海藻酸钠质量分数。由正交试验k 值得出最优组合为A2B3C3,正交表中最优组合为第3 组（A1B1C3）。对两个组合进行验证,组合A2B3C3 的包埋率为（89.1±0.30）%,组合A1B1C3 的包埋率为（90.34±0.94）%。因此确定小米多酚微胶囊制备的最优工艺为2.0% 的海藻酸钠,0.2%的小米多酚以及2.0%的壳聚糖。
2.2 小米多酚微胶囊稳定性试验
2.2.1 光照对小米多酚微胶囊稳定性的影响
光照对小米多酚和小米多酚微胶囊稳定性的影响见图6。
图6 光照对小米多酚微胶囊稳定性的影响
Fig.6 Effect of light exposure on the stability of millet polyphenol microcapsules
由图6 可知,在不同光照条件下,小米多酚和小米多酚微胶囊的多酚保留率均随时间的延长而降低。小米多酚微囊的保留率明显高于小米多酚,在避光及室内条件下二者均能维持良好的稳定性,放置5 h 后,多酚的保留率仍然高于90%；在室外条件下,二者的多酚保留率都明显降低,经包埋之后的多酚比未包埋的高11.04%。由此可以看出,小米多酚微胶囊的稳定性远高于小米多酚,这可能是由于海藻酸钠和壳聚糖制成的双层微胶囊起到的保护作用。
2.2.2 温度对小米多酚微胶囊的影响
温度对小米多酚和小米多酚微胶囊稳定性的影响见图7。
图7 温度对小米多酚微胶囊稳定性的影响
Fig.7 Effect of temperature on the stability of millet polyphenol microcapsules
从图7 可以看出,在不同温度条件下,小米多酚和小米多酚微胶囊的多酚保留率均随时间的延长而降低。小米多酚在4 ℃贮藏5 h 后的保留率为96.15%,小米多酚微胶囊为96.64%,表明多酚类物质在低温环境中是稳定的；在25、50 ℃处理5 h,小米多酚微胶囊的多酚保留率分别提高了5.84%、7.8%；当温度达到80 ℃时,小米多酚和小米多酚微胶囊的多酚稳定性明显降低,但是经过包埋处理后,小米多酚微胶囊的多酚保留率明显优于小米多酚。这些结果表明,低温和微胶囊包裹可以提高多酚的稳定性。另外,由海藻酸钠与壳聚糖复合制成的微胶囊,可对多酚类物质起到很好的防护作用,增强其稳定性。因此,在高温条件下易降解的多酚可以通过低温和封装的方式提高其稳定性。
2.2.3 pH 值对小米多酚微胶囊稳定性的影响
pH 值对小米多酚和小米多酚微胶囊稳定性的影响见图8。
图8 pH 值对小米多酚微胶囊稳定性的影响
Fig.8 Effect of pH on the stability of millet polyphenol microcapsules
由图8 可知,当pH 值为2 时,小米多酚和小米多酚微胶囊的多酚保留率最高,5 h 后的保存率分别为93.86% 和95.31%,随着pH 值从酸性到碱性的过程中,保存率都逐步下降。pH 值为4 和6 时,5 h 后小米多酚微胶囊的多酚保留率较小米多酚分别提高了7.87% 和7.69%；pH 值为8 时,处理5 h 后,小米多酚的多酚保留率为63.69%,小米多酚微胶囊为76.1%,多酚保留率提高了12.41%。以上说明,多酚和微胶囊应该在pH≤2 的条件下储存,且由海藻酸钠和壳聚糖制备的双层小米多酚微胶囊能够提高多酚的pH 值稳定性。
2.2.4 氧化剂H2O2 对小米多酚微胶囊稳定性的影响
氧化剂H2O2 对小米多酚和小米多酚微胶囊稳定性的影响见图9。
图9 氧化剂H2O2 对小米多酚微胶囊稳定性的影响
Fig.9 Effect of H2O2 on the stability of millet polyphenol microcapsules
由图9 可知,随着时间的延长,对照组（0% H2O2）多酚保留率趋于稳定,试验组多酚保留率呈下降趋势。氧化剂浓度为1%时,处理5 h 后小米多酚的多酚保留率为64.44%,小米多酚微胶囊为73.65%,提高了9.21%；氧化剂浓度为2% 时,处理5 h 后小米多酚的多酚保留率为48.92%,小米多酚微胶囊为70.82%,提高了21.9%。结果表明,氧化剂对多酚稳定性有明显的破坏作用,经过微胶囊包埋处理后,小米多酚得到了有效地保护,并且氧化剂对多酚的破坏作用也被降到了较低水平。
2.2.5 还原剂Na2SO3 对小米多酚微胶囊稳定性的影响
还原剂Na2SO3 对小米多酚和小米多酚微胶囊稳定性的影响见图10。
图10 还原剂Na2SO3 对小米多酚微胶囊稳定性的影响
Fig.10 Effect of Na2SO3 on the stability of millet polyphenol microcapsules
由图10 可知,与对照组（0% Na2SO3）相比,随着时间的延长,小米多酚和小米多酚微胶囊的多酚保留率均明显下降。处理5 h 后,当Na2SO3 浓度为0.1% 时,所制得的小米多酚微囊的多酚保留率比小米多酚高6.3%；当浓度为0.2% 时,多酚保留率下降幅度较大大,小米多酚微胶囊的保留率较小米多酚高4.71%。由此可知,还原剂对多酚有很强的破坏性,当将其制成微胶囊后,酚类物质可以得到更好地保护,降低还原剂对酚类物质的影响,进而提升其稳定性。
2.3 小米多酚微胶囊抑菌性试验
不同溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表3。
表3 不同溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径
Table 3 Inhibition zones of different solutions against Escherichia coli and Staphylococcus aureus
溶液无水乙醇小米多酚小米多酚微胶囊大肠杆菌抑菌圈直径/cm 4.29±0.06 6.10±0.03 9.46±0.05金黄色葡萄球菌抑菌圈直径/cm 4.01±0.03 5.44±0.04 8.75±0.02
由表3 可知,小米多酚和小米多酚微胶囊对两种菌的抑菌性均大于无水乙醇,小米多酚微胶囊对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性均大于小米多酚。且小米多酚和小米多酚微胶囊对大肠杆菌的抑菌性要大于金黄色葡萄球菌。说明大肠杆菌对小米多酚和小米多酚微胶囊更为敏感。
3 结论
本研究通过单因素及正交试验优化制备工艺,最终确定在海藻酸钠2.0%,壳聚糖2.0%,小米多酚0.2%,氯化钙3.0%,包埋时间40 min 条件下,微胶囊包埋率最高,可达（90.34±0.94）%。结果表明,相较于未包埋的小米多酚,在相同的温度、pH 值、光照、氧化剂和还原剂条件下,小米多酚微胶囊具有更高的多酚保存率,明显提升了其稳定性,通过滤纸片法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌开展抑菌性试验测得抑菌性为小米多酚微胶囊>小米多酚>无水乙醇,体现出小米多酚微胶囊良好的抑菌性能。
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