松花粉为松科植物马尾松、油松或同属数种植物的干燥花粉,其含有蛋白质、碳水化合物、少量不饱和脂肪酸、多种维生素和矿物质,属于药食同源原料和新资源食品,因其丰富的营养成分和潜在的健康益处而被广泛研究[1]。众多研究表明,松花粉在抗氧化性能[2-3]、血脂降低作用[4-5]以及脂质代谢调节功能[6-7]上展现出显著效果,并且其醇溶性提取物、水溶性提取物及脂溶组分等各类提取物均呈现出良好的生物活性与功效。松花粉主要由外壳和气囊两部分组成,外壳成分为脂质和蛋白质,可保护花粉内部的生殖细胞免受外界环境的干扰,气囊主要是半纤维素,内部存在有高含量的植物低聚糖。松花粉的细胞壁具有较强的耐酸碱、耐高温耐高压特性,且其内部的多酚、黄酮等活性成分大多以结合形式存在,这使得松花粉中的营养成分在人体内难以被有效消化和吸收,从而限制了其在实际应用中的开发和利用[8-9]。因此,通过破壁处理可以充分释放这些活性成分,最大限度地发挥松花粉的营养和功能价值。
酶法降解作为一种破壁提取方法,具有高效性、高度专一性、对环境友好、无污染等优点,能够在不破坏天然产物原有化学结构与生物活性的基础上,有效提升产物的纯度及产量,展现出较大的应用潜力[10-11]。此外,酶解处理使得花粉颗粒细化,表面积扩大,进而促进了产品品质及提取效率的双重提升[12]。对于多糖、多酚等以结合形式存在的营养成分及生物活性物质,酶解法还能促进其释放,从而增强了提取物的生物活性及药用价值[13-14]。罗轩[15]研究表明,提取蜂花粉时采用碱性蛋白酶辅助酶解,多酚与黄酮类化合物的溶解度显著增强,同时小分子多肽组分也有所增加,动物实验进一步证明酶解后蜂花粉能有效提升小鼠的免疫力。史芸婷[16]研究表明,油菜花粉经木瓜蛋白酶、纤维素酶及果胶酶酶解后,其抗氧化性能提升了1～2 倍。国内目前广泛应用的破壁法有生物破壁法（酶解法）、物理破壁法（超声处理与机械破碎等）和化学破壁法（酸碱处理等）。然而,当前研究大多聚焦于单一破壁技术的应用,对于联合多种破壁方法的研究尚显不足。El Kantar 等[17]研究发现,将高压放电与酶解两种预处理方式相结合可极大地提高橙皮中多酚和多糖的提取率。Zhang 等[18]研究发现超声可辅助酶解提取芹菜中的木犀草素和芹菜素。因此,深入探究酶解技术与其他破壁手段的结合应用,不仅可以增强松花粉的破壁效果,而且可以优化营养及活性成分的高效萃取过程。
本研究通过对比分析α-淀粉酶、碱性蛋白酶、纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶在酶解处理前后对松花粉提取液中营养及功能成分含量与构成的影响,筛选出表现更优的酶,进而探索利用复合酶酶解来提升破壁效率的可能性。后续研究采用超声辅助结合碱处理与酶解法对松花粉进行破壁和抗氧化成分提取,并针对酶解时间、酶种类、碱浓度和碱种类对松花粉破壁效果和营养成分提取率的影响进行工艺优化,为进一步深入开发松花粉资源及其活性成分提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
未破壁松花粉：新时代健康产业（集团）有限公司；表儿茶素、原儿茶酸、咖啡酸、对香豆酸、柚皮素、食子酸（纯度均≥96%）：美国Sigma-Aldrich 公司；醋酸、磷酸、盐酸、高氯酸、冰醋酸、氯化铁、过硫酸钾、三氯乙酸、氢氧化钠、碳酸钠、氯化铝、亚硝酸钠、蒽酮试剂、福林酚试剂、活性炭：国药集团化学试剂有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、纤维素酶（50 U/mg）、β-葡萄糖糖苷酶（20～40 U/mg） ：上海源叶生物技术有限公司；乙腈（色谱纯）：美国TEDIA 公司；甲酸（色谱纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；芦丁、熊果酸、香草醛、2,4,6-三吡啶基三嗪、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、2,2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2,2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） ammonium salt,ABTS]、乙酸钠、三乙胺、四氢呋喃（纯度均≥96%）：美国百灵威科技有限公司。除特殊标注外,其他化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
5810 型离心机：德国Eppendorf 公司；Sepctra Max 190 酶标仪：美国Molecular Devices 公司；SCIENTZ-50F/A 冷冻干燥机、SB5200 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-82 水浴恒温振荡器：常州金坛新航仪器厂；e2695 高效液相色谱仪、X-Bridge C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）：美国Waters 公司；AX205 型电子分析天平：瑞士Mettler Toledo 仪器有限公司；Hypersil OSD 色谱柱（4.0 mm×250 mm,5 μm） ：美国Agilent 公司；TU-1950 双光束可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；Smart-S2-30DH 超纯水机：南京易普易达科技发展有限公司；Regulus8100 冷场发射扫描电镜：日本日立公司。
1.3 方法
1.3.1 松花粉破壁的工艺优化
1.3.1.1 不同种类酶酶解对未破壁松花粉抗氧化活性成分提取率的影响
精确称取未破壁松花粉2.5 g,按照12.5%的添加比例,分别加入α-淀粉酶、碱性蛋白酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶,按1∶10 （g/mL）的料液比加入25 mL 相应pH 值的缓冲溶液。将样品置于水浴恒温振荡器中,在50 ℃条件下酶解3 h。沸水浴灭酶5 min,冷却后,将灭酶的样品用去离子水定容至50 mL 容量瓶中。在4 ℃、8 000 r/min 条件下进行10 min 的离心处理,分离得到的上清液取出并分装至容器中,随后储存于-20 ℃待测。
1.3.1.2 复合酶酶解对未破壁松花粉抗氧化活性成分提取率的影响
精确称取未破壁松花粉2.5 g,分别加入以下酶组合：α-淀粉酶（12.5%）、碱性蛋白酶（12.5%）、α-淀粉酶与碱性蛋白酶（6.25%+6.25%）、α-淀粉酶与碱性蛋白酶（10.0%+2.5%）、α-淀粉酶与碱性蛋白酶（2.5%+10.0%）。按照料液比1∶10（g/mL）向各样品中加入25 mL 相应pH 值的缓冲溶液。将样品置于水浴恒温振荡器中,在50 ℃条件下振荡水浴酶解3 h。沸水浴灭酶5 min,冷却后,将灭酶的样品用去离子水定容至50 mL 容量瓶中。在4 ℃、8 000 r/min 条件下进行10 min 的离心处理,分离得到的上清液取出并分装至容器中,随后储存于-20 ℃待测。
1.3.1.3 酶解时间对未破壁松花粉抗氧化活性成分提取率的影响
精确称取未破壁松花粉2.5 g,添加12.5%碱性蛋白酶,按1∶10（g/mL）料液比加入相应pH 值缓冲溶液25 mL。将样品置于水浴恒温振荡器中,在50 ℃条件下分别酶解0、10、20、30、60、120、180 min。沸水浴5 min 灭酶,冷却后,将样品用去离子水定容至50 mL容量瓶中。在4 ℃、8 000 r/min 条件下进行10 min 的离心处理,分离得到的上清液取出并分装至容器中,随后储存于-20 ℃待测。
1.3.1.4 碱种类和碱浓度对未破壁松花粉抗氧化活性成分提取率的影响
精确称取未破壁松花粉2.5 g,转移至烧杯中,分别加入25 mL 的去离子水以及浓度为0.15、0.30、0.60 mol/L 的NaOH 溶液和Na2CO3 溶液。在25 ℃条件下,以恒定功率进行超声处理120 min。同时,以25 mL 相应种类和浓度的碱液超声120 min 作为空白对照。碱处理结束后,将悬浊液的pH 值调节至7。随后,向样品中加入12.5% 碱性蛋白酶,置于50 ℃的水浴恒温振荡器中酶解1 h,将样品置于沸水浴中加热灭酶5 min。待其冷却后,用去离子水定容至50 mL。在4 ℃、8 000 r/min 条件下进行10 min 的离心处理,分离得到的上清液取出并分装至容器中,随后储存于-20 ℃待测。
1.3.2 总酚含量测定
参考Singleton 等[19]的福林酚法并稍作修改测定总酚含量。配制0～0.24 mg/mL 的没食子酸标准液,将福林酚溶液稀释10 倍后取1 mL 与0.25 mL 没食子酸标准液混合,再加入3 mL 碳酸钠溶液（75 g/L）后蒸馏水定容至10 mL,避光反应120 min,测定A765,得标准曲线。以蒸馏水作为空白对照,将适量松花粉提取液替换标准液由标准曲线得总酚含量（mg GAE/g DW 松花粉）。
1.3.3 总黄酮含量测定
参考赵星等[20]的氯化铝比色法并稍作修改测定总黄酮含量。用70% 乙醇配制0.5 mg/mL 芦丁标准液,量取0～1.0 mL 标准液并用蒸馏水定容至4 mL,先后加入0.3 mL 5% NaNO2 溶液后静置5 min,随后再加入0.3 mL 10% AlCl3 溶液静置6 min,最后加入 2 mL 1 mol/L NaOH 溶液。用蒸馏水定容至10 mL 并显色10 min 后测定A510 值,得标准曲线。将适量松花粉提取液替换标准液由标准曲线得总黄酮含量（mg RE/g DW 松花粉）。
1.3.4 总三萜含量测定
参考张爽等[21]的方法并稍作修改测定总三萜含量。用无水乙醇配制0.1 mg/mL 熊果酸标准液,量取0.1～1.0 mL 熊果酸标准液并挥干乙醇,加0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、1.0 mL 高氯酸,混合后于60 ℃水浴15 min,随后冷水冷却,加5.0 mL 冰醋酸摇匀后测A550,以无水乙醇为空白对照,得到标准曲线。将适量松花粉提取液替换标准液由标准曲线得总三萜含量（mg UAE/g DW 松花粉）。
1.3.5 总糖含量测定
参考任婧[22]的蒽酮比色法并稍作修改测定总糖含量。将适量上清液转移至10 mL 刻度离心管中,随后加入4 mL 80% 乙醇溶液。在80 ℃水浴中持续搅拌40 min,随后以4 000 r/min 离心10 min,收集上清液备用。将残渣加入4 mL 80% 乙醇溶液进行二次提取,以4 000 r/min 离心10 min,并将两次离心得到的上清液合并。向上清液中加入0.010 g 活性炭,置于80 ℃水浴30 min 进行脱色处理,随后用蒸馏水定容至25 mL。过滤后取1 mL 滤液,稀释至10 mL 备用。将0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的250 mg/L 葡萄糖溶液分别移取至离心管,随后用蒸馏水补充至每管1.0 mL,以此制备成一系列标准溶液。量取1 mL 样品或标准溶液,与5 mL 蒽酮试剂混合并充分摇匀,随后置于沸水浴中加热10 min。待样品冷却后,使用双光束可见分光光度计在620 nm 波长处测定其吸光度。
1.3.6 粗蛋白含量测定
粗蛋白含量依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定。
1.3.7 氨基酸含量测定
参考杨调调[23]的方法并稍作修改测定氨基酸含量。取适量体积上清液,一部分与10%三氯乙酸混合后超声20 min,静置后得到游离氨基酸提取液；另一部分与等体积浓盐酸混合后于120 ℃水解22 h 得到酸解氨基酸提取液。采用C18 色谱柱（250 mm×4.0 mm,5 μm）进行高效液相色谱法分析。流动相A 为29.3 mmol/L pH7.2 乙酸钠-三乙胺-四氢呋喃（500∶0.09∶2.5,体积比）,流动相B 为49.0 mmol/L pH7.2 乙酸钠-乙腈-甲醇（1∶2∶2,体积比）。洗脱梯度：0～27 min,92%～50%A,1.0 mL/min；27～31 min,50%～0%A,1.0 mL/min；31.0～31.5 min,0%A,1.5 mL/min；31.5～33.5 min,0～100%A,1.5 mL/min；33.5～35.0 min,100%A,1.0 mL/min。进样量1 μL,柱温40 ℃,检测波长338 nm,脯氨酸的检测波长为262 nm。
1.3.8 酚类组分的鉴定
参考程勇[24]的方法并稍作修改,对松花粉中的多酚进行定性和定量分析。配制 0.2 mg/mL 原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素标准品母液,并稀释得系列稀释溶液。标准液进样后,以其色谱峰的面积作为纵坐标,相应标准品的浓度作为横坐标,绘制出标准曲线,用于后续的定量分析。取1.0 mL 松花粉酚类组分样品液,过0.22 μm 滤膜后待测。使用C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,柱温35 ℃,进样量 10 μL,检测波长为200～600 nm。流动相为纯乙腈（A）和0.1% 甲酸水溶液（B）,流速为1.0 mL/min。洗脱条件：0～6 min,5%～25% A；6～12 min,25%～40% A；12～15 min,40%～60% A；15～18 min,60%～70% A；18～20 min,70%～100% A；20～22 min,100% A。
1.3.9 ABTS 阳离子自由基清除能力测定
参考Quan 等[25]和Garzón 等[26]的方法并稍作修改测定ABTS 阳离子自由基清除能力。将7 mmol/L 的ABTS 与2.45 mmol/L 的过硫酸钾混合,充分搅拌均匀后,在室温且避光条件下静置12～16 h,以获得ABTS储备液。在使用前,用0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）对ABTS 储备液进行稀释,调整至其A734 达到（0.68～0.72）的范围内,得到ABTS 工作溶液。配制0～1 000 μmol/L Trolox 标准液,于96 孔板中加入10 μL标准液和190 μL ABTS 工作液并反应10 min（室温、避光）后测定A734,用磷酸缓冲液替代样品液作为空白对照,得标准曲线。将样品液替代标准液得到样品的ABTS阳离子自由基清除能力（μmol TE/g DW 松花粉）。
1.3.10 铁离子还原能力测定
参考Qie 等[27]的方法并稍作修改测定铁离子还原能力（ferric-reducing antioxidant power,FRAP）。将20 mmol/L 的FeCl3 溶液、10 mmol/L 的2,4,6-三吡啶基三嗪储备液（溶解于40 mmol/L HCl）以及0.3 mol/L的醋酸缓冲液（pH3.6）按1∶1∶10 的体积比混合,在37 ℃条件下静置1 h,制备得到FRAP 工作液。配制0～1 000 μmol/L Trolox 标准液,于96 孔板中加入10 μL 标准液和190 μL FRAP 工作液并于室温下反应30 min 后测定A593,以蒸馏水作为空白对照,得标准曲线。将样品液替代标准液得样品的FRAP（μmol TE/g DW 松花粉）。
1.3.11 扫描电子显微镜观察
将离心处理后的样品沉淀进行冷冻干燥,随后采用冷场发射扫描电子显微镜,在3 kV 的加速电压下,以500 倍的放大倍数对样品的微观结构进行观察。
1.4 数据处理
数据以平均值±标准差的形式表示,每组试验均设置3 个平行重复。数据分析采用Excel 2016 软件进行处理,并通过Origin 8.0 绘制图表。利用Statistics 软件对数据进行统计学分析,以p<0.05 作为显著性差异的判断标准。
2 结果与分析
2.1 不同种类酶酶解对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响
不同种类酶酶解对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响见图1。
图1 经4 种酶处理后的样品与相应pH 值下的空白样品的主成分分析图和载荷图
Fig.1 Principal component analysis and loads of samples treated with four enzymes against blank samples at corresponding pH value
AKP 表示12.5%碱性蛋白酶；AMY 表示12.5% α-淀粉酶；CL 表示12.5%纤维素酶；GH 表示12.5% β-淀粉糖苷酶；空白-pH5 表示只添加pH5 的缓冲液；空白-pH7 表示只添加pH7 的缓冲液；空白-pH8表示只添加pH8 的缓冲液。
对不同酶处理提升未破壁松花粉抗氧化能力和抗氧化成分的效果进行主成分分析。由图1 可知,第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解释了模型99.5%的方差（PC1=88.7%,PC2=10.8%）,这表明了模型的可靠性。经碱性蛋白酶和α-淀粉酶处理的样本沿着PC1方向上呈现显著偏移,结合图1 中总黄酮、总酚含量及ABTS+自由基清除能力的分布位置,表明酶解能有效释放松花粉细胞壁中结合态的多酚类、黄酮类化合物,从而显著增强其抗氧化活性。α-淀粉酶组样本点在PC1 轴的分离程度仅次于碱性蛋白酶组,这说明碱性蛋白酶对处理对提升未破壁松花粉的抗氧化成分和抗氧化能力的作用最强,其次是α-淀粉酶。基于此,本研究选择将这两种酶组合用于复合酶解,通过协同增效作用进一步提升松花粉活性成分的提取效率及其抗氧化能力。
2.2 复合酶酶解对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响
复合酶酶解对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响如图2 所示。
图2 不同比例的碱性蛋白酶和α-淀粉酶组合处理后的总酚、总黄酮含量及ABTS 阳离子自由基清除能力对比
Fig.2 Comparison of antioxidant values of total phenols，total flavonoids，and ABTS+ free radical scavenging ability after treatment with different ratios of alkaline protease and α-amylase combinations
AKP 表示12.5%碱性蛋白酶；AMY 表示12.5% α-淀粉酶、AKP∶AMY=
4∶1 表示10.0%碱性蛋白酶+2.5% α-淀粉酶组合；AKP∶AMY=1∶1表示6.25%碱性蛋白酶+6.25% α-淀粉酶组合；AKP∶AMY=1∶4 表示2.5%碱性蛋白酶+10.0% α-淀粉酶组合。不同小写字母表示同一指标差异显著（p<0.05）。
由图2 可知,经12.5%碱性蛋白酶处理后,松花粉酶解液的综合生物活性显著提升,总酚含量为（4.85±0.06） mg GAE/g DW 松花粉,总黄酮含量为（2.11±0.01） mg RE/g DW 松花粉,ABTS 阳离子自由基清除能力为（51.68±1.14） μmol TE/g DW 松花粉,均高于其他处理组。试验数据显示,随着碱性蛋白酶比例降低,ABTS 阳离子自由基清除能力逐渐减弱,表明碱性蛋白酶对活性成分释放具有关键作用。碱性蛋白酶可能通过双重机制发挥作用：其一,酶解细胞壁及胞内蛋白产生抗氧化肽；其二,释放以结合态存在的多酚、黄酮等物质。因此,12.5% 碱性蛋白酶处理组对抗氧化成分和抗氧化性的提升效果最好。
2.3 酶解时间对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响
酶解时间对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响如图3 所示。
图3 酶解时间对未破壁松花粉总酚、总黄酮含量及ABTS 阳离子自由基清除能力的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on antioxidant values of total phenols，total flavonoids，and ABTS+ free radical scavenging ability of unbroken pine pollen
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图3 可知,随着酶解时间的延长,总黄酮含量没有变化不明显,甚至相比于空白样品略有下降。总酚含量随着酶解时间的延长呈上升趋势,当酶解时间为60 min 时,总酚含量为（5.97±0.09） mg GAE/g DW 松花粉；在酶解时间为180 min 时,总酚含量最高,达到（7.88±0.08） mg GAE/g DW 松花粉。ABTS 阳离子自由基清除能力在60 min 时达到平衡,酶解120 min 和180 min 相比于酶解60 min 没有显著差异,说明60 min 为较合适的酶解时间。随着酶解时间延长,总酚含量逐渐升高,ABTS 阳离子自由基清除能力却趋于平衡,这可能是其余抗氧化组分（如多肽、三萜等）降解造成的[28]。因此,60 min 为最佳酶解时间。
2.4 碱浓度和碱种类对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响
碱浓度和碱种类对未破壁松花粉活性成分和抗氧化能力的影响见表1。
表1 不同浓度和种类的碱处理结合超声对未破壁松花粉酶解后活性成分和抗氧化能力的影响
Table 1 Effect of different concentrations and types of alkali treatments combined with ultrasonic treatment on active ingredients and antioxidant capacity of unbroken pine pollen after enzymatic hydrolysis
注：同列不同小写字母表示具有显著性差异（p<0.05）。
组别空白0.15 mol/L NaOH 0.30 mol/L NaOH 0.60 mol/L NaOH 0.15 mol/L Na2CO3 0.30 mol/L Na2CO3 0.60 mol/L Na2CO3不酶解酶解不酶解酶解不酶解酶解不酶解酶解不酶解酶解不酶解酶解不酶解酶解总酚含量/[mg GAE/g DW 松花粉]4.62±0.10g 5.97±0.17e 3.71±0.25h 7.43±0.03c 4.20±0.02h 8.19±0.17a 5.06±0.06f 7.75±0.24b 3.74±0.11i 6.64±0.06d 2.86±0.09j 6.61±0.04d 2.25±0.05k 6.16±0.20e总黄酮含量/[mg RE/g DW 松花粉]1.90±0.06e 2.16±0.05d 1.51±0.12fg 2.67±0.03a 2.08±0.03d 2.49±0.06b 2.66±0.09a 2.38±0.01c 1.40±0.03h 2.14±0.02d 1.05±0.03i 1.59±0.03f 0.80±0.02j 1.48±0.05gh ABTS 阳离子自由基清除能力/[μmol TE/g DW 松花粉]43.42±3.86g 65.10±1.15e 41.33±1.91gh 89.41±8.00b 43.34±1.25g 96.94±1.95a 50.69±1.29f 95.88±2.25a 43.10±0.70g 76.89±0.46d 37.01±0.91hi 83.28±3.06c 34.82±5.28i 66.01±0.57e
由表1 可知,碱性蛋白酶处理显著提高了未破壁松花粉水提上清液中的总酚含量。此外,使用不同浓度的NaOH 和Na₂CO₃（0.15、0.30、0.60 mol/L）结合超声处理时,总酚含量、总黄酮含量和ABTS 阳离子自由基清除能力大多未见明显提升,反而略有下降。只有经0.60 mol/L NaOH 处理后,总酚含量从（4.62±0.10） mg GAE/g DW 松花粉升高至（5.06±0.06） mg GAE/g DW 松花粉,总黄酮含量从（1.90±0.06） mg RE/g DW 松花粉升高至（2.66±0.09） mg RE/g DW松花粉,ABTS 阳离子自由基清除能力从（43.42±3.86） μmol TE/g DW 松花粉升高至（50.69±1.29） μmol TE/g DW 松花粉,表明高浓度碱液能够有效提升活性成分的含量,但效果不如酶解明显。因此,超声碱处理可以作为辅助手段,与酶解协同破壁。经过碱处理后再进行酶解,活性成分和抗氧化能力显著提升,尤其是在0.30 mol/L NaOH 处理后,总酚含量从（5.97±0.17） mg GAE/g DW 松花粉增至（8.19±0.17） mg GAE/g DW 松花粉,ABTS+自由基清除能力从（65.10±1.15） μmol TE/g DW 松花粉增至（96.94±1.95） μmol TE/g DW 松花粉。NaOH 处理的破壁效果明显优于Na₂CO₃,表明强碱处理比弱碱更有效。随着碱浓度的增加,破壁效果先升高后下降,0.30 mol/L NaOH 为最佳浓度。推测过量碱液可能与蛋白质等物质反应,导致可检测营养成分的含量下降。因此,0.30 mol/L NaOH 结合超声处理是最佳的辅助手段。
2.5 碱处理结合酶解对未破壁松花粉主要组分和抗氧化能力的影响
碱处理结合酶解对未破壁松花粉主要组分和抗氧化能力的影响见表2。
表2 碱处理结合酶解对未破壁松花粉主要组分和抗氧化能力的影响
Table 2 Effect of alkali treatment combined with enzymatic hydrolysis on major components and antioxidant capacity of unbroken pine pollen
注：同列不同小写字母表示具有显著性差异（p<0.05）。
组别不碱处理不酶解碱处理不酶解不碱处理酶解碱处理酶解粗蛋白含量/（g/100 g）1.98±0.03d 3.30±0.11c 4.09±0.01b 5.93±0.03a总糖含量/（mg/g）76.46±0.60c 124.80±1.12a 74.43±0.21c 87.72±1.04b总酚含量/（mg GAE/g DW 松花粉）3.95±0.05d 4.20±0.02c 5.19±0.09b 8.19±0.17a总黄酮/（mg RE/g DW 松花粉）1.17±0.05d 2.08±0.03b 1.65±0.04c 2.49±0.06a总三萜含量/（mg UAE/g DW松花粉）8.87±0.26d 10.62±0.27c 11.50±1.36b 18.08±0.52a ABTS 阳离子自由基清除能力/（μmol TE/g DW）56.19±0.83b 43.34±1.25c 95.12±1.84a 96.94±1.95a FRAP/（μmol TE/g DW）5.36±0.07d 7.33±0.06c 8.06±0.19b 9.72±0.28a
由表2 可知,碱处理和酶解均能够提高未破壁松花粉的粗蛋白含量。经过碱处理和酶解后,松花粉的粗蛋白含量升高至（5.93±0.03） g/100 g,较不碱处理不酶解组增加了199%。相比之下,不碱处理酶解组的粗蛋白含量高于碱处理不酶解组,表明酶解在提升粗蛋白含量方面的效果强于碱处理。总酚含量、总三萜含量、ABTS 阳离子自由基清除能力和FRAP 的变化趋势与粗蛋白含量相似,在这4 种处理方式下的排序为碱处理酶解组>不碱处理酶解组>碱处理不酶解组>不碱处理不酶解组。然而,碱处理不酶解组的总糖含量最高,较空白组的（76.46±0.60） mg/g 升高至（124.80±1.12） mg/g,继续酶解后总糖含量反而有所下降,可能是因为多糖被酶解为单糖或其他成分[29]。此外,碱处理不酶解组的总黄酮含量为（2.08±0.03） mg RE/g DW 松花粉,高于不碱处理不酶解组的（1.17±0.05） mg RE/g DW松花粉,而碱处理酶解组的总黄酮含量为（2.49±0.06） mg RE/g DW 松花粉,高于不碱处理酶解组的（1.65±0.04） mg RE/g DW 松花粉。
以上结果表明,碱处理结合酶解具有显著的松花粉破壁作用,能显著提升松花粉中的总糖、总酚、粗蛋白、总三萜等活性成分。松花粉具有萌发孔,碱液浸泡可破坏其结构,超声处理进一步促进碱液与松花粉颗粒的充分接触,随后进行碱性蛋白酶处理,进一步破裂松花粉的内外壁,使得多酚、黄酮、多糖、小肽等小分子活性成分大量溶出,从而提升松花粉水提物的抗氧化活性。
多酚混合标准溶液标与碱处理结合酶解处理组中多酚组分的液相色谱图见图4。
图4 多酚混合标准溶液与碱处理结合酶解处理组中多酚组分的液相色谱图
Fig.4 Liquid chromatograms of polyphenol fractions in polyphenol mixed standards and alkali treatment combined with enzymatic hydrolysis groups
由图4 可知,对比混合标准溶液与样品中的出峰时间,发现共鉴定出4 种多酚：原儿茶酸、咖啡酸、对香豆酸和柚皮素。
碱处理结合酶解对未破壁松花粉多酚组成的影响见表3。
表3 碱处理结合酶解对未破壁松花粉多酚组成的影响
Table 3 Effect of alkali treatment combined with enzymatic hydrolysis on polyphenol composition of unbroken pine pollen
注：同列不同小写字母表示具有显著性差异（p<0.05）。
组别不碱处理不酶解碱处理不酶解不碱处理酶解碱处理酶解原儿茶酸含量/（μg/g ）8.20±0.12c 8.73±0.06c 11.81±0.28b 15.26±0.85a咖啡酸含量/（μg/g）27.16±0.83b 13.80±0.19c 39.01±0.24a 13.07±0.14c对香豆酸含量/（μg/g）33.40±0.12d 76.37±1.50a 35.55±0.59c 74.32±0.92b柚皮素含量/（μg/g）10.46±0.12b 10.42±0.01b 10.45±0.11b 29.19±0.62a
由表3 可知,虽然碱处理酶解后咖啡酸含量有所下降,但是其余3 种多酚含量均显著升高。经碱处理后,原儿茶酸、对香豆酸含量和柚皮素含量显著升高,分别从（8.20±0.12）、（33.40±0.12）、（10.46±0.12） μg/g 松花粉升高至（15.26±0.85）、（74.32±0.92）、（29.19±0.62） μg/g松花粉。
碱处理结合酶解对未破壁松花粉游离氨基酸含量的影响见图5。
图5 碱处理结合酶解对未破壁松花粉游离氨基酸含量的影响
Fig.5 Effect of alkali treatment combined with enzymatic hydrolysis on free amino acid content of unbroken pine pollen
参照图右方的颜色和大小与含量的映射关系,气泡越大,颜色越深,表示含量越高。
由图5 可知,不碱处理酶解组的游离氨基酸含量明显升高,谷氨酸和脯氨酸的含量上升的尤为显著,从（0.17±0.04） mg/g 和（1.24±0.26）mg/g 增至（2.94±0.08） mg/g和（5.16±0.29） mg/g。碱处理酶解组的游离氨基酸总量为（30.04±1.68） mg/g,是空白组（4.15±0.46） mg/g 的7 倍左右。这说明碱性蛋白酶可高效降解松花粉细胞壁和胞内外的蛋白质生成氨基酸、小肽等[30]。
碱处理结合酶解对未破壁松花粉酸解氨基酸含量的影响见图6。
图6 碱处理结合酶解对未破壁松花粉酸解氨基酸含量的影响
Fig.6 Effect of alkali treatment combined with enzymatic hydrolysis on acidolytic amino acid content of unbroken pine pollen
参照图右方的颜色和大小与含量的映射关系,气泡越大,颜色越深,表示含量越高。
由图6 可知,碱处理不酶解组、不碱处理酶解组、碱处理酶解组的酸解氨基酸相比于不碱处理不酶解组均明显升高,同时其粗蛋白含量也显著升高。因此,超声碱处理结合酶解不仅能提高多酚黄酮等活性成分,也能提高氨基酸等小分子营养组分含量[31-32]。
2.6 碱处理-酶解对未破壁松花粉微观结构的影响
为进一步对比碱处理和酶解的破壁效果,采用冷场发射扫描电子显微镜观察其微观结构,结果如图7所示。
图7 碱处理结合酶解对未破壁松花粉微观结构的影响
Fig.7 Effect of alkali treatment combined with enzymatic hydrolysis on microstructure of unbroken pine pollen
A.不碱处理不酶解组；B.碱处理不酶解组；C.不碱处理酶解组；D.碱处理酶解组。
由图7 可知,不碱处理不酶解组（图7A）的细胞结构完整,而碱处理不酶解组（图7B）的细胞壁已出现部分破裂。经过酶解处理后（图7C）,松花粉的破壁程度明显提高。碱处理酶解组（图7D）的松花粉颗粒呈现出最为明显的破碎现象,表明碱处理与酶解协同作用能够有效破坏松花粉细胞壁,从而促进其内部小分子活性成分的充分释放。
3 结论
本研究系统研究了酶解和碱处理对松花粉破壁效果的影响,重点比较了不同酶种类、碱种类及碱浓度对松花粉破壁效率及营养物质溶出效果的影响。在酶解参数优化方面,添加12.5%碱性蛋白酶并在50 ℃条件下酶解1 h 为最优酶解条件,此条件下松花粉的总酚、总黄酮含量及其抗氧化活性均达到峰值。进一步研究发现,在酶解前辅以超声-碱处理协同作用可显著提升破壁效果,其中以0.30 mol/L NaOH 的中浓度强碱处理效果最佳,粗蛋白、总酚、总黄酮及总三萜含量均显著提高,同时ABTS 阳离子自由基清除能力和铁离子还原能力也显著增强。扫描电镜观察显示,碱处理结合酶解后花粉的破碎程度较单一酶解或单一碱处理明显增加。综上所述,采用0.30 mol/L NaOH 碱处理结合超声1 h 后,再添加12.5%碱性蛋白酶于50 ℃酶解1 h,可显著提升未破壁松花粉中总酚、总黄酮等营养成分的溶出,并进一步增强其抗氧化能力。本研究为松花粉功能产品的开发提供了重要的理论依据。
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