桂花是中国十大传统名花之一,主要有金桂、银桂、丹桂、四季桂四大品种[1]。桂花性温味辛,具有健胃、化痰、生津、散痰、平肝的作用,能治痰多咳嗽、肠风血痢、牙痛口臭等[2-3]。桂花中富含黄酮、酚类、萜类等100 多种有效成分,香气清新[4]。因此,桂花成为色香味俱全的纯天然食品佐料。然而,桂花花期短,作为食品原料,桂花的储存尤为重要。糖渍方法保存桂花已经广泛用于生产生活中。李静[5]通过将桂花、蔗糖、蜂蜜混合后,经过10 min 蒸煮,3 d 后食用。此外,新鲜桂花、中药粉、白砂糖和增稠剂作为桂花糖调料被用于餐饮、汤圆甜品、糕点心馅等产品中[6]。本研究将桂花、蜂蜜、蔗糖按一定比例混合制备桂花蜜糖,用于桂花相关食品的添加。
添加益生菌促进食品发酵已经广泛应用于食品领域。黄治国等[7]通过分别添加6 种益生菌酵母,对米酒的发酵有显著的促进作用,并提高米酒酒精度和还原糖含量。在香肠制作中,嗜酸乳杆菌等6 种混合益生菌与醪糟添加至鸡肉和牛肉中,其亚硝酸盐降解率比较高,香肠品质佳[8]。于娟等[9]通过添加红曲霉菌、乳杆菌及混合菌发酵,使普洱茶代谢物含量变化,对茶叶的滋味、香气、汤色会产生不同的影响,且添加红曲霉发酵普洱茶能有效缩短普洱茶发酵时间。总体上,通过添加益生菌食品发酵,能有效地改善食品风味和/或提高食品发酵效率。通过添加益生菌制备桂花蜜糖,也有相关研究报道。蓝擎[10]通过添加乳酸菌制备桂花蜜糖,能提高发酵效率和抑制杂菌。本试验通过16S rRNA 测序,检测传统制备的陈年桂花蜜糖中优势益生菌种群,并通过添加优势复合益生菌,旨在建立高效桂花蜜糖制备体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采用盛花期（3～4 d）桂林市临桂区五通镇桂花种植示范基地金桂作为试验材料,于清晨6:00-7:00 点采摘,低温运输至实验室。经挑选除杂物,用0.2%的维生素C 的溶液清洗晾干备用。
1.2 试验试剂与设备
罗尔斯通氏菌、普雷沃氏菌、厚壁菌、双歧杆菌：北京科展生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、哥伦比亚血平板、酵母膏、番茄浸粉、肝浸粉：北京索莱宝科技有限公司；可溶性淀粉、氯化钠、葡萄糖、L-半胱氨酸、吐温：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖、蜂蜜：桂林市顺昌食品有限公司。
PEN3 电子鼻：德国AIRSENSE 公司；6890N/5973N 气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）：美国Agilent 公司；CellDrop 全自动细胞计数仪：美国DENOVIX 公司；YQX-II 厌氧培养箱：上海恒跃医疗器械有限公司；THZ-100 摇床培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桂花蜜糖的制作
将桂花与蜂蜜按质量比1∶1 混合均匀后,添加3 倍质量的蔗糖,再次混合均匀。随后将混合物装入500 mL 的配备过滤通气孔瓶盖的玻璃瓶中,不超过瓶身的2/3；再加入1 倍质量的蔗糖平铺混合物上方。最终桂花蜜糖中桂花:蜂蜜:蔗糖质量比为1∶1∶4。将制作的糖桂花分为A、B、C、D 4 组,分别在糖渍0.5、1.5、2.5、3.5 年时用于后续试验与检测。复合益生菌添加组预先将菌液与桂花混匀（每500 g 用复合益生菌液体10 mL）,再进行拌糖处理；对照组用等量蒸馏水代替菌液。
1.3.2 电子鼻检测
称取 2 g 桂花蜜糖样品置于至 100 mL 烧杯中,保鲜膜封口,室温下静置 1 h 后,将电子鼻进样针头插入密封烧杯中。测定条件：采样时间为 1 s/组；传感器自清洗时间为 80 s；传感器归零时间为 5 s；样品准备时间为 5 s；进样流量为 400 mL/min；分析采样时间为 80 s。
1.3.3 气相色谱-质谱分析
称取3 g 样品置于20 mL 萃取瓶中,密封,置于60 ℃水浴中,磁力搅拌速度500 r/min,平衡20 min 后,插入萃取针萃取30 min。萃取针使用前,在气质进样口活化20 min（250 ℃）。GC 条件：进样口温度250 ℃,气质接口温度250 ℃,载气流速1.5 mL/min,分流比4∶1。升温程序：初始40 ℃,保持5min,5 ℃/min 升温到250 ℃保持10 min。MS 条件：离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,电子电离（electron ionization,EI）为70 eV,全扫描m/z 35～550 amu。
1.3.4 16S rRNA 测序
16S rRNA 测序由百迈客生物科技有限公司完成,获取的测序数据上传至百迈客云分析平台（https://www.biocloud.net/）,用于后续分析。
分析过程参照Qiime2 中＂Atacama soil microbiome tutorial＂的教程完成（https://docs.qiime2.org/2019.1/）。运用QIIME2 dada2 对数据进行质控、修剪、去噪、拼接以及去除嵌合体后,得到最终的特征序列表格[11]。运用QIIME2 feature-classifier 将扩增子序列变体（amplicon sequence variant,ASV）的代表序列在GREENGENES 数据库中根据按照341F/806R 引物对将数据库修剪到V3V4 的区域进行比对,得到物种的分类信息表[12]。在利用QIIME2 feature-table 剔除了线粒体和叶绿体序列后,利用自适应奈曼-皮尔逊算法（Adaptive Nested Composition-Oriented Multiple Testing,ANCOM）、方差分析（analysis of variance,ANOVA）、克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal Wallis test）等方法来鉴定分组和样本间丰度有差异的细菌[13]。 样本本身的多样性程度用QIIME2 core-diversity 对样本进行Alpha多样性指数分析,包括Chao1、Simpson 指数分析等,并随后用PCoA 图来进行展示[14]。 基于样本中主要微生物物种相对丰度,使用共现网络分析计算斯皮尔曼等级相关系数用于了解物种之间的关联。除此之外,应用PICRUSt 软件预测了微生物群体可能的功能组成[15]。
1.3.5 微生物培养
经活化的罗尔斯通氏菌（Ralstonia picketti）接种到牛肉膏/蛋白胨液体培养基（每升含有牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g）中,在30 ℃摇床培养箱中培养24～48 h。将类球布劳特氏菌（Blautia coccoides）和中间普氏菌（ Prevotella intermedia）接种到哥伦比亚血平板（CA-B）,并置于37 ℃厌氧培养箱中培养4～5 d。将长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）接种到双歧杆菌培养基（蛋白胨 15.0 g,葡萄糖 20.0 g,酵母膏 2.0 g,可溶性淀粉 0.5 g,氯化钠 5.0 g,L-半胱氨酸 0.5 g,番茄浸粉5.0 g,肝浸粉 2.0 g,吐温80 mL,水1 L）中,在37 ℃厌氧培养箱中培养48～72 h。将培养的菌种经无菌水清洗2 次,在全自动细胞计数仪对细菌进行计数,并按罗尔斯通氏菌∶布劳特氏菌∶普雷沃氏菌∶双歧杆菌=20∶1∶1∶5 菌数比例重悬,混合菌浓度为1×109 个/mL。
1.4 数据分析
数据以平均值±标准差表示,用 Graphpad Prism 8.0 软件进行单因素方差分析（多组分间的比较）和独立样本 t 检验（两组比较）,并用Adobe Illustrator 和Photoshop 软件联合作图。以 P<0.05 判定为差异显著。
2 结果与分析
2.1 糖渍时间对桂花蜜糖保存效果的影响
因桂花花期短,花期单季节,而桂花作为食品添加需求量大,因此桂花的储存尤为重要。将盛花期的桂花按传统方法与蜂蜜、蔗糖进行精心配制,用于桂花的糖渍制作。经过糖渍0.5、1.5、2.5、3.5 年后,结果见图1。
图1 不同糖渍时间的桂花蜜糖
Fig.1 Osmanthus syrup preserved for different years
A. 0.5 年；B. 1.5 年；C. 2.5 年；D. 3.5 年。
从图1 中可以看出,桂花在颜色上没有明显的差异,未随着糖渍时间延长而发生褐化现象。可见糖渍能有效保持桂花的花型、花色。
2.2 桂花蜜糖气味的感官组成
桂花的花香成分能否有效保存并渗透进入糖基质中,是桂花蜜糖生成的关键。用电子鼻系统分析不同时间糖渍（0.5、1.5、2.5、3.5 年）的桂花蜜糖气味感官组成,结果如图2 所示。
图2 电子鼻分析不同糖渍时间的桂花蜜糖气味的感官组成
Fig.2 Electronic nose analysis of the sensory composition of the odor of osmanthus honey candy stored after being sugared for different periods of time
*表示差异显著,P<0.05；**表示差异极显著,P<0.01；***表示差异高度显著,P<0.001。A. 芳香成分；B.烷烃芳香成分；C.苯类芳香成分；D. 无机硫类；E.氮氧化物类；F.醇醚醛酮类；G.短链烷烃；H.长链烷烃。
由图2 可知,随着桂花蜜糖渍时间的延长,桂花蜜糖基质中烷烃类、苯类等芳香烃类气味在糖渍1.5 年时达到最大值,并在之后逐渐下降。同样,随着糖渍时间的延长,桂花蜜糖基质中无机硫、氮氧化物、醇醚醛酮、短链烷烃和长链烷烃均在糖渍1.5 年时达到峰值,并在之后逐渐下降。说明桂花中成分逐渐释放至糖基质中,在糖渍1.5 年时达到最大值,随后逐渐下降。
2.3 不同糖渍时间的桂花蜜糖中的花香分子含量
为了验证随着时间变化糖渍的桂花蜜糖基质中桂花的香气成分释放和保留情况,用气相色谱-质谱联用仪分析不同糖渍时间的糖基质中桂花香气成分,检测结果见表1。
表1 气相色谱-质谱联用分析不同糖渍时间的桂花蜜糖中的花香分子含量
Table 1 GC-MS analysis of the content of floral fragrance molecules in osmanthus honey candy under different sugaring and storage durations
化学成分含量/（μg/g）香气类型顺式-氧化芳樟醇（呋喃型）反式-氧化芳樟醇（呋喃型）顺式-氧化芳樟醇（吡喃型）反式-氧化芳樟醇（吡喃型）α-紫罗兰酮二氢-β-紫罗兰酮2,4-二叔丁基苯酚脱氢芳樟醇α-松油醇γ-癸内酯0.5 年0.611 0 0.750 1 0.083 7 0.249 8 0.005 3 0.010 6 0.022 0 0.427 6 0.087 0 0.101 2 1.5 年0.826 2 0.971 0 0.114 8 0.269 1 0.026 6 0.017 8 0.034 3 0.058 0 0.022 4 0.039 9 2.5 年0.106 7 0.169 9 0.052 2 0.135 1 0.004 4 0.012 1 0.011 9 3.5 年0.077 7 0.142 4 0.041 1 0.102 7花香花香花香、柑橘香气花香、柑橘香气紫罗兰香、果香花香、木香、果香酚香、焦香花香、薰衣草香海桐花香、铃兰香桃香、油脂香
由表1 可知,氧化芳樟醇[包括顺式-氧化芳樟醇（呋喃型）、反式-氧化芳樟醇（呋喃型）、顺式-氧化芳樟醇（吡喃型）、反式-氧化芳樟醇（吡喃型）]作为桂花的主要芳香成分在糖渍1.5 年时能充分进入蜜糖中,达到峰值。随着糖渍时间的延长含量下降,但仍能保持一定的水平。其他芳香成分（如α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、2,4-二叔丁基苯酚、α-松油醇、γ-癸内酯）在糖渍1.5 年时的蜜糖中检测出较高的水平,并随着糖渍时间的延长,其含量也逐渐下降。这些结果表明,桂花蜜糖中成分缓慢进入糖基质中,并在糖渍1.5 年时达到峰值。随后,蜜糖中成分逐渐开始降解或挥发。说明糖渍能较好地保留桂花的主要香气成分。
2.4 桂花蜜糖中益生菌群落优势形成
用传统糖渍方法制备的桂花蜜糖中,观察到持续的气泡产生。说明微生物发酵在桂花蜜糖形成中发挥着重要作用。为探索微生物在桂花蜜糖形成中的作用,对糖渍0.5、1.5、2.5、3.5 年的桂花蜜糖进行了16S rRNA 测序,并对结果进行生物信息学分析,分析结果见图3。
图3 不同糖渍时间的桂花蜜糖16S RNA 测序
Fig.3 16S RNA sequencing of osmanthus syrup after storage for different years
A. 桂花蜜糖中微生物种类韦恩图；B. 桂花蜜糖中在门分类水平的热图；C. 桂花蜜糖的Cahol 指数箱型图；D. 桂花蜜糖的Simpsom 指数箱型图；E. 桂花蜜糖的前20 种菌属相对丰度的柱形图。
图3 结果显示,所有时间的糖渍桂花蜜糖中包含有116 个相同的菌群（图3 A）,其主要分布在变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）中,其物种在门水平上大部分以致病菌门减少的趋势发展（图3 B）。通过Chaol 指数分析显示,糖渍1.5 年时的桂花蜜糖酿中群落的丰富度最低（图3 C）；Simpson 指数分析发现,在糖渍1.5 年时的桂花蜜糖酿中优势菌群的地位和作用大于其他年份的桂花蜜糖酿（图3 D）。说明在糖渍0～1.5 年,是桂花蜜糖酿发酵的关键时段。分析了前20 种微生物,发现罗尔斯通菌（Ralstonia）、普雷沃氏菌（Prevotella）、厚壁菌（Blautia）、双歧杆菌（Bifidobacterium）等益生菌在桂花蜜糖酿发酵过程微生物的数量广泛存在,并为优势菌群起作用（图3 E）。罗尔斯通菌具有抗氧化和降解苯酚等有害物质的作用[16-17],可能在桂花蜜糖的护色与去除刺激性气味中发挥重要作用。普雷沃氏菌、双歧杆菌是公认的益生菌,参与纤维素和多糖具有对碳水化合物的分解[18-19],可能参与桂花细胞壁的裂解,释放香气物质。厚壁菌（Blautia）是人体肠道微生物的核心菌门之一[20],参与碳水化合物的分解和发酵,并产生短链脂肪酸[21],加强蔗糖与蜂蜜的融合。这些结果显示了桂花蜜糖在发酵过程中,优势益生菌群落形成,并可能在桂花蜜糖形成过程中发挥关键作用。
2.5 复合益生菌添加对缩短桂花蜜制作周期及气味组成的影响
为缩短桂花蜜糖成品的发酵时间,按糖渍1.5 年时的桂花蜜糖中益生菌的比例添加罗尔斯通氏菌、普雷沃氏菌、厚壁菌、双歧杆菌等益生菌,辅助菌群的优势生长,并利用电子鼻系统对添加复合益生菌的桂花蜜糖气味组成进行分析,结果见图4。
图4 电子鼻分析添加复合益生菌桂花蜜糖气味
Fig.4 Electronic nose analysis of the odor of osmanthus syrup added with complex probiotics
*表示差异显著,P<0.05；**表示差异极显著,P<0.01。A. 芳香成分；B.烷烃芳香成分；C.苯类芳香成分；D.无机硫类；E.氮氧化物类；F.醇醚醛酮类；G.短链烷烃；H.长链烷烃。
由图4 可知,添加复合益生菌的桂花蜜糖基质中烷烃类、苯类等芳香烃类气味较对照组显著增加（P<0.05）；同时,添加混合微生物的桂花蜜糖基质中无机硫、氮氧化物、醇醚醛酮、短链烷烃和长链烷烃显著增加（P<0.05,P<0.01）。综上,添加复合益生菌有助于桂花中成分快速释放至糖基质中。
为了验证糖基质中桂花的香气成分释放和保留情况,利用GC-MS 分析了添加复合益生菌糖渍0.5 年时的桂花蜜糖中香气成分,结果见表2。
表2 气相色谱-质谱联用分析不同处理方式桂花蜜糖中的花香分子含量
Table 2 GC-MS analysis of aroma component content in osmanthus syrup treated in different ways
注：-表示未检出。
化学成分含量/（μg/g）化学成分含量/（μg/g）对照组顺式-氧化芳樟醇（呋喃型）反式-氧化芳樟醇（呋喃型）顺式-氧化芳樟醇（吡喃型）反式-氧化芳樟醇（吡喃型）二氢-β-紫罗兰酮脱氢芳樟醇2,4-二叔丁基苯酚芳樟醇苯甲酸苄酯棕榈酸甲酯α-松油醇γ-癸内酯对照组0.590 3 0.607 1 0.075 4 0.211 5 0.810 6 0.400 3 0.037 6 0.518 0 0.170 4 0.165 8 0.128 8 0.092 7添加复合益生菌组0.653 2 0.717 7 0.108 3 0.261 7 1.083 4 0.408 4 0.045 2 0.571 7 0.209 3 0.162 2 0.139 9 0.088 2对甲氧基苯乙醇香豆素月桂酸甲酯反油酸甲酯肉豆蔻酸甲酯二氢茉莉酮酸甲酯亚麻酸乙酯β-紫罗兰酮香叶醇苯甲醛α-紫罗兰酮-- - - - - -0.010 6-- -添加复合益生菌组0.023 0 0.012 5 0.009 7 0.016 5 0.021 8 0.014 1 0.012 4 0.009 4 0.001 2 0.002 6 0.025 4
由表2 可知,顺式-氧化芳樟醇（呋喃型）、反式-氧化芳樟醇（呋喃型）、顺式-氧化芳樟醇（吡喃型）、反式-氧化芳樟醇（吡喃型）、α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、2,4-二叔丁基苯酚、α-松油醇在均能在添加复合益生菌的蜜糖中检测出比对照组更高的水平。同时,在添加复合益生菌的蜜糖检测出桂花其他的芳香成分,如β-紫罗兰酮、香叶醇、棕榈酸甲酯、亚麻酸乙酯、苯甲醛等,这些成分在对照组中检测出少量,或者未检测出。这些结果表明,通过添加益生菌能有效将桂花香气成分加速渗透到蜜糖。可见添加益生菌能加快桂花蜜糖的形成。
3 结论
传统桂花蜜糖在不同年限仍能保持花型、花色、香气感官与香气成分丰度,其中在糖渍1.5 年时品质最佳,添加复合益生菌制备的桂花蜜糖能缩短桂花蜜制备时间。然而,因制备时间、制备周期、各年份桂花的差异,不能将添加复合益生菌的桂花蜜糖（糖渍0.5年）中各项指标与传统糖渍1.5 年时的桂花蜜糖进行对比,不能有效地对比两者优劣。此外,添加复合益生菌的桂花蜜糖在糖渍0.5 年时虽然香气成分能绝大部分渗透入糖基质中,但蔗糖颗粒与蜂蜜未能完全融合,仍需要时间融合。
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