薏苡（Coix lacryma-jobi L.）又称苡仁米、回回米、药王米、六谷米等,为禾本科薏苡属草本植物,其营养和药用价值极高,有着“世界禾本科植物之王”的美誉[1-2]。薏苡起源于亚洲,主要分布在我国及印度和缅甸等热带季风气候地区,而我国作为薏苡的起源地之一,拥有十分丰富的薏苡资源,除青海、甘肃和宁夏等少部分地区外,其他各省均有薏苡的种植,其中薏苡种植面积较大的省份主要是广西、贵州、云南等[3-5]。薏苡仁是薏苡植株成熟干燥的种仁,作为天然保健食品资源己被国内外所重视,并成为我国重要的出口创汇农产品。薏苡仁富含多糖、萜类、黄酮类、甾醇类、生物碱及内酰胺类等多种活性成分,并具有降血糖、抗氧化、保肝、增强免疫力、利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结等功效[6-10]。薏苡素是薏苡中多种有效活性成分之一,对癌细胞有抑制作用,且对中枢神经系统有镇静、镇痛的作用[11-12],同时还具有抗衰、美容等保健功效[13]。因此,薏苡素具有较高的应用价值,提取方法的选择和优化对其资源利用至关重要。
目前,对薏苡素的提取多采用索氏提取法。李厚聪等[14]和蒙秋伊等[15]均使用索氏提取法对薏苡根粉末进行处理以提取出薏苡素,不仅加热时间长,耗费的有机溶剂多,且样品前处理复杂,不易操作,易造成试验资源的浪费。超声辅助提取是利用超声波引起的强振动、高速度的机械效应和强烈的空化效应,促进植物组织细胞壁破裂,加快有效成分向溶剂中的迁移,以达到提高产量、减少提取时间和避免高温影响提取成分的目的,具有溶剂消耗少和成本低等优势[16-19]。传统的正交设计法是建立在线性数学模型基础上的,虽然它可以得到多个正交设计,但只能对离散数据进行分析,精度低,预测性差[20]。Box-Behnken 设计采用非线性模型,可以得到高精度的回归方程,并对最佳工艺条件进行合理预测,精确度更高、模拟程度更好,更适合于多因素、多水平共同影响的试验,是一种广泛使用的分析和预测方法,不仅可以确定自变量之间的相互作用,而且减少了试验次数、开发时间和总体成本[21]。
因此,为进一步提高薏苡素的提取效率,充分利用薏苡仁资源,本研究在超声辅助提取的基础上,采用Box-Behnken 设计响应面法优化薏苡仁中薏苡素的提取工艺,以期为薏苡素的高值化利用及其在功能食品领域中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
薏苡仁：市售,挑选颗粒饱满、无虫蛀霉烂的薏苡仁；薏苡素标准品（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇（分析纯）：重庆川东化工有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity Ⅱ）、色谱柱（Agilent ZORBAX SB-C18）：美国安捷伦科技有限公司；数控超声波清洗器（KQ-500DE）：昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发器（RE-52A）、循环水真空泵（YRPTB）：上海亚荣生化仪器厂；电子天平（DJ-A2000）：华志（福建）电子科技有限公司；多功能粉碎机（BJ-750A）：杭州拜杰科技有限公司；电热鼓风干燥箱（XGQ-2000）：余姚市星辰仪表厂；高速冷冻离心机（Sorvall ST 8R）：美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 超声辅助提取薏苡仁中薏苡素工艺
挑选颗粒饱满、无虫蛀霉烂的薏苡仁放置在40 ℃烘箱内烘干24 h,经粉碎机粉碎后,精密称定一定量的薏苡仁粉末（过100 目筛）,放置于圆底烧瓶中,加入适量甲醇,用超声频率40 kHz 的超声波处理薏苡仁粉末,而后在4 000 r/min 下离心10 min,取上清液,40 ℃旋转蒸发真空浓缩至2 mL,得到含有薏苡素的溶液,用微孔滤膜（0.45 μm）滤过装入试样小瓶,密封放入-20 ℃冰箱保存待测[22]。
1.3.2 薏苡素含量测定
1.3.2.1 色谱条件
流动相：乙腈-水（25∶75,体积比）；流速：1.0 mL/min；色谱柱温度：25 ℃；进样量：20 μL；检测波长：232 nm；色谱柱：ZORBAX SB-C18 柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）。
1.3.2.2 标准品配制
用电子天平精密称取薏苡素标准品1 mg,加甲醇溶解定容到10 mL,配制成浓度为100 μg/mL 的标准品溶液。按上述色谱条件,取标准品溶液和样品溶液进样分析[14-15]。
1.3.2.3 线性回归方程
精确吸取5 mL 薏苡素标准品溶液,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成50 μg/mL 薏苡素标准品溶液。稀释至浓度分别为30、15、9、1、0.5、0.1、0.01 μg/mL,精密吸取1 mL 标准品溶液经0.2 μm 尼龙膜过滤,测定峰面积。以标准品溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归,计算得线性回归方程y=27.617x-0.036 3（R²=0.999 8）。
1.3.2.4 薏苡素含量计算
根据样品测得的色谱吸收峰的峰面积,按外标法计算薏苡素含量。每个样品重复 3 次,取平均值。样品中的薏苡素含量（x,mg/kg）的计算公式如下。
式中：c 为通过标准曲线求出的薏苡素含量,μg/mL；V 为薏苡素样品的定容体积,mL；m 为薏苡样品的质量,g。
1.3.3 超声辅助提取薏苡仁中薏苡素单因素试验
1.3.3.1 料液比对薏苡素含量的影响
在甲醇含量为80%、超声温度40 ℃、超声时间60 min、超声功率300 W、超声频率40 kHz 的条件下,分别设置料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）,考察料液比对薏苡素含量的影响。
1.3.3.2 甲醇含量对薏苡素含量的影响
在料液比1∶2（g/mL）、超声温度40 ℃、超声时间60 min、超声功率300 W、超声频率40 kHz 的条件下,分别设置甲醇含量为60%、70%、80%、90%、100%,考察甲醇含量对薏苡素含量的影响。
1.3.3.3 超声时间对薏苡素含量的影响
在甲醇含量80%、超声温度40 ℃、料液比1∶2（g/mL）、超声功率300 W、超声频率40 kHz 的条件下,分别设置超声时间40、50、60、70、80 min,考察超声时间对薏苡素含量的影响。
1.3.3.4 超声温度对薏苡素含量的影响
在甲醇含量为80%、料液比1∶2（g/mL）、超声功率300 W、超声频率 40 kHz 、超声时间60 min 的条件下,分别设置超声温度为30、35、40、45、50 ℃,考察超声温度对薏苡素含量的影响。
1.3.3.5 超声功率对薏苡素含量的影响
在甲醇含量为80%、料液比1∶2（g/mL）、超声时间60 min、温度40 ℃、超声频率40 kHz 的条件下,分别设置超声功率为200、250、300、350、400 W,考察超声功率对薏苡素含量的影响[23-24]。
1.3.4 超声辅助提取薏苡仁中薏苡素响应面试验设计
在单因素试验的基础上,固定超声时间70 min、超声温度40 ℃,进行响应面优化试验,研究薏苡素提取工艺的最佳条件。以筛选出的料液比、甲醇含量和超声功率为响应变量,提取的薏苡素含量为响应值进行三因素三水平的Box-Behnken 中心组合试验,以优化超声辅助提取薏苡素工艺。响应面试验设计因素与水平设计见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels used in response surface methodology
水平-1 01 A 料液比/（g/mL）1∶1 1∶2 1∶3 B 甲醇含量/%70 80 90 C 超声功率/W 300 350 400
1.4 数据处理
所有试验均重复3 次,数据表示为平均值±标准差。使用Design-Expert 11、IBM SPSS Statistics 2.0 和GraphPad Prism 8 进行数据分析和作图,p<0.05 表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 超声辅助提取薏苡仁中薏苡素单因素试验结果
2.1.1 料液比对薏苡素含量的影响
料液比对薏苡素含量的影响见图1。
图1 料液比对薏苡素含量的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on coixol content
由图1 可知,薏苡素含量随着溶剂添加量增加先升高后降低再趋于平缓。当料液比为1∶2（g/mL）时,薏苡素含量达到最大,为（5.72±1.51）mg/kg。随着溶剂添加量继续增加,薏苡素含量下降,当达到料液比1∶4（g/mL）后,薏苡素含量又缓慢上升,但是上升幅度不高。这是因为在一定范围内,随着溶剂添加量的增加,薏苡仁粉与80%甲醇提取液的接触面积越来越大,薏苡素更容易浸出,但是由于薏苡仁中薏苡素含量相较于薏苡植株其他部位含量不高,溶剂量增加也会使溶质被进一步稀释,致使到达一定的料液比之后,即使增加溶剂量,薏苡素含量变化不明显。因此,选取料液比1∶1、1∶2、1∶3（g/mL）进行响应面优化试验。
2.1.2 甲醇含量对薏苡素含量的影响
甲醇含量对薏苡素含量的影响见图2。
图2 甲醇含量对薏苡素含量的影响
Fig.2 Effect of methanol content on coixol content
由图2 可知,随着甲醇含量从60% 提高到80%,薏苡素含量先降低后逐渐增加,当甲醇含量为80%时,薏苡素含量达到最大值,为（3.85±0.59）mg/kg。继续增加甲醇含量,薏苡素含量反而降低。由此可知,适宜的甲醇含量有利于薏苡素的溶出,高含量甲醇溶剂可能会破坏已浸出的薏苡素,这可能与其性质有关,因此薏苡素含量有所下降。此外,甲醇含量过高也会造成生产成本升高和资源的浪费。因此,选取甲醇含量为70%、80%、90%进行响应面优化试验。
2.1.3 超声时间对薏苡素含量的影响
超声时间对薏苡素含量的影响见图3。
图3 超声时间对薏苡素含量的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on coixol content
超声波对细胞的作用时间是影响细胞破碎的重要因素。由图3 可知,薏苡素含量随着超声时间的延长呈现先升高后降低的趋势。当超声时间在70 min 以内时,薏苡素含量一直处于缓慢上升的状态,可能是由于超声波对细胞膜的破碎作用随时间延长膜破碎程度逐渐增强,薏苡素含量也不断提高,在超声时间为70 min 时,薏苡素含量达到峰值。继续延长超声时间,溶液体系渗透压达到平衡,薏苡素含量基本达到平衡。70 min 后,薏苡素含量开始下降,其原因可能是随着超声时间的延长,超声处理会减小扩散的面积、降低扩散速率、增大扩散距离[25],降低了薏苡素的含量。因此,选取最优超声时间为70 min。
2.1.4 超声温度对薏苡素含量的影响
超声温度对薏苡素含量的影响见图4。
图4 超声温度对薏苡素含量的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on coixol content
由图4 可知,薏苡素含量随着超声温度的升高呈现先升高后降低的趋势。当超声温度为40 ℃时,薏苡素含量达到最大值,为（3.83±0.37）mg/kg。在超声温度超过40 ℃后,薏苡素含量降低。这可能由于温度的升高,很多分子剧烈运动由有序变成无序,薏苡仁粉组织结构遭到破坏,使甲醇溶剂更容易渗透和溶解薏苡素,使薏苡素含量增高；当温度到达40 ℃以后,较高的温度使薏苡素分子结构被破坏,导致薏苡素含量下降,且温度过高溶剂会过度挥发。因此,选取40 ℃为适宜的超声温度。
2.1.5 超声功率对薏苡素含量的影响
超声功率对薏苡素含量的影响见图5。
图5 超声功率对薏苡素含量的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on coixol content
由图5 可知,薏苡素含量随着超声功率的增大呈现先降低后升高又降低的趋势。在超声功率处于250～350 W,薏苡素含量随着超声功率的增加而明显上升,当超声功率为350 W 时,薏苡素含量达到最大值,为（4.32±0.14）mg/kg。但随着超声功率的进一步增加,细胞膜进一步破碎,使得提取液中部分薏苡素结构被破坏,溶解杂质也相应的增加,有效成分溶解量随之减少,导致含量稍有所减少。因此,选取超声功率300、350、400 W 进行响应面优化试验。
2.2 超声辅助提取薏苡仁中薏苡素响应面优化结果
2.2.1 响应面试验设计方案与结果
选定料液比、甲醇含量及超声功率3 个因素作为试验变量,以薏苡素含量为响应值,采用Design-Expert 11 设计三因素三水平的响应面优化试验来获得最佳试验条件。响应面优化试验数据结果见表 2。
2.2.2 模型建立与方差分析结果
利用Design-Expert 11 软件对表2 中的薏苡素含量进行多项式拟合,建立二次多项式回归模型方程为Y=12.30+0.918 9A+1.01B-1.54C-0.897 7AB-0.082 6AC-2.05BC-6.97A2-2.81B2-4.00C2。
表2 响应面试验设计方案与结果
Table 2 Response surface experiment design and results
试验号C 超声功率123456789 1 0 A 料液比-1 1-1 1-1 1-1 B 甲醇含量-1-1 0000-1-1 10 0 110000-11 11-1-1 Y 薏苡素含量/（mg/kg）0.17±0.00 3.58±1.63 3.26±0.85 3.08±0.57 0.35±0.14 2.58±0.51 0.27±0.07 2.17±0.58 5.03±2.95 11.86±4.05
续表2 响应面试验设计方案与结果
Continue table 2 Response surface experiment design and results
试验号11 12 13 14 15 16 17 A 料液比C 超声功率00 0 0 0 0 0 B 甲醇含量-1 10 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 Y 薏苡素含量/（mg/kg）3.23±1.13 1.86±0.43 11.06±2.41 11.55±1.86 11.06±2.41 13.49±0.06 14.36±2.56
回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验结果见表3。
表3 回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验结果
Table 3 Analysis of variance for the established regression model and significance test of regression coefficient
注：*表示影响显著（p<0.05）；**表示影响极显著（p<0.01）。
方差来源模型自由度 显著性**AB C A B AC BC A2 B2 C2 F 值11.429 7 1.790 1 2.150 7 5.005 6 0.854 2 0.007 2 4.451 4 54.167 8 8.831 4 17.815 1 p 值0.002 0 0.222 7 0.185 9 0.060 3 0.386 1 0.934 6 0.072 8 0.000 2 0.020 8 0.003 9*****残差失拟项纯误差总和离差平方和388.202 5 6.755 4 8.116 3 18.890 3 3.223 4 0.027 3 16.798 8 204.419 7 33.328 2 67.231 0 26.416 8 17.118 5 9.298 2 414.619 3 91 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6均方43.133 6 6.755 4 8.116 3 18.890 3 3.223 4 0.027 3 16.798 8 204.419 7 33.328 2 67.231 0 3.773 8 5.706 2 2.324 6 2.454 7 0.202 9
由表3 可知,该模型F 值为11.429 7,p<0.01,表明回归模型具有很好的显著水平；所建立回归模型的决定系数R2=93.63%>90.00%,具有较强的线性关系,可较好地预测薏苡素含量。模型二次项A2、C2 对薏苡素含量有极显著影响（p<0.01）,二次项B2 有显著影响。模型失拟项p>0.05,说明薏苡素含量的实测值与预测值拟合较好,即该回归模型稳定,理论与实际的拟合性大,该方程对试验结果拟合良好,试验误差小,能很好地反映试验结果。
2.2.3 模型因素交互作用效应分析结果
响应面分析图是由响应值和各试验因素组成的立体曲面图,可直观表明因素之间的交互作用；等高线形状反映因素交互效应的强弱,椭圆形表示交互效应显著,圆形则相反[26-27]。根据Design Expert 11 所得各因素间的交互作用对薏苡仁中薏苡素含量的影响,响应面图和等高线如图6～图8 所示。
图6 料液比与甲醇含量交互作用的响应面和等高线
Fig.6 Response surface and contour plot of the interaction between solid-liquid ratio and methanol content
由图6 可知,料液比对薏苡素含量的影响大于甲醇含量,响应面坡度较大,且等高线图趋向于椭圆形,说明料液比和甲醇含量有显著的交互作用。由图7可知,薏苡素含量随料液比的增大和超声功率的升高呈先增后减的变化趋势,当料液比和超声功率分别为1∶2（g/mL）和350 W 时,薏苡素含量达到最高值。由图8 可知,响应面坡度较为平缓,甲醇含量和超声功率对薏苡素含量的影响较小,随着甲醇含量的增加,薏苡素含量逐渐升高后趋于平缓。
图7 料液比与超声功率交互作用的响应面和等高线
Fig.7 Response surface and contour plot of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power
图8 甲醇含量与超声功率交互作用的响应面和等高线
Fig.8 Response surface and contour plot of the interaction between methanol content and ultrasonic power
2.2.4 模型的验证结果
通过对试验数据分析优化可知,预测薏苡仁中薏苡素提取最佳工艺为料液比1∶2.05（g/mL）、甲醇含量82.65%、超声功率347.40 W,在此条件下预测提取薏苡素含量最高值为12.66 mg/kg。结合实际需要和试验操作的可行性,将最优超声波辅助提取条件调整为料液比1∶2（g/mL）、甲醇含量83%、超声功率347 W,在此条件下进行验证试验,薏苡素含量为11.88 mg/kg,与预测值接近,说明该响应面结果可靠。
3 结论
本研究以薏苡仁为研究对象,对薏苡仁中含有的薏苡素采用超声辅助提取,利用单因素试验对提取条件（料液比、甲醇含量、超声时间、超声温度和超声功率）进行考察,在单因素试验的基础上进行响应面试验设计,结果表明响应面分析的模型良好,准确度高。通过模型得到提取薏苡素的最佳工艺为料液比为1∶2（g/mL）、甲醇含量为83%、超声功率为347 W,采用优化后的提取条件测得薏苡素含量为11.88 mg/kg,与预测值12.66 mg/kg 接近,因此可认为该提取工艺能较好地反映实际情况。结果表明,采用超声辅助提取薏苡仁中薏苡素的工艺,具有操作简便、检测快速和数据准确等优点,可为薏苡素的进一步开发与应用提供理论基础。
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