藏羊是我国珍贵的畜种资源,主要分布在青藏高原地区,该地区特殊的高海拔、高寒、缺氧的环境造就了独特的畜种资源[1]。藏羊骨是藏羊屠宰后的主要副产物,近年来随着青海省畜牧业高质量发展,藏羊骨逐年增加,但还未被充分利用,往往作为废物丢弃,不仅造成珍贵资源的浪费,也带来环境污染问题。畜骨营养丰富,含有约20%的优质蛋白质,其中90%为胶原蛋白,水解产物主要为胶原多肽和氨基酸,具有较高的生物活性,例如抗氧化[2]、降血脂[3]、抗骨质疏松[4]、血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性[5]、调节免疫[6]、抗菌[7]等。研究表明,酶解牦牛骨粉得到的牦牛骨多肽液,其显示出较好的抗氧化活性[8]。经中性蛋白酶对猪骨酶解,产物显示出较好的降血脂活性[9]。但是,关于青藏高原的特色畜产品藏羊骨的研究鲜见。
高脂血症是指血浆中一种或多种脂质异常升高导致的疾病[10],其中包括总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的异常升高 [11]。血脂异常与心血管疾病和脂肪肝等疾病密切相关[12],氧化应激是导致血脂异常的一个重要因素,它可以促进脂质过氧化反应、增加动脉粥样硬化的发生,并导致胆固醇的氧化,进一步损伤血管内皮细胞,促进动脉斑块的形成[13]。徐立群等[14]关注于辛伐他汀对高脂血症患者炎症状态和氧化应激水平的影响,发现高脂血症患者在受到辛伐他汀治疗后,氧化应激指标丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平明显升高,而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）水平明显降低,表明辛伐他汀可通过抗氧化应激机制对高脂血症患者起到保护作用。研究发现,抗氧化物质通过抑制氧化应激和调节胆固醇等途径来减少脂质过氧化和降低血浆胆固醇水平,从而实现降血脂的效果[15]。目前临床常用的降血脂药物存在一系列副作用,而天然提取物中的多肽能有效抑制高血脂症,如蛋白质及其多肽[16]、脂肪酸[17]等。多肽中特有的氨基酸能影响脂类物质的代谢,从而减少对脂类物质的吸收。
作为畜牧业大省,青海省藏羊养殖数量逐年提升,但屠宰加工副产物羊骨还未被充分利用,造成了资源的大量浪费。因此,本研究利用酶解法从藏羊骨中制备多肽,并通过体外试验评估其抗氧化和降血脂活性,以深入研究藏羊骨的精深加工技术并提高其附加值,以期为开发相关产品提供更有力的科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
藏羊骨：海晏金藏生态高原藏羊养殖繁育专业合作社；胰蛋白酶（2.5×105 U/g）、碱性蛋白酶（2×105 U/g）、胃蛋白酶（3×103 U/g）、中性蛋白酶（5×104 U/g）、风味蛋白酶（1.5×104 U/g）、木瓜蛋白酶（1×105 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；4-硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate,PNPB）、胰脂肪酶（来自猪胰腺,8 U/mg）：美国Sigma公司；Tris-HCl 溶液、丝氨酸、邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde,OPA）、二硫代苏糖醇（dithiothreitol,DTT）、2,2′-联氨基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2,2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）,ABTS]、2,2-二苯基-1-苦味肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）：上海源叶生物科技有限公司；四硼酸钠：上海广诺化学科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
XS205 分析天平：上海精若科学仪器有限公司；雷磁PHSI-5 实验室pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；Thermo scientific ST 8R 台式冷冻高速离心机：孚约生物科技（上海）有限公司；GHH-1 数显恒温水浴锅：常州市国旺仪器制造有限公司；DFY-500C 小型多功能粉碎机：温岭市林大机械有限公司；TECAN Spark酶标仪：上海滴冠实业有限公司；FD-1A-50 冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 骨的预处理
藏羊骨经120 ℃高压2 h,剔除软肉、筋膜等组织,干燥,粉碎机粉碎,过四号筛得骨粉。取部分样品参照 GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[18]的凯式定氮法测定羊骨中蛋白质的含量。
1.2.2 蛋白酶的筛选
取骨粉1 g,加入10 mL 去离子水,超声溶解,分别加入风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶进行酶解,调节各个酶的最适pH值和温度,经酶解反应后,灭活10 min,以3 500 r/min离心10 min,获得上清液,测定上清液的水解度,筛选出适宜的蛋白酶。6 种酶的酶解条件见表1。
表1 6 种蛋白酶的酶解条件
Table 1 Enzymolysis conditions of six proteases
蛋白酶种类风味蛋白酶胰蛋白酶碱性蛋白酶木瓜蛋白酶中性蛋白酶胃蛋白酶温度/℃55 37 50 55 45 37底物浓度/%10 10 10 10 10 10酶解时间/h 酶添加量/%55 5 5 5 5 pH 值7.0 8.0 9.0 7.0 7.0 2.0 88 8 8 8 8
1.2.3 骨肽制备的单因素试验
在确定最适蛋白酶基础上,对酶解条件进行单因素试验。以水解度为指标,分别探讨pH 值、温度、酶解时间、酶添加量和底物浓度对酶解液水解度的影响。各因素单因素试验水平见表2。
表2 单因素试验
Table 2 Single-factor tests
pH 值8.5 9.0 9.5 10.0 10.5温度/℃35 40 45 50 55酶解时间/h 酶添加量/%底物浓度/%34567 24681 0 4681 0 12
1.2.4 响应面优化试验
采用Design-Expert 13 软件建立响应面试验。在单因素试验的基础上,选取pH 值、酶添加量、温度和底物浓度4 个因素,以水解度为指标,进行四因素三水平的响应面试验,因素与水平见表3。
表3 响应面试验设计因素与水平
Table 3 Factors and levels of response surface test design
水平-1因素A pH 值9.5 10.0 10.5 B 温度/℃40 45 50 C 酶添加量/%01 68 1 0 D 底物浓度/%8 10 12
1.2.5 水解度测定
采用领苯二甲醛法（OPA 法）测定水解度,参照林虬等[19]的方法并进行改进。取OPA 试剂600 μL 于1.5 mL 离心管中,加入酶解液80 μL,混匀,吸取200 μL 混合液于96 孔板中,在波长340 nm 处测量吸光度。按照上述同样方法制备丝氨酸的标准曲线,计算酶解液中游离氨基的浓度。水解度计算公式如下。
式中：H 为水解度,%；C 为水解液游离氨基浓度,mg/mL；N 为水解液氮含量,mg/mL。
1.2.6 体外抗氧化活性测定
1.2.6.1 骨肽对DPPH 自由基清除活性影响
参考Liu 等[20]的方法测定DPPH 自由基清除率。制备浓度分别为0、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/mL的骨肽溶液,分别取100 μL 骨肽溶液于96 孔板中,加入4.00 mg/mL 的DPPH 溶液 100 μL,避光振荡反应30 min 后,用酶标仪在波长为517 nm 处测量吸光度。以100 μL 无水乙醇替代DPPH 溶液作为调零管,以无水乙醇替代样品为空白管。以维生素C（vitamin C,VC）作为阳性对照。根据以下公式计算骨肽对DPPH自由基的清除能力。
式中：D 为DPPH 自由基清除率,%；A1 为骨肽样品管的吸光度；A2 为空白管的吸光度；A0 为调零管的吸光度。
1.2.6.2 骨肽对ABTS+·清除活性影响
参 考 Yadav 等[21] 的 方 法 并 进 行 改 进。 取7.00 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液,按照体积比1∶1 混合,在室温黑暗条件下放置15 h,产生ABTS+·,用去离子水将该混合溶液稀释50 倍。分 别 取20 μL 浓 度 为0、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/mL 的骨肽溶液于96 孔板中,分别加入ABTS混合溶液180 μL,避光振荡6 min 后,用酶标仪在734 nm 波长处测其吸光度。以VC 作为阳性对照,根据以下公式,计算骨肽对ABTS+·的清除能力。
式中：A 为ABTS+自由基清除率,%；A1 为骨肽样品的吸光度；A2 为无水乙醇替代ABTS 溶液的吸光度；A3为去离子水替代骨肽溶液的吸光度；A4 为去离子水替代骨肽溶液和ABTS 溶液的吸光度。
1.2.7 骨肽对胰脂肪酶抑制活性测定
参考Les 等[22]的方法加以改进,以PNPB 为底物,评估骨肽对胰脂肪酶的抑制作用。取一定量的PNPB 溶于DMSO,用去离子水稀释至终浓度为10.0 mmol/L。取50.0 mg 胰脂肪酶于10 mL Tris-HCl（50.0 mmol/L,pH7.4）缓冲液中,振荡5 min,3 000 r/min 离心5 min,取上清液得到浓度为5.00 mg/mL 的胰脂肪酶溶液。取50 μL 浓 度 分 别 为0、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/mL 的骨肽溶液于96 孔板中,加入5.00 mg/mL 胰脂肪酶溶液50 μL,在37 ℃下温育25 min,加入10.0 mmol/L 的PNPB 溶液100 μL,继续在37 ℃下孵育25 min,在405 nm 波长处测量吸光度,并以奥利司他作为阳性对照。根据以下公式计算骨肽的胰脂肪酶抑制率。
式中：P 为胰脂肪酶抑制率,%；A1 为骨肽样品的吸光度；A2 为缓冲液替代胰脂肪酶溶液的吸光度；A3 为缓冲液替代骨肽溶液的吸光度；A4 为缓冲液替代骨肽溶液和胰脂肪酶的吸光度。
1.3 数据处理
使用GraphPad Prism 9.0.0 软件绘制图表,采用IBM SPSS Statistics 21.0 软件进行方差分析（analysis of variance,ANOVA）。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 蛋白酶的筛选
不同酶作用于肽键有不同的酶切位点,使得不同酶对同一底物的水解程度也不同[23]。不同蛋白酶对水解度的影响如图1 所示。
图1 不同蛋白酶对水解度的影响
Fig.1 Effect of different proteases on degree of hydrolysis
由图1 可知,在相同的酶解条件下,相较于其他5 种蛋白酶,碱性蛋白酶表现出最高的水解度,达到了25.47%,这表明碱性蛋白酶能够有效地将骨粉中的蛋白质水解出来。故选择碱性蛋白酶作为后续条件优化的最适蛋白酶。
2.1.2 pH 值对酶解水解度的影响
pH 值是影响酶解效果的重要因素,不同酶有不同的适宜pH 值范围,低于或超出该范围会对酶的三级结构产生影响,进而影响水解效率[24]。对碱性蛋白酶的最适pH 值研究结果如图2 所示。
图2 pH 值对水解度的影响
Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis
由图2 可知,pH 值在8.5～10.5 时,骨肽水解液的水解度呈现先升高后降低的趋势,当pH 值为10.0 时,水解度达到35.14%,随后呈下降趋势。因此选择pH值为9.5、10.0、10.5 进行后续响应面试验。
2.1.3 温度对水解度的影响
温度对水解度的影响如图3 所示。
图3 温度对水解度的影响
Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis
由图3 可知,多肽水解度对温度的响应较为明显,随着温度升高,水解度呈现先升高后降低的趋势。温度在35～45 ℃时,水解度从27.18%提高到32.31%,变化速率较快。继续升高温度,水解度开始下降。由于不同酶有相应的最佳酶解温度,在一定范围内,温度升高有利于加快体系内分子的扩散运动,从35 ℃升至45 ℃,逐渐接近碱性蛋白酶的最适温度,水解度明显升高。超过45 ℃,酶活性受到抑制,酶的二级结构或三级结构遭到破坏,失去活性,不能再作为催化剂催化反应[25]。因此选用温度为40、45、45 ℃进行后续响应面试验。
2.1.4 酶解时间对水解度的影响
酶解时间对水解度的影响试验结果如图4 所示。
图4 酶解时间对水解度的影响
Fig.4 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis
由图4 可知,在酶解时间为3～5 h 时,骨肽水解度整体随酶解时间的延长而缓慢提高,酶解时间在5～6 h时,水解度从27.28%提高到最大值31.31%,变化速率较快。继续延长酶解时间,水解度开始下降,表明6 h已酶解充分。这可能是因为初始时底物含量较高,可以充分与酶反应,随着酶解时间的延长,多肽的生成量逐渐增加,底物逐渐消耗,酶与底物的反应达到饱和,从而使水解度下降[26]。因此酶解时间6 h 为最适酶解时间。
2.1.5 酶添加量对水解度的影响
酶添加量对骨肽水解度的影响如图5 所示。
图5 酶添加量对水解度的影响
Fig.5 Effect of enzyme amount on degree of hydrolysis
由图5 可知,随着酶添加量的增加,骨肽的水解度逐渐增大,当酶添加量为8% 时,水解度达到最大值29.91%,继续增大酶添加量反而使水解度降低,可能是因为随着酶解产物的增多,产物与酶形成复合物,降低了酶与底物的接触,使水解过程减慢[27]。因此选择酶添加量为6%、8%、10%进行后续响应面试验。
2.1.6 底物浓度对酶解水解度的影响
底物浓度对水解度的影响如图6 所示。
图6 底物浓度对水解度的影响
Fig.6 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis
由图6 可知,当底物浓度从4% 增加到10% 时,酶解液的水解度逐渐增大,底物浓度达到10% 时,水解度达到最大值33.05%,然后水解度开始逐渐趋于平稳。这可能是因为适宜的底物浓度可以更好地促使蛋白质与酶分子接触,从而提高酶解效率。然而,当底物浓度过高时,水解液的黏度增大,底物与蛋白酶的扩散速率降低,反应受到抑制,导致酶解效率下降[28]。因此选择底物浓度为8%、10%、12%进行后续响应面试验。
2.2 响应面优化试验结果
根据单因素试验结果进行响应面优化试验,并以水解度为指标,建立二次响应面回归模型,响应面试验结果见表4。
表4 响应面设计及结果
Table 4 Response surface design and results
序号1234567891 0 C 酶添加量/%10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A pH 值9.5 10.0 10.0 10.5 9.5 10.5 10.5 10.0 10.0 10.5 10.0 9.5 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.5 9.5 10.0 10.0 9.5 10.0 10.0 10.0 9.5 10.0 10.5 10.0 B 温度/℃45 45 45 50 45 45 45 45 45 40 50 45 45 45 50 45 45 45 40 40 40 50 50 50 45 45 40 45 40 86886868 8861 0881 088881 081 06886 1 08 D 底物浓度/%10 10 8 10 8 10 8 12 10 10 8 10 12 10 12 8 10 12 10 8 10 10 10 10 10 12 10 10 12水解度/%27.46 36.79 27.53 27.41 27.23 29.90 29.85 27.20 37.25 29.69 32.80 26.84 27.11 34.67 26.83 27.98 36.96 27.14 27.36 28.18 28.20 28.79 28.09 28.41 36.89 30.36 27.82 28.94 30.59
对表4 中的试验结果进行回归拟合方差分析,结果见表5。
表5 响应面二次模型方差分析
Table 5 Variance analysis of response surface quadratic model
注：*表示影响显著（P<0.05）。
来源模型A pH 值B 温度C 酶添加量D 底物浓度AB AC AD BC BD CD A²B²C²D²残差失拟项纯误差总和平方和311.37 1.99 0.02 0.000 5 1.57 3.44 0.624 1 8.53 0.122 5 17.56 0.072 9 105.83 85.91 144.85 94.19 14.79 10.43 4.36 326.16自由度14显著性*111111111111111 4 F 值21.05 1.89 0.018 9 0.000 5 1.49 3.26 0.590 8 8.07 0.116 16.62 0.069 100.19 81.33 137.12 89.16 P 值<0.000 1 0.191 2 0.892 5 0.982 4 0.2430 0.092 7 0.454 9 0.013 1 0.738 5 0.001 1 0.796 6<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1** ****10 4 28标准差22.24 1.99 0.02 0.000 5 1.57 3.44 0.624 1 8.53 0.122 5 17.56 0.072 9 105.83 85.91 144.85 94.19 1.06 1.04 1.09 0.957 3 0.568 3
通过对数据的回归分析,得二次多项式的回归模型方程为Y=36.51+0.407 5A+0.040 8B+0.006 7C-0.361 7D-0.927 5AB-0.395 0AC-1.46AD-0.175 0BC-2.09BD-0.135 0CD-4.04A2-3.64B2-4.73C2-3.81D2。
由表5 可知,回归模型显著（P<0.05）,失拟项不显著（P>0.05）,AD、BD、A2、B2、C2、D2 为显著模型。线性相关系数R2=0.954 7,R2Adj=0.909 3,模型拟合程度较好。
各因素两两交互作用的响应面图如图7 所示。
图7 各因素两两交互作用的响应面图
Fig.7 Response surface diagram of the pairwise interaction between various factors
由表5 和图7 可知,各因素对水解度的影响显著程度排序为pH 值>底物浓度>温度>酶添加量。根据响应面试验结果,最优的骨肽制备条件为pH10.343、温度44.834 ℃、酶添加量7.950%、底物浓度为9.661%、酶解时间 6 h,此条件下的水解度为35.02%。为了便于实际操作,在验证响应面试验结果时,将工艺条件修正为pH10.3、温度45 ℃、酶添加量8%、底物浓度10%、酶解时间6 h。以此条件进行验证试验,得出水解度为35.13%,相对误差为0.31%,与预测值接近,证明响应面试验结果的最优条件参数准确可靠。
2.3 骨肽体外活性分析
2.3.1 DPPH 自由基清除能力
不同骨肽浓度对DPPH 自由基的清除能力如图8所示。
图8 不同骨肽浓度对DPPH 自由基的清除能力
Fig.8 Scavenging ability of different bone peptide concentrations on DPPH free radicals
由图8 可知,随着骨肽浓度增加,骨肽对DPPH 自由基的清除能力逐渐增强,在浓度为0～5.00 mg/mL时,清除能力增加明显,超过5.00 mg/mL 后,清除能力增加变缓慢。经计算,藏羊骨肽清除DPPH 的IC50 值为（3.78±0.12） mg/mL,优于文献[29]羊骨多肽DPPH 自由基清除率的IC50 值（23.45 mg/mL）。当骨肽浓度为10.00 mg/mL 时,对DPPH 自由基的清除能力约为同等质量浓度VC 的74.4%,这表明骨肽具有一定的抗氧化效果。
2.3.2 ABTS+自由基清除能力
不同骨肽浓度对ABTS+自由基清除能力如图9所示。
图9 不同骨肽浓度对ABTS+自由基清除能力
Fig.9 Scavenging ability of different bone peptide concentrations on ABTS+ free radicals
由图9 可知,随着骨肽溶液浓度的增加,对ABTS+自由基的清除率逐渐提高。经计算,骨肽对ABTS+自由基清除率的IC50 值为（2.72±0.06） mg/mL,当浓度为10.00 mg/mL 时,对ABTS+自由基的清除能力可达到同等质量浓度VC 的89.9%,表明骨肽具有良好的抗氧化能力。
2.3.3 骨肽对胰脂肪酶的抑制能力
不同骨肽浓度对胰脂肪酶的抑制能力如图10所示。
图10 不同骨肽浓度对胰脂肪酶的抑制能力
Fig.10 Inhibitory ability of different bone peptide concentrations on pancreatic lipase
由图10 可知,骨肽对胰脂肪酶的抑制率随着浓度的增加逐渐增大。在2.50～10.00 mg/mL 浓度范围内抑制率增加明显,当浓度为10.00 mg/mL 时,对胰脂肪酶的抑制能力可达到同等质量浓度奥利司他的81.8%。经计算,骨肽对胰脂肪酶抑制率的IC50 值为（14.48±0.51） mg/mL,这表明骨肽具有较好的降血脂潜力。
3 结论
本研究以藏羊骨为原料,以水解度为评价指标,通过单因素试验和响应面试验,确定酶解制备藏羊骨肽的最适蛋白酶为碱性蛋白酶,最优工艺参数为酶解pH10.3、温度45 ℃、酶添加量8%、底物浓度10%和酶解时间6 h。在此工艺条件下,骨肽的水解度达到35.13%,展现了良好的骨肽制备效果。此外,初步验证了骨肽具有良好的抗氧化性和胰脂肪酶抑制作用,具备研发抗氧化、降血脂产品的潜力。本研究为提高藏羊屠宰副产物骨的综合利用价值、减少环境污染提供一定的参考,为羊骨资源的综合利用提供了新的思路。需要指出的是,本文仅对骨肽的体外抗氧化和降血脂活性进行了初步研究,后续将对骨肽进行分离和纯化,进一步探究其体内降血脂活性,并探讨相关活性机制。
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