汉麻籽作为营养品、纤维和生物活性化合物的重要来源,含有丰富的蛋白质（20%～25%）、油脂（30%以上）以及大量的维生素和矿物质[1]。此外,其蛋白质（主要是球蛋白和白蛋白）易于消化,能提供许多植物性蛋白所缺乏的必需氨基酸[2]。然而,汉麻蛋白的低水溶性限制其在食品行业中的应用。通过酶促水解获得的汉麻活性肽可改善多种疾病,如抗高血压、降胆固醇、抗血栓形成和抗糖尿病活性等[3]。前期研究中已经从汉麻蛋白中分离、鉴定出具有抗氧化[4]、抗癌[5]、降血脂[6]、降尿酸[7]等功能的多肽序列。研究发现,汉麻籽水解物和汉麻籽肽WVSPLAGRT、IGFLIIWV 可以减少脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激的BV-2 小胶质细胞[8]、原代人单核细胞[9]和人肝细胞系[10]中炎性细胞因子的表达,发挥抗炎作用。大量研究表明,海鲈鱼肽[11]、绿豆肽[12]等食物来源肽可以在LPS 刺激的巨噬细胞中做到“抑制过度免疫应答”,并在正常巨噬细胞中能够“提高免疫应答”,发挥了双向调节作用。迄今为止,关于汉麻籽活性肽刺激免疫系统、提高免疫力的研究鲜见。此外,与药物相比,食物来源的免疫调节肽还具有易吸收、免疫原性低且无毒的优势[13]。
近年来,免疫调节肽因具有促进免疫、预防感染和癌症等功能而受到国内外学者的广泛关注[12]。RAW264.7 细胞是固有免疫的重要组成部分,也是筛选食源免疫调节肽时广泛使用的细胞模型。适度调控巨噬细胞的激活对于提高机体对病原侵袭的防御能力、减少疾病的发生具有重要意义。在细胞外微环境、内分泌、外源物质和衰老的刺激下,巨噬细胞具有免疫防御、监视和调节等免疫功能,其发挥免疫功能的途径包括吞噬病原体、分泌炎症介质一氧化氮（nitric oxide,NO）和多种细胞因子,如白细胞介素-1β （interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素-6 （interleukin-6,IL-6）等间接杀死病原体[14]。从小麦胚芽球蛋白中分离出的短肽ECFSTA 通过增强RAW264.7 细胞的吞噬和促炎细胞因子的分泌而表现出免疫调节作用[15]。牛奶肽可以刺激巨噬细胞的活化、增殖和细胞因子的表达[16]。Xu等[17]从大米蛋白水解物中分离纯化出了具有免疫调节作用的六肽（YGIYPR）,在12.5～100.0 μg/mL 的范围内能够增强巨噬细胞RAW264.7 的增殖。
蛋白质水解产物的生物活性主要取决于肽序列的组成和长度,用不同酶处理则会导致肽的生物活性发生变化,且多数研究结果表明,小分子肽具有更强的生物活性。因此,本研究以脱脂汉麻粉为原料,采用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对汉麻蛋白进行酶解,旨在利用细胞模型探讨汉麻活性肽对RAW264.7 巨噬细胞的免疫调节作用,以期为具有预防和改善免疫抑制作用的汉麻活性肽功能食品的深入开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
汉麻籽蛋白脱脂粉：辽宁俏牌生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（1×105 U/g）、风味蛋白酶（5×104 U/g）：湖南夏盛酶技术有限公司；葡聚糖凝胶G-15、IL-1β 含量检测试剂盒、IL-6 含量检测试剂盒、TNF-α 含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；DMEM 培养基：美国赛默飞世尔科技有限公司；一氧化氮（NO）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；小鼠巨噬细胞系RAW264.7、青霉素-链霉素溶液（100X）、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）、中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞裂解液、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
酶标仪（Multiskan MK3）：上海雷勃生物技术有限公司；台式低速离心机（L0-LX-L40B）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；蛋白纯化仪（AKTA go）：思拓凡生物科技有限公司；倒置荧光显微镜（CKX41）：日本奥林巴斯公司；CO2 培养箱（ICO 105）：北京世贸远东科学仪器有限公司；恒温烘箱（DHG-9023A）：上海一恒科学仪器有限公司；紫外分析仪（JY02S）：北京君意东方设备有限公司；流式细胞仪（CytoFLEX）：美国贝克曼库尔特有限公司；水套式CO2 培养箱（Forma Series II 系列）、高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography,HPLC）（Easy-nLC1200）：美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 汉麻活性肽的制备
取50 g 汉麻籽蛋白脱脂粉（蛋白含量74.52%）溶解于800 mL 蒸馏水,将温度调至55 ℃,依次加入0.25 g 木瓜蛋白酶和0.25 g 风味蛋白酶。在酶解过程中,前30 min,每10 min 调节一次pH 值,随后每20 min 调节一次pH 值,使其保持在6.3。酶解5 h 后于95 ℃水浴10 min,冷却至室温,10 000 r/min、4 ℃离心15 min,收集上清液。经1 kDa 滤膜超滤后冻干,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,超纯水稀释至100 mg/mL,采用蛋白纯化仪以葡聚糖凝胶G-15（16 mm×1 000 mm）柱分离,上样量5 mL,1.2 mL/min 超纯水洗脱,每管7.5 mL,共收集50 管。根据280 nm 处吸光度,合并相似馏分并分别命名为F1、F2、F3,冻干后用于进一步分析。
1.3.2 汉麻活性肽序列鉴定
委托上海中科新生命生物科技有限公司对多肽进行序列鉴定。数据非依赖采集技术（data independent acquisition,DIA）分析采用纳升流速高效液相色谱仪进行色谱分离。纳升级高效液相色谱分离后的多肽样品用质谱仪进行DIA 质谱分析。检测模式：正离子,一级质谱扫描范围m/z：200～3 000,质谱分辨率：120 000。dd-MS²采用DIA 数据采集模式,设置44 个DIA 采集窗口,质谱分辨率30 000。DIA 数据采用Spectronaut软件进行数据处理,数据库与建库所用数据库相同。
1.3.3 RAW264.7 巨噬细胞培养
小鼠巨噬细胞系RAW264.7 于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM 培养基中生长,细胞培养瓶置于5% CO2、37 ℃培养箱中。当细胞覆盖培养瓶底部的80%时传代,培养至对数生长期的细胞用于后续试验。
1.3.4 CCK-8 细胞增殖试验
将RAW264.7 细胞接种于96 孔培养板中,细胞浓度约为1×104 个/mL,每孔200 μL,5% CO2、37 ℃孵育24 h,分别加入浓度为100、250、1 000 μg/mL 的汉麻活性肽,同时设置空白对照组,每组设置3 个复孔。处理24 h 后,每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液,细胞培养箱中孵育1 h 后,酶标仪测定450 nm 处OD 值。
1.3.5 倒置荧光显微镜观察细胞形态
将RAW264.7 细胞接种于6 孔板中,细胞浓度约为1×104 个/mL,37 ℃、5% CO2 培养12 h 后,分别加入浓度为100、250、1 000 μg/mL 的汉麻活性肽,1 μg/mL的LPS 作为阳性对照,同时设置空白对照组,每组设置3 个复孔。处理36 h 后,倒置荧光显微镜观察并拍照。
1.3.6 中性红法检测细胞吞噬能力
将RAW264.7 细胞接种于96 孔板,细胞浓度约为1×104 个/mL,每孔200 μL,培养箱中孵育12 h 后,分别加入浓度为100、250、1 000 μg/mL 的汉麻活性肽,同时设置1 μg/mL 的LPS 为阳性对照组和空白对照组,每组3 个复孔。处理36 h 后,按试剂盒说明书测定样品的A540 nm。
1.3.7 汉麻活性肽对RAW264.7 细胞NO、IL-1β、IL-6和TNF-α 分泌量的影响
细胞分组及处理同1.3.4,每组设置9 个复孔。处理36 h 后,按各自试剂盒方法分别测定上清液中NO水平和细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的分泌量。
1.3.8 汉麻活性肽对RAW264.7 细胞周期的影响
将RAW264.7 细胞接种于T25 培养瓶中,细胞浓度约为1×104 个/mL,每瓶2 mL,37 ℃、5% CO2 培养箱孵育12 h,分别加入浓度为100、250、1 000 μg/mL 的汉麻活性肽,同时设置1 μg/mL 的LPS 阳性对照和组空白对照组,每组3 个平行。处理36 h 后,磷酸缓冲盐 溶 液（phosphate buffered saline,PBS）洗 涤2 次,1 000 r/min 离心3 min,沉淀细胞。加入约1 mL 冰浴预冷的70%乙醇,轻轻吹打均匀,4 ℃固定2 h；1 000 r/min离心3 min,1 mL 预冷的PBS 重悬细胞,1 000 r/min 离心3 min 后弃上清。每管细胞样品中加入10 μL RNase A 溶液,37 ℃水浴30 min,500 μL 碘化丙啶染液（20×）,4 ℃避光孵育30 min,上流式细胞仪检测。
1.4 数据处理与分析
采用SPSS 26.0 软件进行方差分析,结果以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 汉麻籽促RAW264.7 细胞增殖活性多肽的纯化
汉麻活性肽对RAW264.7 细胞活力的影响如图1、图2 所示。
图1 汉麻籽促RAW264.7 细胞增殖活性多肽的Sephadex G-15凝胶纯化结果
Fig.1 Purification of bioactive peptides from hemp seeds that can promote RAW264.7 cell proliferation by Sephadex G-15 gel
F1、F2 和F3 为汉麻仁活性肽根据280 nm 吸光度分馏得到的相似组分。
图2 馏分F1～F3 对RAW264.7 细胞增殖情况（n=3）
Fig.2 Effects of F1-F3 on the proliferation of RAW264.7 cells （n=3）
与空白对照组（CK）比较,*表示差异显著（p<0.05）,**表示差异极显著（p<0.01）。
由图1 和图2 可知,采用复合酶法制备的汉麻活性肽经超滤后,对分子量小于1 kDa 的多肽进一步经Sephadex G-15 凝胶柱分离得到F1～F3。其中,F1 和F3 在高浓度时对巨噬细胞活力均有一定刺激作用,且F1 促进细胞增殖效果更为显著（p<0.01）。与空白对照组相比,100、250、1 000 μg/mL 的汉麻活性肽F1 对RAW264.7细胞的OD450 nm 由原来的0.574 增加至0.647、0.768 和0.969,相对增殖率分别为12.72%、33.80% 和68.82%。因此,选择F1 作为候选活性肽进行后续研究。
纳升流速高效液相色谱质谱对F1 的多肽序列进行分析,共鉴定出9 条相对含量大于1% 的多肽,分 别 为DGDGSGFF、MPEDVIAN、SYNNGDQQ、DGDQPLVT、WSYNNG、SYNNGDQQL、ADWVYN、NNGDSPLVL、DWVYNNG,分子量在740～1 038 Da。
2.2 汉麻活性肽对RAW264.7 细胞形态的影响
F1 对细胞形态的影响见图3。
图3 F1 对细胞形态的影响（400×）
Fig.3 Effect of F1 on cell morphology （400×）
由图3 可知,空白对照组（CK）和100 μg/mL 的F1组细胞数量较少,形态呈圆形。与刁静静等[12]研究青蛤酶解多肽作用后巨噬细胞长出较多伪足的结果相似。经250、1 000 μg/mL 的F1 和1 μg/mL 的LPS 处理后,RAW264.7 细胞数量明显增多,且随着F1 的浓度增大,巨噬细胞因刺激分化形成伪足的细胞比例也明显增大。F1 在浓度为1 000 μg/mL 时,RAW264.7细胞的数量与LPS 组相当。这些变化提示汉麻活性肽能促进RAW264.7 细胞增殖及分化。
2.3 汉麻活性肽对RAW264.7 细胞吞噬能力的影响
F1 对细胞中性红吞噬指数的影响见图4。
图4 F1 对细胞中性红吞噬指数的影响（n=3）
Fig.4 Effect of F1 on the phagocytic index of neutrophils （n=3）
与空白对照组（CK）比较,***表示差异高度显著（p<0.001）。
巨噬细胞对中性红的吞噬能力,一定程度上反映了巨噬细胞的活力。由图4 可知,与空白对照组比较,F1 以剂量依赖的方式增强RAW264.7 巨噬细胞对中性红的吞噬能力。100、250、1 000 μg/mL 多肽处理RAW264.7 细胞后,细胞吞噬指数分别提高39%、76%和133%（p<0.001）,但与LPS 单独作用的细胞相比仍具有明显差异。王健等[18]研究发现毛酸浆果提取物也可以使巨噬细胞吞噬能力增强。吞噬作用是细胞抵抗病原体及体内衰老、畸变细胞并提高机体抗感染能力的重要手段,可提高宿主对微生物感染的先天性免疫应答。本研究通过中性红吞噬法,检测F1 对RAW264.7 细胞吞噬功能的影响,得出相似结果,表明汉麻活性肽可以有效激活并增强RAW264.7 巨噬细胞的吞噬作用。
2.4 汉麻活性肽对RAW264.7 细胞NO、IL-1β、IL-6和TNF-α 分泌量的影响
F1 对RAW264.7 细胞NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α分泌量的影响见图5～图8。
图5 F1 对NO 分泌量的影响（n=9）
Fig.5 Effect of F1 on NO secretion （n=9）
本研究采用Griess 试剂法测定细胞培养上清液中的NO 含量,如图5 所示,100～1 000 μg/mL 浓度的F1 作用于巨噬细胞RAW264.7 后,NO 的释放水平具有浓度依赖性,并高于空白对照组,但弱于LPS 组,其结果与中性红吞噬结果趋势一致。当F1 浓度为1 000 μg/mL时,巨噬细胞的NO 分泌量达到最大（38.05 μmol/mL）。NO 是由巨噬细胞分泌的重要分子,其参与调节生理或病理过程,包括免疫防御和组织修复。王亚非等[19]研究发现,食源性蛋白肽可增强巨噬细胞的NO 释放,用不同质量浓度鹰嘴豆多肽作用巨噬细胞后,NO 释放量与多肽的浓度存在剂量效应关系,且多肽浓度为400 μg/mL 时,生成的NO 水平与LPS 阳性对照组无显著差异（p>0.05）。
在非炎性细胞模型中,巨噬细胞被激活后释放适量的细胞因子参与细胞间相互作用,传导并激活其它免疫细胞,其中TNF-α、IL-1β 和IL-6 可辅助清除外源性抗原和异常细胞,并与T 细胞协同调节机体免疫应答[20]。由图6、图7 可知,F1 的加入以剂量依赖性的方式增加IL-1β 和IL-6 分泌,在1 000 μg/mL 时的释放量分别为538.03、925.99 pg/mL,但低于LPS 组。由图8 可知,LPS 组TNF-α 分泌量高于空白对照组和100、250 μg/mL 的F1 组,而当F1 的浓度为1 000 μg/mL 时,培养液上清中的TNF-α 分泌量达到1 226.75 pg/mL,甚至超过了LPS 组的1 169.27 pg/mL。Lee 等[21]研究结果表明鸡蛋卵黄高磷蛋白在没有LPS 刺激的情况下,激活RAW264.7 细胞并增加IL-1β、TNF-α 细胞因子mRNA 的表达,显著改善巨噬细胞的免疫功能。本试验研究得到了类似的结果,汉麻活性肽能提高RAW264.7 细胞中NO 和细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平,介导宿主巨噬细胞的免疫增强功能。
图6 F1 对IL-1β 分泌量的影响（n=9）
Fig.6 Effect of F1 on IL-1β secretion （n=9）
图7 F1 对IL-6 分泌量的影响（n=9）
Fig.7 Effect of F1 on IL-6 secretion （n=9）
图8 F1 对TNF-α 分泌量的影响（n=9）
Fig.8 Effect of F1 on TNF-α secretion （n=9）
2.5 汉麻活性肽对RAW264.7 细胞周期的影响
汉麻活性肽对RAW264.7 细胞周期的影响见图9和表1。
表1 汉麻活性肽对细胞周期的影响（n=3）
Table 1 Effect of bioactive peptides from hemp seeds on cell cycle（n=3）
注：与空白对照组（CK）比较,**表示差异极显著（p<0.01）。
29.20±6.90 9.79±0.38 13.70±2.80 20.30±1.81 15.50±1.01 CK LPS F1 1 100 250 1 000 41.40±1.61 68.30±0.36**51.50±0.94**58.90±0.93**64.90±0.49**29.40±7.15 21.90±0.61 34.70±3.59 20.80±1.52 19.60±0.96
图9 RAW264.7 细胞周期的变化
Fig.9 Changes in cell cycle of RAW264.7 macrophages
a. 空白对照组（CK）；b. LPS 浓度1 μg/mL；c～e. F1 浓度分别为100、250、1 000 μg/mL。G0/G1 期为合成前期；G2/M 期为DNA 合成后期/有丝分裂期；S 期为DNA 合成期。
细胞的增殖与细胞周期密切相关,由图9 和表1可知,LPS 和F1 各剂量组作用于RAW264.7 细胞36 h后G0/G1 期细胞数占总细胞数的百分比增加。与空白对照组相比,经100、250、1 000 μg/mL 浓度的F1 处理后处于G0/G1 期的细胞比例分别上升24.39%、42.30%和56.76%（p<0.01）。处于S 期及G2/M 期的细胞在总细胞数中的占比有所下降,但差异无统计学意义（p>0.05）。
3 讨论与结论
酶解是获得生物活性肽和提高蛋白质价值的可持续途径。Rodriguez-Martin 等[22]使用碱性蛋白酶等对汉麻籽进行水解,获得汉麻蛋白水解物,其可以降低LPS 刺激的BV-2 小胶质细胞中炎性细胞因子（如TNFα、IL-6 和IL-1β）的mRNA 表达,并增加抗炎细胞因子（如IL-10）的mRNA 表达。在LPS 激活的原代人单核细胞中,汉麻蛋白质水解物可使巨噬细胞由表型M1向表型M2 转化[9]。汉麻籽肽WVSPLAGRT 和IGFLIIWV 在LPS 刺激的HepG2 中发挥抗炎活性,减少促炎性细胞因子（TNF 和IL-6）的产生,并增加抗炎性因子IL-10 的产生[10],说明汉麻蛋白质酶解物具有抗炎活性。鉴于大量植物源蛋白多肽具有双向免疫调控作用,然而在非LPS 刺激情况下,汉麻蛋白多肽是否具有免疫增强活性鲜见系统研究。本研究以汉麻籽蛋白为原料、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶水解并超滤后获得的分子量小于1 kDa 的汉麻活性肽对RAW264.7 细胞的免疫刺激作用进行评价,通过一系列试验证明100～1 000 μg/mL 的F1 可以提高RAW264.7 细胞的增殖和吞噬作用,但不会刺激巨噬细胞过度吞噬。类似的研究也发现,采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对金枪鱼头肉进行水解,分离纯化后的溶液显著提高了巨噬细胞的活性和吞噬功能[23]。与吞噬作用增强的结果一致,LPS 和汉麻活性肽极大促进了巨噬细胞NO 的释放,同时刺激TNF-α、IL-1β、IL-6 等多种细胞因子的分泌,进一步说明汉麻活性肽具有较强的免疫增强作用。其中,TNF-α 可以杀死肿瘤细胞并诱导iNOS 转录和释放大量NO,IL-1β 能促进B 细胞产生抗体,而IL-6 是抑制Th1 型免疫应答和介导Th2 型免疫应答的关键性细胞因子[24]。汉麻活性肽诱导的巨噬细胞主要在G0/G1 期发生增殖,这也是RNA 和蛋白质的合成期。由于相关蛋白的表达增加,其吞噬、NO 及细胞因子的分泌能力也得到了相应的增强[25]。
综上所述,汉麻活性肽具有激活巨噬细胞的作用,并能够在细胞水平上发挥潜在的免疫增强活性。本研究为汉麻活性肽作为免疫调节类功能食品的高值化利用提供了理论依据。
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